專利名稱：以大蒜為原料生產(chǎn)大蒜多糖和蒜氨酸酶的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物的提取、分離和純化領(lǐng)域，特別涉及到一種以鮮大蒜 為原料聯(lián)合制備蒜氮酸酶與大蒜多糖的方法。
背景技術(shù)：
大蒜(j〃/ w ^///vwm L.)多糖占大蒜干物質(zhì)的70%-80%，是大蒜含量 最高的成分，屬于果聚多糖。CN1239719A報(bào)道大蒜多糖的分子量為3500，含 量為80%的雜果聚糖，有希望代替珍貴的牛膝多糖用于醫(yī)藥。現(xiàn)已研究證實(shí) 了果聚多糖具有控制血脂、降低血糖、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、增殖腸道雙歧桿菌、 防便秘及治療肥胖癥等多種生理功能。最近還研究證實(shí)大蒜多糖具有保肝護(hù)肝 作用，對(duì)實(shí)驗(yàn)性小鼠病毒心肌炎有治療作用。因此，為發(fā)揮大蒜多糖的保健、 藥用價(jià)值，有必要對(duì)其工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)行研究。CN1555728、 CN1556102報(bào)道 了聯(lián)產(chǎn)大蒜精油和大蒜多糖、聯(lián)產(chǎn)蒜氨酸和大蒜多糖方面的專利，但在這些生 產(chǎn)技術(shù)中均未提到如何利用其中的重要生物活性物質(zhì)蒜氨酸酶，在這些生產(chǎn)技 術(shù)中，均將其作為雜質(zhì)或廢棄物丟掉了。蒜氨酸酶是一種糖蛋白，有二聚體，三聚體，四聚體等形式。它能催化大 蒜的蒜氨酸生成具有多種藥用和保健作用的大蒜素(烯丙基二硫亞砜)。研究 表明蒜氨酸酶對(duì)A549人肺腺癌和P388小鼠白血病有體外抗腫瘤活性，有 抗血小板凝聚作用。鑒于蒜氨酸酶的重要作用，可以利用蒜氨酸和蒜氨酸酶生 產(chǎn)治療腫瘤的復(fù)合膠囊或注射針劑;也可以利用蒜氨酸酶生產(chǎn)能夠檢測(cè)大蒜及 其制品中的蒜氨酸含量的新一代生物傳感器；以色列魏茨曼研究所科學(xué)家利用 蒜氨酸酶和蒜氨酸治療癌癥；蒜氨酸酶又稱C-S鍵裂解酶，有多種底物如S-甲基、S-乙基、S-丙基、S-丁基和S-烯丙基半胱氨酸亞砜都可作該酶的底物，S-烯丙基半胱氨酸亞砜即蒜氨酸酶是天然底物之一。由于蒜氨酸酶對(duì)C-S鍵裂 解的高度專一型和高活力，有望在相關(guān)的化學(xué)反應(yīng)或生化反應(yīng)中發(fā)揮巨大的作 用。雖然蒜氨酸酶具有很大的現(xiàn)實(shí)和潛在的利用價(jià)值，但是目前還沒(méi)有工業(yè)化 生產(chǎn)蒜氨酸酶方面的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種生產(chǎn)工藝，用同一批原料，同時(shí)生產(chǎn)蒜氨酸酶和大蒜 多糖兩種產(chǎn)品，以充分利用大蒜資源，盡可能多的提取大蒜中具有生物活性或 保健作用的天然產(chǎn)物，以滿足醫(yī)藥和保健品行業(yè)對(duì)蒜氨酸酶和大蒜多糖需求， 提高大蒜原料的利用率。為達(dá)上述目的，本發(fā)明的以大蒜為原料生產(chǎn)大蒜多糖和蒜氨酸酶的生產(chǎn)工 藝，包括如下步驟A、 預(yù)處理將大蒜用水浸泡，洗去雜質(zhì)，除去蒜皮；用打漿機(jī)將去皮大 蒜破碎得蒜漿液，過(guò)濾除去雜質(zhì)，濾渣用水洗滌，合并濾液得大蒜汁液；B、 分離蒜氨酸酶向上述大蒜汁液中加入酸溶液，并攪拌，使其pH降 至3 5，離心，得到的沉淀即為蒜氨酸酶粗品；將蒜氨酸酶粗品用磷酸鹽緩 沖溶液溶解，采用截留分子量為3 6萬(wàn)道爾頓的超濾設(shè)備超濾，除去小分子 雜質(zhì)，將截留液冷凍干燥后，即得到精制的蒜氨酸酶產(chǎn)品；C、 制取大蒜多糖提取液將步驟B中離心后的上清液分別通過(guò)陽(yáng)離子交 換樹(shù)脂柱和陰離子交換樹(shù)脂柱，或者直接將陰、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分別加入到大 蒜粗提液中，分離出陰、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂后得大蒜多糖提取液，調(diào)節(jié)所得大蒜 多糖提取液的pH至中性，經(jīng)活性炭吸附后得到精制的大蒜多糖提取液；D、 大蒜多糖產(chǎn)品的獲得在溫度為60 80"C的真空條件下，將大蒜多糖 精制液濃縮、干燥，得到白色的大蒜多糖產(chǎn)品。所述步驟A中，用打漿機(jī)將所述去皮大蒜破碎成粒度60 300目的蒜漿液。所述步驟B中，所述的酸為食用酸，以逐滴加入的形式加入到所述大蒜 粗提液中。所述酸優(yōu)選食用級(jí)鹽酸、醋酸、磷酸、檸檬酸或乳酸等。所述步驟B中，磷酸鹽緩沖溶液是pH為6.0 8.0的磷酸鹽緩沖溶液。 所述步驟C中，當(dāng)將所述上清液過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，控制流速為0.5 10mL/min*100克樹(shù)脂，樣品上樣后立即收取流出液，然后再將收取的流出 液通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂柱脫色，控制流速為0.5 10mL/min 100克樹(shù)脂，再用去離子水洗脫2 3個(gè)色譜柱體積，收集流出液和洗脫液，調(diào)節(jié)其pH至中 性，再通過(guò)活性炭吸附柱，或者用0.1 0.2%活性炭吸附20 24小時(shí)后，得 到精制的大蒜多糖溶液。所述步驟C中，當(dāng)直接將陰、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂先后加入到大蒜粗提液中 時(shí)，每公斤上清液先后分別添加100 600克陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和100 600克陰 離子交換樹(shù)脂，并分別在25 200 rpm的轉(zhuǎn)速下吸附0.5 5小時(shí)。所述步驟D中，采用噴霧干燥或烘房干燥得到大蒜多糖產(chǎn)品。采用本發(fā)明的生產(chǎn)工藝所得產(chǎn)品性質(zhì)的測(cè)定一、 大蒜多糖的提取率測(cè)定 參考專利文獻(xiàn)CN1555728二、 蒜氨酸酶活性測(cè)定 酶活性測(cè)定采用測(cè)丙酮酸法取蒜氨酸溶液lml，加入lml酶液，在25ml具塞試管中反應(yīng)3min后 立即加入2 ml 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，加入1 ml 2，4-二硝基苯肼，25 °C保 溫5 min，然后加入5 ml 2.5 mol/LNaOH，反應(yīng)10 min后于520 nm比色(以鈍化酶、底物、2，4-二硝基苯肼、NaOH反應(yīng)體系為參比液)。酶活性定義以在25"C條件下，每分鐘產(chǎn)生1 li mol丙酮酸為1個(gè)活力單位(U)。定義為一個(gè)酶活單位)經(jīng)測(cè)定，采用本發(fā)明的生產(chǎn)工藝所獲得蒜氨酸酶的比活為72U/mg;活力回收62%。本發(fā)明最大優(yōu)點(diǎn)之一是利用同一批原料生產(chǎn)蒜氨酸酶和大蒜多糖兩種有 價(jià)值的產(chǎn)品，目前未見(jiàn)有這兩種物質(zhì)綜合提取的研究報(bào)道，與過(guò)去利用大蒜原 料只生產(chǎn)大蒜精油(如CN1049272A)或只生產(chǎn)大蒜多糖(CN1239719A， JP10158306A)相比，充分地利用了大蒜資源；這在一定程度上降低了生產(chǎn)成 本，減輕了生產(chǎn)單一產(chǎn)品時(shí)造成的環(huán)境污染，可使生產(chǎn)企業(yè)比單獨(dú)生產(chǎn)大蒜多 糖的效益翻番。同聯(lián)合制備大蒜精油與大蒜多糖的方法(CN1555728)和聯(lián)合制 備蒜氨酸與大蒜多糖的方法(CN1556102)等已有的關(guān)于大蒜聯(lián)合提取有效成 分方面的專利相比，本技術(shù)路線首次提出了聯(lián)合提取蒜氨酸酶和大蒜多糖的方 法，因此，本發(fā)明具有極高的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值，填補(bǔ)了蒜氨酸酶工業(yè)化提取上的空白。其次，本發(fā)明的蒜氨酸酶的提取方法，只是通過(guò)改變pH值和離心的方法 便可以得到蒜氨酸酶的粗成品，方法簡(jiǎn)單，酶活力回收高，回收率達(dá)到62%， 可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖l是本發(fā)明的工藝流程圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但發(fā)明的實(shí)施方式 不限于此。實(shí)施例1:以新鮮大蒜為原料，聯(lián)合制備蒜氨酸酶與大蒜多糖的方法，具體按下述步驟進(jìn)行第一步進(jìn)行預(yù)處理將鮮蒜瓣置于質(zhì)量約為其6倍的飲用水中，浸泡2 小時(shí)，流動(dòng)水洗滌去皮，控干明水，置于打獎(jiǎng)機(jī)中破碎成粒度200目的蒜槳。 蒜漿用板式過(guò)濾機(jī)擠壓過(guò)濾。濾渣用水洗滌2 3次，合并濾液，取濾液備用。第二步分離蒜氨酸酶向所得蒜提取液中逐滴加入食用級(jí)鹽酸，并快速攪 拌，使提取液的pH降為3.0，離心，得到的沉淀用pH為6的磷酸鹽緩沖溶 液溶解，采用截留分子量為3 6萬(wàn)道爾頓的各種超濾膜超濾，將截留液冷凍 干燥后，即得到精制的蒜氨酸酶產(chǎn)品。第三步大蒜多糖粗提液的精制:將第二步中離心后的上清液過(guò)732型陽(yáng)離 子交換樹(shù)脂；控制流速為lml/min *100克樹(shù)脂，樣品上樣后立即收取流出液， 然后將其快速通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂，控制流速為lml/min 100克樹(shù)脂，再用 無(wú)離子水洗脫2 3個(gè)色譜柱體積，收集流出液和洗脫液，混合，加入適量的 NaHC03溶液，調(diào)節(jié)其pH為中性，再用0.1 0.2%活性炭吸附20 24小時(shí)后， 得到精制的大蒜多糖溶液。第四步獲得大蒜多糖產(chǎn)品在真空條件(溫度60°C)下，將精制大蒜多 糖溶液濃縮至多糖含量在35%，再進(jìn)行噴霧干燥，得白色粉狀的大蒜多糖。采用的噴霧壓力為0.25MPa，進(jìn)入噴霧塔的熱空氣溫度為160°C，出口溫度為 9tTC，所得干粉即為大蒜多糖。實(shí)施例2:以新鮮大蒜為原料，聯(lián)合制備蒜氨酸酶與大蒜多糖的方法，具體按下述步 驟進(jìn)行第一步進(jìn)行預(yù)處理將鮮蒜瓣置于質(zhì)量約為其4倍的飲用水中，浸泡2 小時(shí)，流動(dòng)水洗滌去皮，控干明水，置于打漿機(jī)上破碎成粒度300目的蒜漿。 蒜漿用板式過(guò)濾機(jī)擠壓過(guò)濾。濾渣用水洗滌2 3次，合并濾液，取濾液備用。第二步分離蒜氨酸酶向所得蒜提取液中逐滴加入磷酸，并快速攪拌，使 提取液的pH降為5.0，離心，得到的沉淀用pH為6的磷酸鹽緩沖溶液溶解， 采用截留分子量為3 6萬(wàn)道爾頓的各種超濾膜超濾，將截留液冷凍干燥后， 即得到精制的蒜氨酸酶產(chǎn)品。第三步大蒜多糖粗提液的精制:將第二步中離心后的上清液過(guò)732型陽(yáng)離 子交換樹(shù)脂；控制流速為5ml/min *100克樹(shù)脂，樣品上樣后立即收取流出液, 然后將其快速通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂脫色，控制流速為5ml/min 100克樹(shù)脂， 再用無(wú)離子水洗脫2 3個(gè)色譜柱體積，收集流出液和洗脫液，加入適量的 NaHC03溶液，調(diào)節(jié)其pH為中性，再通過(guò)活性炭吸附柱后，得到精制的大蒜 多糖溶液。第四步獲得大蒜多糖產(chǎn)品在真空條件(溫度70°C)下，將精制大蒜多 糖溶液濃縮至多糖含量在50%，再進(jìn)行噴霧干燥，得白色粉狀的大蒜多糖。 采用的噴霧壓力為0.25MPa，進(jìn)入噴霧塔的熱空氣溫度為160°C，出口溫度為 卯"C，所得干粉即為大蒜多糖。實(shí)施例3:以新鮮大蒜為原料，聯(lián)合制備蒜氨酸酶與大蒜多糖的方法，具體按下述步 驟進(jìn)行第一步進(jìn)行預(yù)處理將鮮蒜瓣置于質(zhì)量約為其3倍的飲用水中，浸泡2小時(shí)，流動(dòng)水洗滌去皮，控干明水，置于打漿機(jī)上破碎成粒度300目的蒜漿。 蒜漿用板式過(guò)濾機(jī)擠壓過(guò)濾。濾渣用水洗滌2 3次，合并濾液，取濾液備用。8第二步分離蒜氨酸酶向蒜提取液中逐滴加入檸檬酸或乳酸，并快速攪拌， 使提取液的pH降為4，離心，得到的沉淀用pH為7的磷酸鹽緩沖溶液溶解，采用截留分子量為3 6萬(wàn)道爾頓的各種超濾膜超濾，將截留液冷凍干燥后，即得到精制的蒜氨酸酶產(chǎn)品。第三步大蒜多糖粗提液的精制將第二步中離心后的上清液過(guò)732型陽(yáng)離 子交換樹(shù)脂；控制流速為H)ml/min 100克樹(shù)脂，樣品上樣后立即收取流出 液，然后將其快速通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂脫色，控制流速為10ml/min 100克樹(shù) 脂，再用無(wú)離子水洗脫2 3個(gè)色譜柱體積，收集流出液和洗脫液，加入適量 的NaOH溶液，調(diào)節(jié)其pH為中性，再通過(guò)活性炭吸附柱，或者用0.1 0.2 %活性炭吸附20 24小時(shí)后，得到精制的大蒜多糖溶液。第四步獲得大蒜多糖產(chǎn)品在真空條件(溫度60°C)下，將精制大蒜多 糖溶液濃縮至多糖含量在75%，再進(jìn)行噴霧干燥，得白色粉狀的大蒜多糖。 采用的噴霧壓力為0.25MPa，進(jìn)入噴霧塔的熱空氣溫度為160°C，出口溫度為 90°C，所得干粉即為大蒜多糖。實(shí)施例4:以新鮮大蒜為原料，聯(lián)合制備蒜氨酸酶與大蒜多糖的方法，具體按下述步 驟進(jìn)行第一步進(jìn)行預(yù)處理將鮮蒜瓣置于質(zhì)量約為其4倍的飲用水中，浸泡2 小時(shí)，流動(dòng)水洗滌去皮，控干明水，置于打漿機(jī)上破碎成粒度300目的蒜漿。 蒜漿用板式過(guò)濾機(jī)擠壓過(guò)濾。濾渣用水洗滌2 3次，合并濾液，取濾液備用。第二步分離蒜氨酸酶向所得蒜提取液中逐滴加入磷酸或醋酸，并快速攪 拌，使提取液的pH降為5.0,離心，得到的沉淀用pH為6的磷酸鹽緩沖溶 液溶解，采用截留分子量為3 6萬(wàn)道爾頓的超濾膜超濾，將截留液冷凍干燥 后，即得到精制的蒜氨酸酶產(chǎn)品。第三步大蒜多糖粗提液的精制以陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、陰離子交換樹(shù)脂、上 清液的體積比為1:1:8的比例，將陽(yáng)離子交換樹(shù)脂加入到第二步離心后的上清 液中；在100rpm的轉(zhuǎn)速下吸附2.5小時(shí)，分離出陽(yáng)離子交換樹(shù)脂后，再將陰離 子交換樹(shù)脂加入到提取液中，在100rpm的轉(zhuǎn)速下吸附2.5小時(shí)，分離出陰離 子交換樹(shù)脂后，調(diào)節(jié)提取液pH為中性，再通過(guò)活性炭吸附柱，或者用0.1 0.2%活性炭吸附20 24小時(shí)后，得到精制的大蒜多糖溶液。第四步獲得大蒜多糖產(chǎn)品在真空條件(溫度70。C)下，將精制大蒜多 糖溶液濃縮至多糖含量在50%，再進(jìn)行噴霧干燥，得白色粉狀的大蒜多糖。 采用的噴霧壓力為0.25MPa，進(jìn)入噴霧塔的熱空氣溫度為160°C，出口溫度為 90°C，所得干粉即為大蒜多糖。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí) 施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、 替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種以大蒜為原料生產(chǎn)大蒜多糖和蒜氨酸酶的生產(chǎn)工藝，其特征在于包括如下步驟A、預(yù)處理將大蒜用水浸泡，洗去雜質(zhì)，除去蒜皮；用打漿機(jī)將去皮大蒜破碎得蒜漿液，過(guò)濾除去雜質(zhì)，濾渣用水洗滌，合并濾液得大蒜汁液；B、分離蒜氨酸酶向上述大蒜汁液中加入酸溶液，并攪拌，使其pH降至3～5，離心，得到的沉淀即為蒜氨酸酶粗品；將蒜氨酸酶粗品用磷酸鹽緩沖溶液溶解，采用截留分子量為3～6萬(wàn)道爾頓的超濾設(shè)備超濾，除去小分子雜質(zhì)，將截留液冷凍干燥后，即得到精制的蒜氨酸酶產(chǎn)品；C、制取大蒜多糖提取液將步驟B中離心后的上清液分別通過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱和陰離子交換樹(shù)脂柱，或者直接將陰、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂先后加入到大蒜粗提液中，分離出陰、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂后得大蒜多糖提取液，調(diào)節(jié)所得大蒜多糖提取液的pH至中性，經(jīng)活性炭吸附后得到精制的大蒜多糖提取液；D、大蒜多糖產(chǎn)品的獲得在溫度為60～80℃的真空條件下，將大蒜多糖精制液濃縮、干燥，得到白色的大蒜多糖產(chǎn)品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟A中，用打漿 機(jī)將所述去皮大蒜破碎成粒度60 300目的蒜漿液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于步驟B中，所述的酸為食用酸，以逐滴加入的形式加入到所述大蒜粗提液中。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述酸是指食用級(jí)鹽酸、醋酸、磷酸、檸檬酸或乳酸。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于步驟B中，所述磷酸鹽緩沖溶液是pH為6.0 8.0的磷酸鹽緩沖溶液。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟C中，將所述 上清液過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，控制流速為0.5 10mL/min.l00克樹(shù)脂，樣品上 樣后立即收取流出液，然后再將收取的流出液通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂柱脫色，控 制流速為0.5 10mL/min 100克樹(shù)脂，再用去離子水洗脫2 3個(gè)色譜柱體積， 收集流出液和洗脫液，調(diào)節(jié)其pH至中性，再通過(guò)活性炭吸附柱，或者用(U 0.2%活性炭吸附20 24小時(shí)后，得到精制的大蒜多糖溶液。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟C中，直接將陰、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂先后加入到大蒜粗提液中時(shí)，每公斤上清液先后分別添加100 600克陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和100 600克陰離子交換樹(shù)脂，并分別在25 200 rpm的轉(zhuǎn)速下吸附0.5 5小時(shí)。
8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述步驟D中，采用噴 霧干燥或烘房干燥得到大蒜多糖產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明以新鮮大蒜為原料，通過(guò)洗滌、去雜、破碎取汁、過(guò)濾、調(diào)節(jié)汁液pH值，離心得到粗蒜氨酸酶，再經(jīng)溶解、超濾、冷凍干燥獲得高純度的蒜氨酸酶產(chǎn)品；離心后的上清液過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱和陰離子交換樹(shù)脂柱得大蒜多糖精制液，再經(jīng)過(guò)濃縮、氣流干燥等工序得到高純度的大蒜多糖產(chǎn)品。本發(fā)明利用同一批原料生產(chǎn)蒜氨酸酶、大蒜多糖兩種有價(jià)值的活性物質(zhì)，大大提高了大蒜資源的利用率，減輕了生產(chǎn)單一產(chǎn)品時(shí)造成的環(huán)境污染，降低了制造成本，可使采用本發(fā)明技術(shù)的生產(chǎn)企業(yè)比單獨(dú)生產(chǎn)大蒜多糖或蒜氨酸酶的效益成倍增長(zhǎng)。
文檔編號(hào)C12N9/88GK101255200SQ200810027309
公開(kāi)日2008年9月3日 申請(qǐng)日期2008年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月9日
發(fā)明者孔祥智, 黃雪松 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)