專(zhuān)利名稱(chēng)：：定量熒光pcr快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)臨床檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體的方法，以及相應(yīng)的試劑盒。
背景技術(shù)：
：流產(chǎn)和新生兒死亡最常見(jiàn)的原因是染色體異常，其中，第21、18、13號(hào)及性別染色體數(shù)目異常占出生后染色體異?？倲?shù)的95%。唐氏綜合征為最常見(jiàn)，新生兒的發(fā)病率為1/8001/600，我國(guó)每年大約有26600個(gè)先天愚型癡呆兒出生，平均每20分鐘就出生一例。由于目前尚無(wú)有效的治療方法，患者智力低下、常伴有多種嚴(yán)重的先天缺陷，給家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)。因此，及早檢測(cè)并防止患兒的出生，對(duì)降低其發(fā)病率無(wú)疑具有非常重要的意義。傳統(tǒng)上采用羊水染色體檢測(cè)方法，該方法存在以下缺陷①對(duì)于妊娠胎兒的檢查時(shí)間受到明顯的限制(僅能檢測(cè)妊娠16-22周的羊水染色體)；②對(duì)抽取樣本的數(shù)量要求較多；③耗時(shí)長(zhǎng)(15—20天的培養(yǎng)時(shí)間)；工作量大(需要人工顯微鏡下對(duì)染色體區(qū)帶進(jìn)行分辨)i⑤不能保證母血污染羊水樣本結(jié)果的準(zhǔn)確性。而作為羊水染色體檢査補(bǔ)充方法的臍帶血及絨毛染色體檢查的方法也同樣存在以上缺點(diǎn)。近年來(lái)，對(duì)染色體異常進(jìn)行檢測(cè)的分子遺傳學(xué)方法很多，包括熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、引物原位標(biāo)記技術(shù)(PRINS)、同源基因定量PCR(HGQ-PCR)和實(shí)時(shí)定量PCR(Rea卜timePCR)等。其中FISH和PRINS在設(shè)備和技術(shù)上有較高要求，限制了這些方法的普及和應(yīng)用；同源基因定量PCR(HGQ-PCR)技術(shù)，僅能對(duì)唐氏綜合征進(jìn)行檢測(cè)；實(shí)時(shí)定量PCR方法，通過(guò)對(duì)21號(hào)染色體和其他染色體Ct值比率或差值的比較分析，來(lái)檢測(cè)21號(hào)染色體的數(shù)目，但此方法對(duì)3個(gè)數(shù)量級(jí)以上的差別才能有較好的區(qū)分，而三體只是二體的1.5倍，區(qū)分度不大，另外Ct值的波動(dòng)范圍較大，輕微的變化都有可能對(duì)結(jié)果有影響，容易造成誤診，其檢測(cè)的準(zhǔn)確性還有待于進(jìn)一步的研究和完善。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種準(zhǔn)確、可靠的定量熒光PCR快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體的方法。本發(fā)明所述的一種定量熒光PCR快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體的方法，包括以下步驟A.樣本的收集與處理樣本為外周血或孕婦產(chǎn)前樣本，包括孕16周以后采集的羊水，孕18周以后采集的臍帶血，或者孕13周前采集的絨毛，采用常規(guī)方法處理；B.DNA提取按常規(guī)苯酚-氯仿法提取前述樣本的DNA，用紫外分光光度儀測(cè)OD28o及OD26o值以確定濃度和純度，所需DNA純度要求OD260/OD280的值為1.61.8;C.引物設(shè)計(jì)和合成選擇分布在第21、18、13號(hào)染色體和性別染色體上的11個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)即STR位點(diǎn)，包括21號(hào)染色體的三個(gè)STR位點(diǎn)D21S11、D21S1411和D21S1412;18號(hào)染色體的四個(gè)STR位點(diǎn)MBP、D18S535、D18S51禾口D18S386;13號(hào)染色體的三個(gè)STR位點(diǎn)D13S631、D13S634和D13S317;X染色體的一個(gè)STR位點(diǎn)XHPRT;另選擇性別染色體上特異性的AMXY位點(diǎn)；上述位點(diǎn)可在人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)即GDB網(wǎng)站中查詢獲得；針對(duì)上述12個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)特異性引物，并在每對(duì)引物的反向鏈5'端加一段GTTCTT序列；用不同的熒光素對(duì)已合成的引物進(jìn)行標(biāo)記；D.第一體系和第二體系的PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行兩個(gè)反應(yīng)體系的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，第一體系包括以下位點(diǎn)的引物MBP、AMXY、D13S631和D13S634;第二體系包括以下位點(diǎn)的引物D18S535、XHPRT、D21S11、D21S1411禾口D21S1412。PCR擴(kuò)增體系如下-DNA模板240ng弓|物220pmol熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶2U10xPCR緩沖液2.5plMgCI21.5mmol/LdNTP200|jmol/L加水至總體積25plPCR擴(kuò)增條件為95'C預(yù)變性11分鐘，94'C變性1分鐘，59'C退火1分鐘，72'C延伸1分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在6(TC下延伸60分鐘；E.PCR產(chǎn)物的檢測(cè)將PCR產(chǎn)物按現(xiàn)有遺傳分析儀的操作說(shuō)明進(jìn)行處理，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小及熒光素的不同進(jìn)行區(qū)分，通過(guò)樣本DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的STR形式的定量分析，參照業(yè)內(nèi)制訂的分子遺傳學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，判斷被檢者的染色體的數(shù)目是正常的二體，還是異常的三體，或是暫不能判定其染色體數(shù)目的情況；F.第三體系的PCR擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)于步驟E中未能達(dá)到上述檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的樣本，再進(jìn)行第三體系的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，第三體系包括以下位點(diǎn)的引物D18S51、D18S386和D13S317;PCR擴(kuò)增體系和PCR擴(kuò)增條件均與步驟D相同；G.PCR產(chǎn)物的檢測(cè)與步驟E相同。優(yōu)選地，所述步驟A中，外周血樣本的收集與處理為抽取1ml靜脈血，加枸橡酸鈉抗凝后用于步驟B。優(yōu)選地，所述步驟A中，羊水樣本的收集與處理為抽取的羊水在4000rpm離心10min，棄上清液，用生理鹽水洗滌沉淀一次，4000rpm離心10min，棄上清液，收集底部的細(xì)胞用于步驟B。優(yōu)選地，所述步驟A中，臍帶血樣本的收集與處理為抽取1ml臍帶血，加枸櫞酸鈉抗凝后用于步驟B。優(yōu)選地，所述步驟A中，絨毛樣本的收集與處理為選出具有明顯分支結(jié)構(gòu)的絨毛組織，用生理鹽水洗滌二次，用于步驟B。本發(fā)明的另一目的是提供一種準(zhǔn)確、可靠的定量熒光PCR快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體的試劑盒。本發(fā)明所述的一種定量熒光PCR快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體的試劑盒，包括三種不同的反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)體系均含有以下試劑10XPCR緩沖液，含15mmol/LMgCI2，反應(yīng)體系中稀釋為1XPCR緩沖液；dNTP，濃度為10mmol/L,反應(yīng)體系中稀釋為200pmol/L;熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶，濃度為5U/|jl，反應(yīng)體系中用量為2U;引物，濃度為0.5~5Mmol/L，反應(yīng)體系中用量為220pmol;其中，所述引物為針對(duì)12個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的特異性引物，并在每對(duì)引物的反向鏈5'端加一段GTTCTT序列；其中11個(gè)位點(diǎn)是分布在第21、18、13號(hào)染色體和性別染色體上的STR位點(diǎn)，包括21號(hào)染色體的三個(gè)STR位點(diǎn)D21S11、D21S1411禾IID21S1412;18號(hào)染色體的四個(gè)STR位點(diǎn)MBP、D18S535、D18S51禾卩D18S386;13號(hào)染色體的三個(gè)STR位點(diǎn)D13S631、D13S634和D13S317;X染色體的一個(gè)STR位點(diǎn)XHPRT;另選擇性別染色體上特異性的AMXY位點(diǎn)；上述位點(diǎn)可在人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)即GDB網(wǎng)站中査詢獲得；將所述引物分為三組，分別構(gòu)成三個(gè)反應(yīng)體系，其中，第一體系包括以下位點(diǎn)的引物MBP、AMXY、D13S631禾nD13S634;第二體系包括以下位點(diǎn)的弓(物D18S535、XHPRT、D21S"、D21S1411和D21S1412;第三體系包括以下位點(diǎn)的引物D18S51、D18S386和D13S317。本發(fā)明所述的定量熒光PCR快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體的方法，結(jié)合了定量熒光PCR靈敏、精確的特點(diǎn)與短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemr印eat，STR)分布廣、均勻、多態(tài)性、雜合度高的特點(diǎn)，可應(yīng)用在外周血及羊水、臍帶血、絨毛等產(chǎn)前樣本的常見(jiàn)染色體病數(shù)目的檢測(cè)上。定量熒光PCR快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體的方法及試劑盒結(jié)合了定量熒光PCR靈敏、精確的特點(diǎn)與短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)分布廣、均勻、多態(tài)性、雜合度高的特點(diǎn)。短串聯(lián)重復(fù)序列是26bp的重復(fù)序列，其多態(tài)性來(lái)源于串聯(lián)片段重復(fù)數(shù)量的變化，是定量檢測(cè)染色體數(shù)目異常最有力的遺傳標(biāo)記。本發(fā)明選擇常見(jiàn)染色體三體所在染色體(第21、18、13號(hào)染色體)上的幾個(gè)多態(tài)性、雜合度高、特異性強(qiáng)的標(biāo)記物，用不同的熒光素對(duì)引物進(jìn)行標(biāo)記，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小及熒光素的不同進(jìn)行區(qū)分，通過(guò)樣本DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的STR形式的分析，對(duì)該條染色體數(shù)目進(jìn)行半定量的判斷。另外還有一個(gè)性別染色體上特異性的AMXY位點(diǎn)，以增加對(duì)伴性遺傳病性別的檢測(cè)。正常人的STR位點(diǎn)有兩種表現(xiàn)形式①如該STR位點(diǎn)是由兩個(gè)不同等位基因組成的雜合子，則出現(xiàn)相對(duì)應(yīng)的兩個(gè)比率為1:1的熒光峰；②如該STR位點(diǎn)是純合子，則會(huì)出現(xiàn)一個(gè)高強(qiáng)度的熒光峰。而三體者的STR位點(diǎn)有三種表現(xiàn)形式①如該STR位點(diǎn)是由三種不同等位基因組成的雜合子，則出現(xiàn)相對(duì)應(yīng)的三個(gè)比率為1:1:1的熒光峰；②如該STR位點(diǎn)是由兩個(gè)相同的等位基因和一個(gè)不同的等位基因組成的雜合子，則出現(xiàn)二個(gè)比率為2:1的熒光峰；③如該STR位點(diǎn)是純合子，則會(huì)出現(xiàn)一個(gè)高強(qiáng)度的熒光峰。因此，本發(fā)明所述的定量熒光PCR快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體的方法是一種準(zhǔn)確、可靠的方法，其優(yōu)勢(shì)能在樣本量日益增大的產(chǎn)前檢測(cè)中得到充分的體現(xiàn)。本發(fā)明所述方法與試劑盒，還具有以下獨(dú)創(chuàng)性(1)選擇了11個(gè)在中國(guó)人群中具有高的雜合度和強(qiáng)的多態(tài)性、分布在21、18、13號(hào)染色體上的STR位點(diǎn)。每條染色體上都選用了34個(gè)STR位點(diǎn)，其中21號(hào)染色體有三個(gè)，18號(hào)染色體有四個(gè)，13號(hào)染色體有三個(gè)，選用的有檢測(cè)意義、雜合度高的、合適數(shù)目的STR位點(diǎn)，可提高21、18、13號(hào)染色體數(shù)目的檢出率，減少無(wú)法下檢測(cè)結(jié)論的樣本數(shù)。另有一個(gè)性別染色體上特異性位點(diǎn)，可增加對(duì)伴性遺傳病性別的檢測(cè)。在現(xiàn)有技術(shù)的報(bào)道中，未見(jiàn)這樣的設(shè)計(jì)。通過(guò)這種獨(dú)創(chuàng)的合理的設(shè)計(jì)，既有兩個(gè)保證大部分樣本檢出的反應(yīng)體系，又有一個(gè)補(bǔ)充的提高檢出率的反應(yīng)體系，使對(duì)于常見(jiàn)染色體三體的定量熒光PCR檢測(cè)更為完整。經(jīng)驗(yàn)證，19例21三體和1例18三體的檢出率達(dá)到了100%，沒(méi)有出現(xiàn)漏診和假陰性；106例正常樣本的21、18、13號(hào)染色體數(shù)目的檢出率分別達(dá)到了85.8%,93.4%,92.5%。(2)對(duì)各體系中選擇的STR位點(diǎn)設(shè)計(jì)了獨(dú)特的引物。由于TaqDNA聚合酶會(huì)在部分PCR產(chǎn)物的3'端非特異性地添加一個(gè)堿基，導(dǎo)致每個(gè)等位基因有大小相差化p的兩個(gè)片段，出現(xiàn)肩膀峰(shoulderpeak)，對(duì)結(jié)果的判定帶來(lái)困難。因此我們?cè)诿繉?duì)引物的反向鏈5'端加一段GTTCTT序列，使產(chǎn)物未端全部都添加一個(gè)堿基，避免相差1bp肩膀峰的出現(xiàn)，以保證結(jié)果判定的準(zhǔn)確性，減少結(jié)果判定時(shí)帶來(lái)的困難。每對(duì)引物的上游序列5'端用6—羧基熒光素(6-FAM)或六氯一6—甲基熒光素(HEX)進(jìn)行熒光素標(biāo)記，以便對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行區(qū)分。圖1為本發(fā)明所述的定量熒光PCR快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體的方法的流呈現(xiàn)兩個(gè)熒光強(qiáng)度之比為1:1的峰，而MBP(A)為純合的單ililoAMXY(Y)在250bp處有一個(gè)與Y染色體相對(duì)應(yīng)的峰AMXY(X)在432bp處有一個(gè)與X染色體相對(duì)應(yīng)的峰；(B)圖顯示D21S11、D21S1411和D21S1412均為雜合，呈現(xiàn)兩個(gè)熒光強(qiáng)度之比為1:1的峰，D18S535和XHPRT為純合的單峰；圖3為21三體(47,XY,+21)樣本擴(kuò)增后的電泳圖；圖中，x軸代表PCR產(chǎn)物的大小(bp)，y軸代表隊(duì)熒光強(qiáng)度的大小(RIU);該圖顯示除D21S1412為純合的單峰外，D21S11和D21S1411分別出現(xiàn)三個(gè)熒光強(qiáng)度之比為1:1:1的峰和呈現(xiàn)兩個(gè)熒光強(qiáng)度之比為2:1的峰，提示為21三體。圖4為18三體樣本(47，XX,+18)擴(kuò)增后的電泳圖；圖中，x軸代表PCR產(chǎn)物的大小(bp),y軸代表隊(duì)熒光強(qiáng)度的大小(RIU);4-A圖顯示MBP(A)、MBP(B)均為純合，呈現(xiàn)單峰，AMXY在432bp處產(chǎn)生一個(gè)與X染色體相對(duì)應(yīng)的峰；4-B圖顯示D18S535呈現(xiàn)兩個(gè)熒光強(qiáng)度之比為1:2的峰；4-C圖顯示增做反應(yīng)體系三，D18S51和D18S386均呈現(xiàn)三個(gè)熒光強(qiáng)度之比為1:1:1的峰。圖5為母源性減數(shù)分裂I不分離Down's患兒和父母擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；該圖顯示患者D21S11的231bp、235bp,D21S1411的282bp，286bp和D21S1412的383bp，417bp兩個(gè)不同的等位基因均來(lái)源于母親，由此可推斷此額外的21號(hào)染色體來(lái)源于母親減數(shù)分裂I不分離。圖6為母源性減數(shù)分裂II不分離Down's患兒和父母擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；該圖顯示患者D21S11的223bp，D21S1412的383bp均有兩個(gè)相同的拷貝數(shù)，且都來(lái)源于母親，由此可推斷此額外的21號(hào)染色體來(lái)源于母親減數(shù)分裂II不分離。圖7為妊娠早期篩查高風(fēng)險(xiǎn)絨毛樣本和母親血樣擴(kuò)增后的電泳圖；圖8為有嚴(yán)重血污染的羊水樣本及母親血樣擴(kuò)增后的電泳圖；圖9為葡萄胎絨毛及父母血樣擴(kuò)增后的電泳圖；圖10為DMD產(chǎn)前性別檢測(cè)羊水樣本擴(kuò)增后的電泳圖；圖11為疑為45,X0或45,X0/46，XX樣本擴(kuò)增后的電泳圖；圖12為G組多一條染色體絨毛樣本擴(kuò)增后的電泳圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明所述的一種定量熒光PCR快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體的方法，如圖1所示，包括以下步驟(1)樣本的收集與處理包括外周血樣及羊水、臍帶血、絨毛等產(chǎn)前樣本。采用外周血或孕婦產(chǎn)前樣本，包括孕16周以后采集的羊水，孕18周以后采集的臍帶血，或者孕13周前采集的絨毛，采用常規(guī)方法處理；優(yōu)選的處理方法是外周血樣本的收集與處理為抽取1ml靜脈血，加枸櫞酸鈉抗凝，備用。羊水樣本的收集與處理為抽取的羊水在4000rpm離心10min，棄上清液，用生理鹽水洗滌沉淀一次，4000rpm離心10min，棄上清液，收集底部的細(xì)胞，備用。臍帶血樣本的收集與處理為抽取1ml臍帶血，加枸櫞酸鈉抗凝，備用。絨毛樣本的收集與處理為選出具有明顯分支結(jié)構(gòu)的絨毛組織，用生理鹽水洗滌二次，備用。(2)DNA提取按常規(guī)苯酚-氯仿法提取前述樣本的DNA，用紫外分光光度儀測(cè)OD28o及OD2so值以確定濃度和純度，所需DNA純度要求OD26C)/OD28()的值為1.61.8;(3)引物設(shè)計(jì)和合成及熒光素標(biāo)記選擇分布在第21、18、13號(hào)染色體和性別染色體上的11個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)即STR位點(diǎn)，包括21號(hào)染色體的三個(gè)STR位點(diǎn)D21S11、D21S1411禾口D21S1412;18號(hào)染色體的四個(gè)STR^立點(diǎn)MBP、D18S535、D18S51禾口D18S386;13號(hào)染色體的三個(gè)STR位點(diǎn)D13S631、D13S634禾口D13S317;X染色體的一個(gè)STR位點(diǎn)XHPRT;另選擇性別染色體上特異性的AMXY位點(diǎn)；上述位點(diǎn)可在人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)即GDB網(wǎng)站(http:〃www.gdb.org/)中查詢獲得。針對(duì)上述12個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)特異性引物，并在每對(duì)引物的反向鏈5'端加一段GTTCTT序列；用不同的熒光素對(duì)已合成的引物進(jìn)行標(biāo)記。分為三個(gè)反應(yīng)體系，見(jiàn)下面的表1、表2和表3。表l檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體所用的STRs和熒光素(體系l)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在PCR反應(yīng)管中加入緩沖液、MgCI2、dNTP、反應(yīng)體系1或2的引物、DNA聚合酶及DNA模板。在PCR擴(kuò)增儀上按一定的反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增體系如下DNA模板240ng弓|物220pmol熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶2U10xPCR緩沖液2.5|J|MgCI21.5mmol/LdNTP200|jmol/L加水至總體積25ylPCR擴(kuò)增條件為95。C預(yù)變性11分鐘，94。C變性1分鐘，59'C退火1分鐘，72。C延伸1分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在60'C下延伸60分鐘；(5)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)PCR產(chǎn)物與變性劑、分子量?jī)?nèi)標(biāo)混合，高溫變性后，放入遺傳分析儀，進(jìn)行毛細(xì)管電泳，結(jié)果用專(zhuān)門(mén)的軟件進(jìn)行定量分析。例如，1plPCR產(chǎn)物與10p去離子甲酰胺、0.5pl6-羧基-若丹明(ROX)-500分子量?jī)?nèi)標(biāo)混合，95。C變性5分鐘，立即冰浴5分鐘，將待測(cè)管放入遺傳分析儀，自動(dòng)上樣，毛細(xì)管凝膠電泳30min，結(jié)果用儀器中的軟件進(jìn)行定量分析。(6)結(jié)果判定參照業(yè)內(nèi)制訂的分子遺傳學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，判斷被檢者的染色體的數(shù)目是正常的二體，還是異常的三體，或是暫不能判定其染色體數(shù)目的情況(參照臨床分子遺傳學(xué)協(xié)會(huì)2007年標(biāo)準(zhǔn)，http:〃cmgsweb.shared.hosting.zen.co.uk/)。峰面積比率在0.8-1.4間的兩個(gè)峰認(rèn)為是正常的二體，而比率介于0.45~0.65或1.8-2.4的兩個(gè)峰，或1:1:1的三個(gè)峰被認(rèn)為是異常的三體。而在上述范圍之外的比率和單個(gè)峰，沒(méi)有檢測(cè)意義。染色體上有檢測(cè)意義、雜合性的STR位點(diǎn)達(dá)到兩個(gè)或兩個(gè)以上，才能對(duì)該染色體的數(shù)目下檢測(cè)結(jié)論。對(duì)于正常二體如某條染色體上的STR位點(diǎn)出現(xiàn)純合的單峰，或(和)比率為(0.65~0.8或1.4~1.8)的兩個(gè)峰，致使比率為(0.8-1.4)兩個(gè)峰的STR位點(diǎn)數(shù)未能達(dá)到兩個(gè)或兩個(gè)以上，則不能對(duì)該染色體的數(shù)目下檢測(cè)結(jié)論。對(duì)于異常三體如該條染色體上的STR位點(diǎn)出現(xiàn)純合的單峰，或(和)比率不在0.45~0.65或1.8~2.4的兩個(gè)峰，致使比率為(0.45~0.65或1.8~2.4)兩個(gè)峰的STR位點(diǎn)數(shù)加上比率為(1:1:1)的三個(gè)峰的STR位點(diǎn)數(shù)的總和數(shù)未能達(dá)到兩個(gè)或兩個(gè)以上，則不能對(duì)該染色體的數(shù)目下檢測(cè)結(jié)論。(7)對(duì)部分未能達(dá)到檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的樣本，需增做第三反應(yīng)體系中的STR位點(diǎn)(見(jiàn)表3)。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>樣本的收集與處理、DNA提取、PCR擴(kuò)增反應(yīng)、PCR產(chǎn)物的檢測(cè)及結(jié)果的判定同反應(yīng)體系1、2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)外周血樣本①50例正常樣本的21、18、13號(hào)染色體數(shù)目的檢出率分別是82%、76%和64%，增加STR位點(diǎn)后，18、13號(hào)染色體數(shù)目的檢出率分別提高到96%和96%;假陽(yáng)性率為2%;②17例21三樣本的檢出率達(dá)到了100%，沒(méi)有漏診和假陰性；③性別檢測(cè)的準(zhǔn)確率為100%;(2)產(chǎn)前檢測(cè)樣本①羊水樣本(54例)a.檢測(cè)出1例21三體和1例18三體；b.未檢測(cè)出1例平衡易位和1例臂間倒位；c.50例正常羊水樣本21、18、13號(hào)染色體數(shù)目的檢出率分別是90%、72%和78%，增加STR位點(diǎn)后，18、13號(hào)染色體數(shù)目的檢出率分別提高到92%和90%,無(wú)假陽(yáng)性，性別檢測(cè)的準(zhǔn)確率為100%;其中1例有嚴(yán)重母血污染的羊水獲得了與染色體核型分析相符的結(jié)果。②臍帶血樣本(7例)檢出1例21三體?！蚪q毛樣本(5例)a.對(duì)經(jīng)腹或經(jīng)陰道抽取的微量絨毛進(jìn)行了個(gè)體識(shí)別，判定組織的來(lái)源，了解了染色體的情況；b.對(duì)葡萄胎流產(chǎn)的絨毛組織及父母血樣的分析，可確定葡萄胎遺傳物質(zhì)的來(lái)源及受精的類(lèi)型。(3)106例正常樣本(來(lái)源于外周血、羊水、臍帶血)21、18、13號(hào)染色體數(shù)目的檢出率分別是85.8%,72.6%,71.7%，增加STR位點(diǎn)后，18、13號(hào)染色體數(shù)目的檢出率分別提高到93.4%,92.5%，假陽(yáng)性率為0.94%，性別檢測(cè)的準(zhǔn)確率達(dá)到了100%;(4)20例三體樣本(來(lái)源于外周血、羊水、臍帶血)①檢出19例21三體，1例18三體，檢出率達(dá)到了100%,沒(méi)有漏診和假陰性；②21三體樣本中單純型占89.5%，易位型占10.5%;11例患者家庭中，除3例額外的21號(hào)染色體來(lái)源不能判定外，8例均來(lái)源于母親，其中7例來(lái)源減數(shù)分裂l不分離，1例來(lái)源減數(shù)分裂II不分離；男性患者占78.9%，女性占21.1%。臨床應(yīng)用(1)應(yīng)用于高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的產(chǎn)前檢測(cè)中，可及早獲得檢測(cè)結(jié)果和處理(見(jiàn)圖2、圖3、圖4);(2)通過(guò)對(duì)唐氏綜合征患者及父母雙方STR擴(kuò)增產(chǎn)物的比對(duì)，可以判定額外21號(hào)染色體的來(lái)源，為唐氏綜合征的發(fā)病機(jī)制的研究提供依據(jù)(見(jiàn)圖5、圖6);(3)應(yīng)用于妊娠早期(孕9~13周)，經(jīng)腹或經(jīng)陰道抽取絨毛等樣本量少，染色體核型分析困難的情況，有助于了解染色體的情況，還可用于個(gè)體識(shí)別(見(jiàn)圖7);(4)應(yīng)用于血污染的羊水樣本中，通過(guò)羊水及血的比對(duì)，確定胎兒染色體的情況(見(jiàn)圖8);(5)通過(guò)對(duì)葡萄胎患兒及父母STR產(chǎn)物的比對(duì)，可以判定葡萄胎遺傳物質(zhì)的來(lái)源和受精類(lèi)型，為葡萄胎的深入研究和臨床隨訪或治療效果的前瞻性研究提供科學(xué)的依據(jù)(見(jiàn)圖9);(6)可應(yīng)用于某些伴性遺傳病的性別檢測(cè)，如DMD(進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥)產(chǎn)前性別檢測(cè)(見(jiàn)圖10);。(7)對(duì)某些染色體核型分析結(jié)果不明確的情況有幫助，例如，分析45，X0或45,X0/46，XX樣本(見(jiàn)圖11)，分析G組多一條染色體絨毛樣本(見(jiàn)圖12)。根據(jù)上述檢測(cè)方法，可設(shè)計(jì)出相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明所述的一種定量熒光PCR快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體的試劑盒，包括三種不同的反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)體系均含有以下試劑10XPCR緩沖液，含15mmol/LMgCI2，反應(yīng)體系中稀釋為1XPCR緩沖液；dNTP，濃度為10mmol/L,反應(yīng)體系中稀釋為200jjmol/L;熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶，濃度為5U/pl，反應(yīng)體系中用量為2U;引物，濃度為0.5~5jjmol/L，反應(yīng)體系中用量為220pmol;其中，所述引物為針對(duì)12個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的特異性引物，并在每對(duì)引物的反向鏈5'端加一段GTTCTT序列；其中11個(gè)位點(diǎn)是分布在第21、18、13號(hào)染色體和性別染色體上的STR位點(diǎn)，包括21號(hào)染色體的三個(gè)STR位點(diǎn)D21S11、D21S1411禾卩D21S1412;18號(hào)染色體的四個(gè)STR位點(diǎn)MBP、D18S535、D18S51禾口D18S386;13號(hào)染色體的三個(gè)STR位點(diǎn)D13S631、D13S634禾卩D13S317;X染色體的一個(gè)STR位點(diǎn)XHPRT;另選擇性別染色體上特異性的AMXY位點(diǎn)；上述位點(diǎn)可在人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)即GDB網(wǎng)站中査詢獲得；將所述引物分為三組，分別構(gòu)成三個(gè)反應(yīng)體系，其中，第一體系包括以下位點(diǎn)的引物MBP、AMXY、D13S631和D13S634;第二體系包括以下位點(diǎn)的弓l物D18S535、XHPRT、D21S11、D21S1411和D21S1412;第三體系包括以下位點(diǎn)的引物D18S51、D18S386禾卩D13S317。權(quán)利要求1、一種定量熒光PCR快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體的方法，其特征在于，包括以下步驟A.樣本的收集與處理樣本為外周血或孕婦產(chǎn)前樣本，包括孕16周以后采集的羊水，孕18周以后采集的臍帶血，或者孕13周前采集的絨毛，采用常規(guī)方法處理；B.DNA提取按常規(guī)苯酚-氯仿法提取前述樣本的DNA，用紫外分光光度儀測(cè)OD280及OD260值以確定濃度和純度，所需DNA純度要求OD260/OD280的值為1.6～1.8；C.引物設(shè)計(jì)和合成選擇分布在第21、18、13號(hào)染色體和性別染色體上的11個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)即STR位點(diǎn)，包括21號(hào)染色體的三個(gè)STR位點(diǎn)D21S11、D21S1411和D21S1412；18號(hào)染色體的四個(gè)STR位點(diǎn)MBP、D18S535、D18S51和D18S386；13號(hào)染色體的三個(gè)STR位點(diǎn)D13S631、D13S634和D13S317；X染色體的一個(gè)STR位點(diǎn)XHPRT；另選擇性別染色體上特異性的AMXY位點(diǎn)；上述位點(diǎn)可在人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)即GDB網(wǎng)站中查詢獲得；針對(duì)上述12個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)特異性引物，并在每對(duì)引物的反向鏈5’端加一段GTTCTT序列；用不同的熒光素對(duì)已合成的引物進(jìn)行標(biāo)記；D.第一體系和第二體系的PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行兩個(gè)反應(yīng)體系的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，第一體系包括以下位點(diǎn)的引物MBP、AMXY、D13S631和D13S634；第二體系包括以下位點(diǎn)的引物D18S535、XHPRT、D21S11、D21S1411和D21S1412。PCR擴(kuò)增體系如下DNA模板2～40ng引物2～20pmol熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶2U10×PCR緩沖液2.5μlMgCl21.5mmol/LdNTP200μmol/L加水至總體積25μlPCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性11分鐘，94℃變性1分鐘，59℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在60℃下延伸60分鐘；E.PCR產(chǎn)物的檢測(cè)將PCR產(chǎn)物按現(xiàn)有遺傳分析儀的操作說(shuō)明進(jìn)行處理，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小及熒光素的不同進(jìn)行區(qū)分，通過(guò)樣本DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的STR形式的定量分析，參照業(yè)內(nèi)制訂的分子遺傳學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，判斷被檢者的染色體的數(shù)目是正常的二體，還是異常的三體，或是暫不能判定其染色體數(shù)目的情況；F.第三體系的PCR擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)于步驟E中未能達(dá)到上述檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的樣本，再進(jìn)行第三體系的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，第三體系包括以下位點(diǎn)的引物D18S51、D18S386和D13S317；PCR擴(kuò)增體系和PCR擴(kuò)增條件均與步驟D相同；G.PCR產(chǎn)物的檢測(cè)與步驟E相同。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A中，外周血樣本的收集與處理為抽取1ml靜脈血，加枸櫞酸鈉抗凝后用于步驟B。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A中，羊水樣本的收集與處理為抽取的羊水在4000rpm離心10min,棄上清液，用生理鹽水洗滌沉淀一次，4000rpm離心10min，棄上清液，收集底部的細(xì)胞用于步驟B。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A中，臍帶血樣本的收集與處理為抽取lml臍帶血，加枸櫞酸鈉抗凝后用于步驟B。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A中，絨毛樣本的收集與處理為選出具有明顯分支結(jié)構(gòu)的絨毛組織，用生理鹽水洗滌二次，用于步驟B。6、一種定量熒光PCR快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體的試劑盒，其特征在于包括三種不同的反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)體系均含有以下試劑10XPCR緩沖液，含15mmol/LMgCI2，反應(yīng)體系中稀釋為1XPCR緩沖液；dNTP，濃度為10mmol/L，反應(yīng)體系中稀釋為200pmol/L;熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶，濃度為5U/|jl，反應(yīng)體系中用量為2U;引物，濃度為0.5~5|jmol/L，反應(yīng)體系中用量為220pmol;其中，所述引物為針對(duì)12個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的特異性引物，并在每對(duì)引物的反向鏈5'端加一段GTTCTT序列；其中11個(gè)位點(diǎn)是分布在第21、18、13號(hào)染色體和性別染色體上的STR位點(diǎn)，包括21號(hào)染色體的三個(gè)STR位點(diǎn)D21S11、D21S1411禾卩D21S1412;18號(hào)染色體的四個(gè)STR位點(diǎn)MBP、D18S535、D18S51禾QD18S386;13號(hào)染色體的三個(gè)STR位點(diǎn)D13S631、D13S634和D13S317;X染色體的一個(gè)STR位點(diǎn)XHPRT;另選擇性別染色體上特異性的AMXY位點(diǎn)；上述位點(diǎn)可在人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)即GDB網(wǎng)站中查詢獲得；將所述引物分為三組，分別構(gòu)成三個(gè)反應(yīng)體系，其中，第一體系包括以下位點(diǎn)的引物MBP、AMXY、D13S631和D13S634;第二體系包括以下位點(diǎn)的弓l物D18S535、XHPRT、D21S"、D21S1411禾口D21S1412;第三體系包括以下位點(diǎn)的引物D18S51、D18S386禾卩D13S317。全文摘要本發(fā)明涉及一種定量熒光PCR快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體的方法，包括樣本的收集與處理，DNA提取，引物設(shè)計(jì)和合成，第一體系和第二體系的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR產(chǎn)物的檢測(cè)，第三體系的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。本發(fā)明還提供了一種準(zhǔn)確、可靠的定量熒光PCR快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體三體的試劑盒。本發(fā)明結(jié)合了定量熒光PCR靈敏、精確的特點(diǎn)與短串聯(lián)重復(fù)序列分布廣、均勻、多態(tài)性、雜合度高的特點(diǎn)，可應(yīng)用在外周血及羊水、臍帶血、絨毛等產(chǎn)前樣本的常見(jiàn)染色體病數(shù)目的檢測(cè)上。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101550439SQ200810027138公開(kāi)日2009年10月7日申請(qǐng)日期2008年3月31日優(yōu)先權(quán)日2008年3月31日發(fā)明者孫筱放申請(qǐng)人:廣州醫(yī)學(xué)院