專利名稱：彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR Vβ13亞家族的RG基因序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)T細(xì)胞受體(TCR)的核苷酸序列，特別是指一種彌漫性 大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBL)相關(guān)抗原特異TCR V(3 13亞家族的RG基因序列及 應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)。據(jù)估計(jì)，21 世紀(jì)初，NHL將占侵襲性惡性腫瘤的4.4。/。，并占所有癌癥死亡數(shù)的4.8%。其 中彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBL)是最常見(jiàn)的NHL，約占30% 40%，其 中超過(guò)60歲的老年患者占70%。20多年來(lái)主要采用以CHOP方案(環(huán)磷酰胺、 多柔比星、長(zhǎng)春新堿、潑尼松)為主的化療。但對(duì)部分老人有毒性作用，長(zhǎng)期 生存率低。近期開(kāi)展的靶向免疫治療如利妥昔單抗(CD20單抗)的出現(xiàn)雖然 取得了新的療效，但微小殘留病變的存在導(dǎo)致的疾病復(fù)發(fā)仍然是目前臨床治療 的棘手問(wèn)題。多年來(lái)，各國(guó)學(xué)者一直在努力尋求更有效的治療方法。臨床腫瘤 學(xué)家對(duì)特異性的細(xì)胞免疫治療寄予厚望。Xue等于報(bào)道利用從白血病患分離出 能夠特異識(shí)別HLA-A2限制的WT1抗原表位的CTL，將CTL的TCR基因轉(zhuǎn) 染患者的T淋巴細(xì)胞，在小鼠試驗(yàn)中顯示出轉(zhuǎn)染細(xì)胞的特異殺傷性。隨后Tsuji 等將從進(jìn)一步證明了利用轉(zhuǎn)導(dǎo)WT1特異的TCR基因的Thl和Tcl顯示出HLA 限制的的殺傷作用，同時(shí)轉(zhuǎn)染的Thl細(xì)胞具有分泌大量IFN-Y和IL-2的功能， 由于IFN-Y和IL-2在遏制腫瘤中發(fā)揮重要的作用，因而可以通過(guò)該轉(zhuǎn)染相應(yīng) 的TCR基因的方法對(duì)腫瘤的免疫治療發(fā)揮重要的作用。目前利用腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原特異的TCR基因修飾正常T細(xì)胞(自體的或 供者源T細(xì)胞)，從而獲得具有殺傷相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)， 這是近年抗腫瘤特異性細(xì)胞免疫治療的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)。抗原特異TCR修飾正 常T細(xì)胞而獲得特異抗腫瘤T細(xì)胞克隆的研究首先在黑色素瘤中展開(kāi)，隨后 有多個(gè)研究擴(kuò)展了該技術(shù)的應(yīng)用，如特異性抗EB病毒陽(yáng)性細(xì)胞的CTL、抗 WT1的CTL，個(gè)別己形成了 TCL產(chǎn)品用于臨床治療。制備CTL產(chǎn)品的關(guān)鍵是明確腫瘤/白血病細(xì)胞的相關(guān)抗原，從而獲得抗原特異的TCR，進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn) 生特異抗白血病/腫瘤的T細(xì)胞克隆。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)淋巴瘤的研究主要集中在T細(xì)胞型淋巴瘤，而對(duì)B淋巴細(xì)胞淋巴瘤的研究資料較少，主要原因可能是對(duì) B淋巴細(xì)胞型淋巴瘤的相關(guān)抗原了解得較少有關(guān)。發(fā)明內(nèi)容為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR V卩13亞家族的RG基因序列。本發(fā)明從DLBL患者外周血中存在T細(xì)胞受體(TCR) Vp亞家族的克隆 性T細(xì)胞，經(jīng)序列分析顯示其特異性TCR序列的高度可變區(qū)V-NDN-J區(qū)，即 互補(bǔ)決定區(qū)3 (CDR3)，與抗原特異性識(shí)別結(jié)合的部位，表明該克隆性T細(xì)胞 所表達(dá)的TCR為DLBL相關(guān)抗原刺激所產(chǎn)生的特異性TCR，獲得了 DLBL相 關(guān)的TCR基因序列。本發(fā)明公開(kāi)了針對(duì)DLBL相關(guān)抗原的特異性TCR的基因序列，尤其是 TCR的高度可變區(qū)即CDR3，后者是T細(xì)胞表面受體識(shí)別抗原的特異區(qū)域， 針對(duì)于不同抗原，除了機(jī)體所選用的TCRV(3亞家族T細(xì)胞不同，更為關(guān)鍵的 是其TCR基因的CDR3序列的差異，該部位決定了所屬T細(xì)胞所能識(shí)別的抗 原。本發(fā)明提供了一種識(shí)別DLBL相關(guān)抗原的TCR邪13基因序列，由于其 CDR3的特異性，僅來(lái)自于單一克隆的T細(xì)胞，是一高度特異的序列。同時(shí)， 根據(jù)CDR3的基因序列編碼的蛋白質(zhì)，可用來(lái)了解DLBL的相關(guān)抗原肽，為 了解DLBL的生物學(xué)特性提供資料。本發(fā)明的另一目的在于提供上述基因序列的應(yīng)用。根據(jù)所獲得的DLBL相關(guān)抗原的特異性TCR的核苷酸序列，可以用于(1) 了解DLBL病人所存在的抗DLBL的TCR V(313亞家族T細(xì)胞的情況，用于 評(píng)價(jià)病人的免疫功能狀態(tài)，(2)通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將DLBL相關(guān)抗原的特異性 TCR基因轉(zhuǎn)入正常T淋巴細(xì)胞中，使其強(qiáng)制表達(dá)這種特異性的TCR，改變T 細(xì)胞內(nèi)源性TCR識(shí)別抗原的原有模式，具備分泌細(xì)胞因子和(或)特異殺傷 靶細(xì)胞的功能，經(jīng)體外短期培養(yǎng)擴(kuò)增即可產(chǎn)生足量的CTL，再回輸入患者體 內(nèi)使其對(duì)DLBL細(xì)胞行使靶向細(xì)胞免疫效應(yīng)。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn) 一種彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤 (DLBL)相關(guān)抗原特異TCRV卩13亞家族的RG基因序列，所述基因序列如下所示:AGGTGC AC AGTGGGGTC AGC AC A 。其中，RG基因序列為414個(gè)bp: l-180bp為V區(qū)；181-192bp為NDN區(qū)，其 中184-187bp為D區(qū)；193-241bp為J區(qū)；242-414bp為C區(qū)。上述彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBL)相關(guān)抗原特異TCR V(3 13亞家族的 RG基因序列翻譯的蛋白質(zhì)(138AA)如下QKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVST。注CDR3區(qū)包括V區(qū)的下游端、NDN區(qū)和J區(qū)的上游端。上述彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBL)相關(guān)抗原特異TCR VP 13亞家族的 RG基因序列的制備方法，包括如下步驟a. 收集DLBL患者外周血，F(xiàn)icoll分層法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞；b. 提取外周血單個(gè)核細(xì)胞的RNA， RT-PCR合成cDNA第一鏈；c. 在NCBI的Genebank中査找TCR (3鏈的基因序列，并標(biāo)出各亞家族的 V區(qū)及C區(qū)在基因組中的位置；d. 設(shè)計(jì)24個(gè)V(3特異性上游引物及Q3下游引物；e. PCR擴(kuò)增24個(gè)V卩亞家族TCR重排時(shí)產(chǎn)生的V-NDN-JC區(qū)；f. C(3-Fam標(biāo)記PCR產(chǎn)物，基因掃描分析T細(xì)胞亞家族的表達(dá)和克隆性；g. 將呈單克隆或寡克隆掃描圖的亞家族PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化序列分析。上述彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR V(3 13亞家族的RG基因 序列在制備彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤特異性分子靶向過(guò)繼性免疫藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果(1) 本發(fā)明制備得到了一種獨(dú)特的DLBL抗原的相關(guān)TCR VP13基因序 列，該序列可以作為一種新的抗原識(shí)別TCR基因(主要變化區(qū)在于CDR3序 列)補(bǔ)充人類基因庫(kù)資料。(2) 該TCR基因可用于研究DLBL的特異性免疫診斷和治療。 上述彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR VP13亞家族的基因序列后， 一方面可用于進(jìn)一步檢測(cè)病人體內(nèi)所存在的TCR VP13亞家族T細(xì)胞的情 況，以評(píng)價(jià)其細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，另一方面是應(yīng)用在制備DLBL細(xì)胞分子耙 向過(guò)繼性免疫細(xì)胞治療研究方面。前者的檢測(cè)所采用技術(shù)與上述檢測(cè)TCR基因的技術(shù)相同，通過(guò)不同時(shí)間 點(diǎn)的分析，可以了解病人所存在的TCRV(313亞家族T細(xì)胞的情況，用于了解 病人的免疫狀態(tài)。后者主要通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將DLBL相關(guān)抗原特異的TCR基因修飾自體或 異基因正常T細(xì)胞，這些經(jīng)過(guò)修飾的細(xì)胞就可提供對(duì)抗確定的腫瘤特異性抗 原的T細(xì)胞反應(yīng)性，從而具備了發(fā)揮相應(yīng)特異性識(shí)別殺傷DLBL的細(xì)胞毒活 性，可以制備特異性抗DLBL細(xì)胞的CTL產(chǎn)品。國(guó)外有相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 提示這類技術(shù)有可能發(fā)揮特異性的免疫治療效果。本發(fā)明所提供的TCR基因 的應(yīng)用最終目的是通過(guò)對(duì)DLBL患者進(jìn)行特異性免疫治療，從而提高療效， 清除微小殘留病變，減少疾病治療后復(fù)發(fā)提高長(zhǎng)期生存率，改善病人的生存質(zhì) 量等，是具有很大的市場(chǎng)推廣應(yīng)用價(jià)值和和較大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。


圖1為DLBL相關(guān)抗原特異TCR V卩13亞家族的基因掃描圖。 其中，A為TCRV(313亞家族單克隆圖；B為TCRVP13亞家族雙克隆圖； C為TCR V(313亞家族多克隆圖；D為TCR VP13亞家族寡克隆圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方 式不限于此。(一)抗原特異性TCR基因序列的分析分析TCR V(3基因譜的CDR3的長(zhǎng)度和堿基序列的方法是利用RT-PCR— 基因掃描方法分析TCR V卩24個(gè)亞家族的CDR3長(zhǎng)度。首先收集DLBL患者 外周血，F(xiàn)icoll分層法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，留取Pl(f個(gè)PBMCs (外周血 單個(gè)核細(xì)胞)提取RNA， RT-PCR合成cDNA。同時(shí)，在NCBI的基因庫(kù)中査 找出TCRP鏈的基因序列，并標(biāo)出各亞家族的V區(qū)及C區(qū)在基因組中的位置。 根據(jù)V(324個(gè)亞家族基因的cDNA設(shè)計(jì)相應(yīng)的24個(gè)V卩特異性上游引物，并 在C卩區(qū)設(shè)一 C(3下游引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增患者24個(gè)V卩亞家族TCR重 排時(shí)產(chǎn)生的V-NDN-JC區(qū)。如圖l所示，熒光素Fam標(biāo)記各亞家族PCR產(chǎn)物 的CP區(qū)，基因掃描分析T細(xì)胞各亞家族的表達(dá)，根據(jù)不同位置，高度和形態(tài) 的峰，表示產(chǎn)物的大小、量和均一性，從而確定T細(xì)胞克隆性(一般情況下， 正常轉(zhuǎn)錄的每個(gè)V|3亞家族包含8 10個(gè)峰，即8 10個(gè)不同克隆的T細(xì)胞； 主峰的出現(xiàn)表明相同大小cDNA的過(guò)度擴(kuò)增，單峰表明產(chǎn)物中DNA片斷大小 相同，均存在寡克隆或單克隆T細(xì)胞群，三者分別提示產(chǎn)物來(lái)自多克隆、寡 克隆和單克隆的T細(xì)胞)。基因掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者的VP13亞家族T細(xì)胞呈明 顯單克?。粚P13亞家族的PCR產(chǎn)物切膠純化，序列分析發(fā)現(xiàn)了 V(313亞家 族TCR的基因序列及其CDR3區(qū)(V-NDN-J區(qū))，即為與淋巴瘤相關(guān)抗原特 異性結(jié)合的部位。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBL)相關(guān)抗原特異TCRV卩13亞家族的RG 基因序列的制備方法1、 分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(1) 取淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll，密度1.077) 4mL加入離心管內(nèi)，將稀 釋后的抗凝外周血標(biāo)本混懸液平鋪于分離液之上，以水平離心機(jī)，2000 rpm， 離心15 min。(2) 吸取中間單個(gè)核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，再加入5mL 1640液， 輕輕吹打，以1500rpm，離心洗滌10min，棄上清，加入1640液至2mL，混 勻后計(jì)數(shù)，并用同樣的方法洗滌兩次，按2xl0VmL調(diào)整細(xì)胞濃度備用。2、 RNA提取(TRIzol試劑盒方法提取法)(1)將已加入TRIzol試劑一2(TC凍存的細(xì)胞取出，置冰上解凍，混勻后 加入0.2mL氯仿，充分混勻，4°C， 14000 rpm離心30 min。(2) 吸取上層液至另一離心管，加入0.5 mL異丙醇并混勻，室溫靜置 10 min后4°C ， 14000 rpm離心30 min。(3) 去上清，并用1 mL75X乙醇(一20。C)洗兩次(2 8。C， 14000 rpm)， 每次混勻30秒后，離心10 min。(4) 去上清，再離心2 3min，去除剩余的乙醇，置于超凈臺(tái)上自然干 燥l 1.5h。加入超凈水(20 50)iL)溶解。(5) 于紫外線分光光度儀中檢測(cè)樣品的純度和含量，0.8%瓊脂糖凝膠電 泳檢測(cè)RNA的完整性和質(zhì)量。(6) RNA保存RNA樣品加入其O.l倍容積的3mol/LNaAC (醋酸鈉) 和2倍容積的乙醇后，保存于一8(TC備用。3、 cDNA合成(1 )應(yīng)用六聚體隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA第一鏈。1嗎RNA 加入16.5iiL預(yù)先配制的混合液其中包括7pLH20、 2 nL10xPCR-Buffer、 2jiL 0.1 mmol/L DTT、 5 ;iL 2.5 mmol/L dNTP和0.5 fiL Rand.Hexmer。(2) 于73。C3分鐘后，置于冰中30sec。低溫高速離心30 sec后置于冰 中2 3 min。(3) 加入0.6pLRnasin (33U/)iL)和0.5)iL Superscript (200U/jxL)后， 低溫高速離心30 sec。(4) 室溫靜置10min; 42°C， 40min以上；S3。C， 5 min， —20。C保存?zhèn)溆谩?、 cDNA合成質(zhì)量檢測(cè)將所有樣本的cDNA經(jīng)PCR檢測(cè)(32M基因(引物序列見(jiàn)表l)而確定其 合成質(zhì)量?？偡磻?yīng)體系20)iL，其中上下游引物0.5jimol/L， dNTP 0.1 mmol/L， Taq聚合酶1.0U， MgCL2 1.5 mmol/L， 10xPCR緩沖液2pL， cDNA產(chǎn)物l^L 和dH20，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。在德國(guó)BiometraPCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件94。C 1 min(首次3min)， 58°C 1 min， 72°C 1 min(末次6 min)， 共35個(gè)循環(huán)，最后保存于4r中。取8pLPCR產(chǎn)物以1.5% (w/v)瓊脂糖凝 膠進(jìn)行電泳，(32M陽(yáng)性者可進(jìn)一步研究，陰性者視為無(wú)cDNA合成，棄去不用。5、 PCR擴(kuò)增TCRVp24個(gè)亞家族以24個(gè)TCR V(3亞家族基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性上游引物，并在Q3區(qū)設(shè) 計(jì)一下游引物(引物序列見(jiàn)表l)。 PCR按常規(guī)方法進(jìn)行?？偡磻?yīng)體系20iaL， 其中含任一V卩引物(24個(gè)V卩亞家族之一)禾[!C卩弓l物0.5imiol/L，余同上。反應(yīng)條件94°C、 lmin (首次3min)， 60°C、 lmin和72。C、 1 min (末 次6min)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后PCR產(chǎn)物保存于4"C中。取8pLPCR產(chǎn) 物電泳分析結(jié)果。6、 T細(xì)胞克隆性分析(1) 標(biāo)記PCR產(chǎn)物10pL的反應(yīng)體系含2.5pL未標(biāo)記的PCR產(chǎn)物、0.15 (imol/L C(3-fam引物、 1.5 mmol/LMgCl2， 0.1 mmol/L dNTP， 0.75UTaq聚合酶，1(xL10xPCR緩沖 液和dH20。 PCR共進(jìn)行35循環(huán)，每一循環(huán)包括94°C、 1 min (首次3 min)， 66°C、 1min和72。C、 1 min (末次6min)，最后PCR產(chǎn)物保存于4°C中。(2) 基因掃描樣品配制熒光素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物(2pL)加入高質(zhì)量的去離子甲酰胺(Hi-Di Formamide)與Genescan-500 LIZ分子量標(biāo)準(zhǔn)品按20 : 1比例配好的10 juL混合液中。(3) 基因掃描(按操作指南進(jìn)行)O按操作指南準(zhǔn)備好儀器并更換水和緩沖液。2)灌膠灌膠前2 h從4。C冰箱取出POP-4 (Performance Optimized Polymer-4)膠回溫1 2 h，把膠液抽進(jìn)貯膠5 mL針筒中(抽取的數(shù)量約為 0.5+0.07 x做樣次數(shù))，倒置排出針筒內(nèi)氣泡，裝緊針筒。3 )上樣將備好的樣品于94。C變性4 min，然后立即放置冰上冷卻2 min。 變性后的樣品加入96孔板，直接裝載到3100遺傳分析儀進(jìn)行電泳。4) 運(yùn)行自動(dòng)進(jìn)樣器會(huì)自動(dòng)把樣品板移到要分析的4個(gè)樣品的位置，電 泳過(guò)程中CCD檢測(cè)器把熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并把它傳送給安裝了 3100數(shù)據(jù) 采集軟件的計(jì)算機(jī)工作站。5) 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理完成后就存貯在計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)庫(kù)里并以電泳信號(hào) 圖的形式顯示出來(lái)。電泳信號(hào)圖的X軸表示時(shí)間，Y軸表示相對(duì)熒光強(qiáng)度， 每個(gè)圖中同時(shí)畫出幾種用于標(biāo)記DNA片斷的熒光素信號(hào)，電泳信號(hào)圖中的每 個(gè)峰代表一個(gè)DNA片斷。完成處理的數(shù)據(jù)被自動(dòng)地從數(shù)據(jù)庫(kù)中提取并進(jìn)行分 析。6)結(jié)果分析打開(kāi)GeneMapper SoftwareTM v3.5，將保存于計(jì)算機(jī)硬盤 數(shù)據(jù)庫(kù)中的原始數(shù)據(jù)加進(jìn)分析軟件，分析產(chǎn)物的長(zhǎng)度和熒光素強(qiáng)度。 7、核苷酸序列分析(1) E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物1) 切膠將PCR產(chǎn)物全部加入l 2。/。的瓊脂糖凝膠的加樣孔，當(dāng)電泳至 足以分離目的DNA時(shí)，于紫外燈下用干凈的手術(shù)刀切下含有目的條帶的瓊脂 糖凝膠塊，切下的凝膠塊置于1.5 mL離心管中。2) 按E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化，先加入500 Binding Buffer, 55 65。C孵育至凝膠塊完全溶解；凝膠溶解液加入HiBind DNA spin-column中高速離心去廢液后，再依次加入300 pL Binding Buffer、 700 SPW Buffer洗膜；高速離心甩干spin-column的濾膜后，加入30 DNA Elution Buffer (加于濾膜上)，室溫靜置5min，高速離心1 min后可得純化的PCR產(chǎn)3) 取3 )iL純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察純化效果； 剩余的PCR純化產(chǎn)物真空冷凍干燥濃縮約20 min至10 左右。(2) BigDye標(biāo)記用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit標(biāo)記純化后的PCR產(chǎn)物， 反應(yīng)體系為BigDye Terminator 1 pL、相應(yīng)單向引物(2 pmol/L) 1.6 |^L、純 化后PCR產(chǎn)物2.4 pL，反應(yīng)條件96°C 1 min， (96°C 10 sec、 50°C 5 sec、 60°C 4 min) 25個(gè)循環(huán)。(3) 測(cè)序?qū)?biāo)記好BigDye的5 |iL體系的測(cè)序產(chǎn)物補(bǔ)水至20 ^L，轉(zhuǎn)入1.5 ml的離 心管，再依次加入2 |iL 3 MNaAc(pH 5.2)、2 )iL 125 mM EDTA-Na2、50 |iL 95% 乙醇，旋渦振蕩后室溫下避光放置15 min; 5415型高速臺(tái)式離心機(jī)2800 g離 心20 min，沿離心沉淀物的對(duì)側(cè)小心吸取上清并棄去，加入250 70%冰凍 乙醇，2800g離心5min，棄上清；將管蓋打開(kāi)置于加熱板上，94 95°C 1 min 使其干燥。加入10 高質(zhì)量的去離子甲酰胺，反復(fù)吹打混勻，轉(zhuǎn)入0.2 的PCR管內(nèi)，在PCR儀上95"變性4 min，然后迅速置冰中冷卻至少4 min 后，裝載到3100 DNA序列分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。__ 表1 RT-PCR實(shí)驗(yàn)所涉及的弓1物序列___m_序列 _<formula>formula see original document page 11</formula>(二)抗原特異TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù) 1、重組質(zhì)粒TCRVpi3 (RG) -pIRES的構(gòu)建*(1)目的基因的擴(kuò)增 根據(jù)DLBL相關(guān)TCR VP13亞家族基因序列(包括完整的CDR3區(qū))設(shè) 計(jì)引物，擴(kuò)增病人樣本中的TCRV(313基因序列的上游引物上帶有Xho I酶切 位點(diǎn)、下游引物上帶有EcoRl酶切位點(diǎn)(與真核表達(dá)載體pIRES中的插入位 點(diǎn)A的酶切位點(diǎn)相對(duì)應(yīng))。按BD Advantage 2 PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR 反應(yīng)PCR總反應(yīng)體系50jiL，其中含10XBD Advantage 2 PCRBuffer、上下、 dNTP Mix 0.2 mmol/L、 50 X BD Advantage 2 Polymerase Mix、超純水和1 pLcDNA模板，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。反應(yīng)條件94 °C 1 min (首次為3 min)、 60°C 1 min、 72 °C 2 min (末次為7 min)，共35 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。 (2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建A、 E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒純化目的基因TCRV卩13的PCR產(chǎn)物(同第一 部分，步驟7);B、 將真核表達(dá)載體pIRES與純化后的TCR V(313 PCR產(chǎn)物分別用Xho I酶 切，體系為①TCRV(313PCR產(chǎn)物28pL、 TangoTMbuffer 8 |uL、 Xho I內(nèi)切 酶l |iL、超純水3pL;②pIRES載體4jiL、 TangoTMbuffer 8 |iL、 Xho I內(nèi)切酶 lpL、超純水27pL;混勻后置于37"水浴3h;C、 純化Xho I酶切后的pIRES載體和TCR PCR產(chǎn)物；D、 將已純化好的Xho I酶切后的pIRES載體和TCR V卩13 PCR產(chǎn)物分別再 用EcoRl酶切，體系為①TCRV卩13PCR產(chǎn)物(Xho I )28 pL、 TangoTMbuffer 8 )iL、 EcoR I內(nèi)切酶l pL、超純水3 pL;②pIRES載體(Xho I ) 28 jaL、 TangoTMbuffer8pL、 EcoR I內(nèi)切酶l pL、超純水3 |iL;混勻后置于37。C水浴3 h;E、 雙酶切后的pIRES載體和TCRV卩13PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)體系為 10XT4bufferl pL、 T4DNA酶ljaL、雙酶切后的pIRES載體2 pL、雙酶切后的 TCRV(313PCR產(chǎn)物6nL，混勻后置于16'C過(guò)夜；F、 轉(zhuǎn)化①將連接產(chǎn)物(10|iL)加入感受態(tài)大腸桿菌DH5a (1.5 mL離 心管，100pL菌液，一7(TC保存，北京Tiangen公司)中，輕輕混勻，置冰中 30min;②42。C熱休克90s，迅速置冰中3 min;③加入SOC培養(yǎng)基800 )iL，置 干燥恒溫振蕩箱中37'C 180 200rpm振搖60min;④菌液用玻璃推鋪于1.5。/。 LB固體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100(ig/mL)上，置37"C孵箱過(guò)夜培養(yǎng)；G、 隨機(jī)挑選10個(gè)菌落，分別接種于5mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中， 37°C 180rpm振搖培養(yǎng)過(guò)夜，PureLinkTM超純質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒(5415 型臺(tái)式高速離心機(jī))①3000rpm室溫下離心菌液15min，去上清；②加入250 jiL含脂ase A的Resuspension Buffer,重懸細(xì)菌；③加入250 |iL Lysis Buffer, 輕輕混勻，室溫下放置5min; 加入350 Precipitation Buffer,立即振蕩混 勻；⑤以11400rpm離心10min后，將上清液轉(zhuǎn)移至Mini column中，11400rpm離心lmin，去廢液；⑥加入700 pL Wash Buffer, 11400 rpm離心l min，去廢 液；⑦再以11400rpm離心l min后，將Mini column放入一新的1.5mL離心管中， 加入75 pL預(yù)熱65。C的TE Buffer,室溫下放置3 min, 11400 rpm離心2 min，所 收集的溶液即為富含質(zhì)粒溶液；H、提取質(zhì)粒DNA后用XhoI禾nEcoRl雙酶切鑒定，同時(shí)在pIRES載體的 IRES區(qū)設(shè)計(jì)一下游引物IRES-R (5'-TATAGACAAACGCACACCGG-3，)，結(jié) 合pIRES載體上游的T7公共引物(5'-TACGACTCACTATAGGCTAG-3，)進(jìn)行 PCR鑒定，PCR反應(yīng)體積為25 pL，包括O.l mmol/LdNTP、 1.5UTaq聚合酶、 10XPCR緩沖液、1.5mmol/LMgCb和超純水，引物濃度均為0.4pmol/L，以l : 500稀釋的質(zhì)粒DNA 1 pL作為模板。PCR擴(kuò)增條件為94"C 3 min， (94°C 30 s， 60°C lmin， 72°C 2 min， 35個(gè)循環(huán))，72°C 5 min;酶切產(chǎn)物及PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。篩選出陽(yáng)性克隆，再對(duì)其進(jìn)行雙向測(cè)序鑒 定，證實(shí)為本發(fā)明特異基因序列后擴(kuò)增陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒，從而獲得特異性 CTL相關(guān)的TCRVpi3-pIRES質(zhì)粒。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定重組質(zhì)粒的濃度。2、 脂質(zhì)體介導(dǎo)的重組質(zhì)粒TCR V|313-pIRES轉(zhuǎn)染(1)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株、Molt4細(xì)胞株 轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株①將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞株以4X10S個(gè)細(xì)胞 /孔的密度，加入2 mL無(wú)血清無(wú)抗生素的IMDM培養(yǎng)基，接種6孔培養(yǎng)板； ②取TCRV卩13-pIRES重組質(zhì)粒(4嗎)置于1.5mL離心管中，加入無(wú)血清 無(wú)抗生素的IMDM培養(yǎng)基至250 jaL，輕輕混勻；③取15 脂質(zhì)體 Lipofectamine TM 2000置于1.5 mL離心管中，加入無(wú)血清無(wú)抗生素的IMDM 培養(yǎng)基至250 )iL，輕輕混勻后室溫下孵育5 min; 將②和③混勻后，室溫 下孵育20 min; 將④加入①的A549細(xì)胞培養(yǎng)基中(轉(zhuǎn)染平行2孔)，另 設(shè)1孔轉(zhuǎn)染pIRES空載體作為陰性對(duì)照，具體操作方法同轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒；置 于37'C、 5。/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后全量換液為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h后加 G418進(jìn)行篩選(終濃度600嗎/mL)，每4天換一次培養(yǎng)基，同時(shí)加入相同 濃度的G418，在此篩選條件下培養(yǎng)20 d可得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染Molt4細(xì)胞株將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Molt4細(xì)胞株以2X 106個(gè)細(xì)胞/ 孔的密度接種6孔板，取4 |ig TCR V(313-pIRES重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體 Lipofectamine TM2000混合后轉(zhuǎn)染Molt4細(xì)胞株，方法同轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株。3、 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后TCRVP13基因表達(dá)的鑒定(1) RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TCR Vpi3 mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染7天后，各孔收集3乂106細(xì)胞(A549細(xì)胞株需胰酶消化)，用TRIZol試劑盒和SurperScriptII逆轉(zhuǎn)錄試劑盒分別提取總RNA、合成cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò) 增管家基因P2M檢測(cè)cDNA的合成質(zhì)量(同第一部分，步驟7);用相應(yīng)的TCR V卩13引物以及相應(yīng)的CP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)染空載體組作為陰性對(duì)照，PCR 擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件同前所述。(2) 間接免疫熒光法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá) 轉(zhuǎn)染10天后，收集1乂106細(xì)胞(A549細(xì)胞株需胰酶消化)，用0.1mol/L的PBS洗滌細(xì)胞兩次后，標(biāo)記大鼠抗人TCRV(3單抗(一抗，1 : 100稀釋)， 37。C孵育lh; PBS洗滌細(xì)胞三次后，標(biāo)記FITC-兔抗大鼠IgG抗體(二抗，1: 50稀釋)，37。C孵育lh; PBS洗滌細(xì)胞三次后，在熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒 在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株中的表達(dá)情況；或直接用FITC-大鼠抗人TCRVpl3單抗標(biāo)記， 37"C孵育30 min， PBS洗滌細(xì)胞一次后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式檢測(cè)重組質(zhì)粒的 表達(dá)。(3) 點(diǎn)印記雜交和Western Blot檢測(cè)TCRV(313蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染20天后，收集2X10H定表達(dá)重組質(zhì)粒的細(xì)胞，用RIPA蛋白提取試劑盒提取總蛋白，真空冷凍干燥濃縮后考馬斯亮蘭法定量；同樣提取臍血細(xì)胞 (TCRV(313亞家族表達(dá)均陽(yáng)性)的蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照，轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞的 蛋白為陰性對(duì)照。 1)點(diǎn)印記雜交A、 取NC膜2cmX4cm，劃分小格，用微量加樣槍分別點(diǎn)膜，重組質(zhì)粒組、 陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組的蛋白樣品分別點(diǎn)3次，每次l ^L;進(jìn)行2個(gè)平行反應(yīng)；B、 用blocking Reagent封膜4 h后用wash buffer洗滌2次，每次5 min;C、 加入l : 500的大鼠抗人TCRV卩13單抗(用blockingReagent稀釋)，4 'C孵育過(guò)夜后用wash buffer洗滌2次，每次5 min;D、 加入l : 500的HRP-兔抗大鼠IgG抗體(用blockingReagent稀釋)室溫 孵育2h，用washbuffer洗滌3次，每次5 min;E、 將NC膜浸入DAB底物液(避光)顯色。 2) Western BlotA、 SDS-PAGE電泳將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組的濃縮蛋白樣品、陽(yáng)性對(duì)照和陰 性對(duì)照分別加樣于15。/。SDS-PAGE膠(每孔上樣約100嗎)，以PageRulerPrestained Protein Ladder為預(yù)染marker，進(jìn)行3個(gè)平行反應(yīng)；用恒壓60V電泳30 min后，改恒壓100Vlh;B、 分離其中1個(gè)平行反應(yīng)的SDS-PAGE膠，用考馬斯亮蘭染色后，用冰乙 酸甲醇洗脫液反復(fù)漂洗直至有清晰條帶顯出；C、 轉(zhuǎn)膜PVDF膜預(yù)先用甲醇浸泡lmin，再浸泡到轉(zhuǎn)膜液中備用；切好 的濾紙和海綿也浸泡到轉(zhuǎn)膜液中IO min;將切下的另2個(gè)平行反應(yīng)的SDS-PAGE 膠與相應(yīng)的PVDF膜放入轉(zhuǎn)膜液中浸泡片刻；將海綿—濾紙一PVDF膜一 SDS-PAGE膠一濾紙一海綿依次放到陽(yáng)極板上，膠大小二膜〉濾紙；用4"預(yù)冷 的轉(zhuǎn)膜液，恒壓40V， 90min (濕轉(zhuǎn));D、 封膜用blockingReagent封膜4h后用washbuffer洗滌2次，每次5 min;E、 檢測(cè)人(3-actin蛋白(內(nèi)參照)的表達(dá)將其中1個(gè)平行反應(yīng)的PVDF膜 加入l : 800的小鼠抗人(3-actin單抗(用blocking Reagent稀釋)，4"C孵育過(guò)夜 后用washbuffer洗滌2次，每次5min;加入l : 1000的HRP-羊抗小鼠IgG抗體(用 blocking Reagent稀釋)室溫孵育2 h，用wash buffer洗滌3次，每次5 min;F、 檢測(cè)目的蛋白TCRV卩13的表達(dá)將另1個(gè)平行反應(yīng)的PVDF膜加入1 : 800的大鼠抗人TCRV卩單抗(用blockingReagent稀釋)，4。C孵育過(guò)夜后用wash buffer洗滌2次，每次5 min;加入l : 1000的HRP-兔抗大鼠IgG抗體(用blocking Reagent稀釋)室溫孵育2h，用wash buffer洗滌3次，每次5 min;G、 化學(xué)發(fā)光法顯影在暗室中將PVDF膜轉(zhuǎn)入LumiGLO Working Reagent 中，室溫孵育3min;用鑷子將PVDF膜取出，瀝去多余的試劑；將PVDF膜放 入塑料薄膜中，要保證PVDF膜與塑料薄膜之間沒(méi)有氣泡；將含有PVDF膜的 塑料薄膜放入X線曝光暗盒中，壓上X線膠片(曝光30s)，常規(guī)顯影、定影后 得到顯影的X線膠片。4、重組質(zhì)粒TCRVpi3-pIRES轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞，構(gòu)建特異性CTL(1) 重組質(zhì)粒TCRV(313-pIRES轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常人T細(xì)胞以2X10e個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種6孔板，取4嗎TCR V卩13-pIRES重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體Lipofectamine TM2000混合后轉(zhuǎn)染 正常人T細(xì)胞，操作方法同前所述，培養(yǎng)擴(kuò)增后得到表達(dá)抗原特異性CTL相 關(guān)TCRV(313基因的T細(xì)胞，并檢測(cè)驗(yàn)證重組質(zhì)粒的表達(dá)(方法同前)。(2) 細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)以乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)檢測(cè)試劑盒分別在轉(zhuǎn)染后第1周、第3周進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，操作按說(shuō)明進(jìn)行。分別以轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的正常T細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體的正常T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以DLBL細(xì)胞株、Raji 細(xì)胞、Molt4細(xì)胞(陰性對(duì)照)為靶細(xì)胞，另設(shè)未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的正常T細(xì)胞為空 白組。效靶比為10 : 1，靶細(xì)胞濃度1X1(^個(gè)細(xì)胞/ L，每組3個(gè)復(fù)孔；置U 型96孔培養(yǎng)板內(nèi)，稍離心2500rpm30s，以促進(jìn)效、靶細(xì)胞之間接觸，于37 。C、 5。/。C02飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育4 h;用1000 rpm離心5 min，吸取上清100 pL加入平底酶標(biāo)板中，加入100 LDH底物反應(yīng)液，室溫下避光作用30 min， 每孔加50 ^iL 1 mol/L鹽酸終止酶促反應(yīng)；Elx-800酶標(biāo)儀測(cè)定光密(optical density, OD)值，測(cè)定波長(zhǎng)490nm，參考波長(zhǎng)670nm。CTL細(xì)胞毒活性計(jì)算公式 CTL活性(％) 二(實(shí)驗(yàn)組OD值一效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組OD值一靶細(xì)胞自然 釋放組OD值)/ (最大釋放組OD值一靶細(xì)胞自然釋放組OD值)上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí) 施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、 替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCE LISTING<110>暨南大學(xué)廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 <120>彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR V P 13亞家族的RG基因序列及應(yīng)用 <130> 43 <160> 2<170〉 Patentln version 3.2<210> 1<211> 414<212> DNA<213> Artificial sequence<220><223>彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR V13 n亞家族的RG基因序列 <400> 1tatcgacaag acccaggcat ggggctgaag ctgatttatt attcagttgg tgctggtatc 60 actgataaag gagaagtccc gaatggctac aacgtctcca gatcaaccac agaggatttc 120 ccgctcaggc tggagttggc tgctccctcc cagacatctg tgtacttctg tgccagcagt 180 cgcgggatct ctagcacaga tacgcagtat tttggcccag gcacccggct gacagtgctc 240 gaggacctga aaaacgtgtt cccacccgag gtcgctgtgt ttgagccatc agaagcagag 300 atctcccaca cccaaaaggc cacactggtg tgcctggcca caggcttcta ccccgaccac 360 gtggagctga gctggtgggt gaatgggaag gaggtgcaca gtggggtcag caca 414<210> 2 <211> 138 <212> PRT<213> Artificial sequence <220><223〉彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR V 0 13亞家族的RG基因序列翻譯的蛋白質(zhì)<400〉 2Tyr Arg Gin Asp Pro Gly Met Gly Leu Lys Leu He Tyr Tyr Ser Val 15 10 5Gly Ala Gly lie Thr Asp Lys Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr Asn Val20 25 30Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Glu Leu Ala Ala35 40 45Pro Ser Gin Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Arg Gly lie Ser50 55 60Ser Thr Asp Thr Gin Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu 65 70 75 80Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro85 卯 95Ser Glu Ala Glu lie Ser His Thr Gin Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu100 105 110Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn115 120 125Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr 130 13權(quán)利要求
1、一種彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR Vβ13亞家族的RG基因序列，其特征在于所述RG基因序列如下TATCGACaAGACCCAGGCATGGGGCTGAAGCTGATTTATTATTCAGTTGGTGCTGGTATCACTGATAAAGGAGAAGTCCCGAATGGCTACAACGTCTCCAGATCAACCACAGAGGATTTCCCGCTCAGGCTGGAGTTGGCTGCTCCCTCCCAGACATCTGTGTACTTCTGTGCCAGCAGTCGCGGGATCTCTAGCACAGATACGCAGTATTTTGGCCCAGGCACCCGGCTGACAGTGCTCGAGGACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACA。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種彌漫性人B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR VP 13亞家族的RG基因序列，其特征在于所述彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)抗原 特異TCR V卩13亞家族的RG基因序列翻譯的蛋白質(zhì)如下TLVCLATGF YPDHVELS WWVNGKEVHSGVST 。
3、權(quán)利要求1所述的一種彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)抗原特異TCR V卩13 亞家族的RG基因序列在制備彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤特異性分子耙向過(guò)繼性免 疫藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)針對(duì)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)抗原的特異性T細(xì)胞受體的核苷酸序列及應(yīng)用。通過(guò)RT-PCR基因掃描分析DLBL患者外周血中TCR Vβ13亞家族呈明顯單克隆，其PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析特異性TCR序列的V-NDN-J區(qū)，即互補(bǔ)決定區(qū)3，是和抗原特異性識(shí)別結(jié)合的部位，表明該克隆性T細(xì)胞的TCR為DLBL相關(guān)抗原刺激所產(chǎn)生的特異性TCR。它是通過(guò)TCR轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行DLBL分子靶向的過(guò)繼性免疫治療的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。該特異性TCR的核苷酸序列為進(jìn)一步開(kāi)展針對(duì)淋巴瘤的特異性細(xì)胞免疫治療的一個(gè)重要基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101235373SQ20081002599
公開(kāi)日2008年8月6日 申請(qǐng)日期2008年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月24日
發(fā)明者葉靜梅, 吳秀麗, 尹青松, 李揚(yáng)秋, 楊力建, 獲 譚, 陳少華 申請(qǐng)人:暨南大學(xué);廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院