專利名稱：呼吸道合胞病毒實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，特別是涉及利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)呼吸道合胞病毒 (Respiratory Sycytial Virus, RSV)的試劑盒。試劑盒通過對(duì)樣本中的呼吸道合胞病毒進(jìn) 行定量檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于呼吸道合胞病毒感染的輔助診斷。
背景技術(shù)：
呼吸道合胞病毒(Respiratory Sycytial Virus, RSV)是引起嬰幼兒下呼吸道感染最常 見的病毒，主要通過呼吸道侵入人體，并通過空氣(飛沫、塵埃)傳播':，病毒主要在鼻咽上皮 細(xì)胞中增殖。呼吸道合胞病毒是5歲以內(nèi)兒童病毒性肺炎的最主要病原體，也是嬰兒猝死的病 因之一。兒童對(duì)RSV普遍易感，且冉感染率很高。成人急性感染也很常見，老年人可引起嚴(yán)重 肺炎，并發(fā)展為成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)。 RSV感染癥狀主要包括咳嗽、鼻塞、流涕、咽喉 不適等呼吸道局部癥狀和發(fā)熱、乏力、頭痛、肌肉酸痛等全身癥狀。嬰幼兒常伴發(fā)熱，氣急。 X線胸片常顯示明顯的支氣管肺炎和/或毛細(xì)支氣管炎表現(xiàn)。在成人和'一長兒，感染可能不明 顯或僅表現(xiàn)為無熱性h呼吸道感染(普通感冒)。多種病毒性肺炎之間依靠臨床癥狀幾乎無法 區(qū)別。
目前臨床使用的商品化試劑盒主要采用免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，如鼻咽分泌物等標(biāo)本中特 異抗原檢測(cè)或是血清中抗休檢測(cè)。常見的快速膠體金法檢測(cè)時(shí)間短，但靈敏度低；免疫熒光 法進(jìn)行抗原檢測(cè)時(shí)對(duì)于低濃度感染樣本的檢測(cè)效果不理想[Casiano-Colon, A. E. ， B. B. Hulbert, et aL (2003). "Lack of sensitivity of rapid antigen tests for the diagnosis of respiratory syncytial virus infection in adults." J Clin Virol 28(2): 169-74. Rabagliati， R., M. Serri, et al. (2007). "[Utility of real time polymerase chain reacUon in the diagnosis of respiratory syncytial virus infection among adult patients]." Rev Chilena InfecLol 24(6): 441-5.],需經(jīng)病毒培養(yǎng)后再進(jìn)行檢測(cè)，且對(duì)于 操作人員要求較高，存在非特異染色等問題。病毒培養(yǎng)又需要有活病毒存在才能實(shí)現(xiàn)，且操 作繁瑣。有研究表明，檢測(cè)了兒童血清RSV特異免疫球蛋白G， M， A，其靈敏度遠(yuǎn)低于病毒分 離和抗原檢測(cè)[Meddens， M. J. ， P. Herbrink, et al. (1990). 〃Serodiagnosi s of respiratory syncytial v丄rus (RSV) infection in children as measured by detection of KSV-specific immunoglobulins G， M， and A with enzyme-linked immunosorbent assay." J Clin Microbiol 28(1): 152-5.]。
利用PCR方法可以直接檢測(cè)病毒核酸，靈敏度更高。2008年1月，F(xiàn)DA通過第一個(gè)利用多重PCR方法，基于Luminex xTAG 技術(shù)，檢測(cè)包括呼吸道合胞病毒在內(nèi)的多種呼吸道病毒核酸 檢測(cè)試劑盒(xTAG RVP試劑盒)[Mahony， J. ， S. Chong, et al. (2007). "Development of a respiratory virus panel test for detection oi' twenty human respiratory viruses by use of multiplex PCR and a fluid microbead-based assay." ,J Clin Microbiol 45(9): 2965-70]，該方法主要是在提取病毒核酸RNA或/和DNA后，經(jīng)混合逆轉(zhuǎn)錄，再使用14對(duì)病毒特 異引物進(jìn)行多重PCR;擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)處理，與含有teg序列的21對(duì)引物再進(jìn)行多重革巴特異引物延 伸(TSPE)反應(yīng)；其后，TSPE產(chǎn)物與標(biāo)記有anti-tag序列的帶不同熒光微球反應(yīng)，通過L咖inex 100流式細(xì)胞檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄并分析得到結(jié)果。 ';'
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是上世紀(jì)90年代中期基于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)發(fā)展起來的。與傳統(tǒng)的PCR 技術(shù)(終點(diǎn)檢測(cè))相比，實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)方法不僅實(shí)現(xiàn)了低拷貝數(shù)靶多核苷酸的定量分析，而 且還具有特異性和精確度更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高以及污染的可能性更小等優(yōu)點(diǎn)，已在多個(gè)領(lǐng) 域得到應(yīng)用。 一步法RT-PCR只要加入RNA和特異性引物即可實(shí)現(xiàn)在同反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行 RNA—cDNA—PCK反應(yīng)，中途不需加入任何試劑，在處理大量樣品時(shí)易于操作，有助于減少殘 余污染，因?yàn)樵赾DNA合成和擴(kuò)增之間不需要打開管蓋。 一步法可以得到更高的靈敏度，最低 可以達(dá)到O. lpg總RNA，與上述技術(shù)相比，操作更簡單，只需2小時(shí)即可完成全部檢測(cè)。
本發(fā)明設(shè)計(jì)的試劑盒通過對(duì)RSV核酸進(jìn)行直接檢測(cè)和定量研究，有利于加深對(duì)這種病毒的 認(rèn)識(shí)，不僅對(duì)于了解患病程度、預(yù)測(cè)、評(píng)價(jià)治療效果有十分重要意義，而且使得病毒感染發(fā) 病機(jī)制的研究進(jìn)入量化階段，為新藥的研究與試用提供極為重要的研究手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在丁提供一種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR--步法檢測(cè)呼吸道合胞病毒的試劑盒(下面 簡稱一步法試劑盒)，該試劑盒包括(1) RNA提取試劑、RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR反應(yīng)酶系、 經(jīng)焦炭酸乙二脂(DEPC)處理的純水、定量參考品、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品，和(2)分隔 并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。
為了解決上述任務(wù)，本發(fā)明的具體技術(shù)路線為
(1) 針對(duì)呼吸道合胞病毒保守序列設(shè)計(jì)的能夠與靶多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物和寡 核苷酸探針。
(2) 寡核苷酸探針標(biāo)記熒光發(fā)生基團(tuán)，使所說的熒光發(fā)生基團(tuán)與被擴(kuò)增的靶多聚核苷 酸間接結(jié)合。
(3) 適宜于RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和熒光檢測(cè)體系。核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄酶、 耐熱DNA聚合酶、2'-脫氧核苷三磷酸、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第-了條鏈結(jié)合的正向引物、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物、能夠與靶多聚核苷酸結(jié)合并且兩木端 分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針、含有鎂離子的緩沖液。
(4) 從待測(cè)樣本中提取RNA,加入前述的反應(yīng)體系中，直接經(jīng)一歩法KT-P(;R擴(kuò)增。
(5) 確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，分析循環(huán)擴(kuò)增后產(chǎn)生的熒光量以確定靶多核 苷酸的存在及定量。并將已確定的樣品中靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中已知量靶多 核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，以計(jì)算出樣品中耙多核苷酸的量。
根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，其中一步法試劑盒的RT-PCR反應(yīng)液由5XRTPCR緩沖 液、正向引物、反向引物、寡核苷酸探針、DEPC水組成，其特征在于用于單B多核苷酸擴(kuò)增的 正向禾卩反向弓l物的序歹lj分另lj是5， 一TGGAAACATACGTGAACAAGC —3' (SEQ ID NO: 1)和5， 一 ACATGGGCACCCATATTGTA _ 3' (SEQ ID NO: 2)，用于耙多核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測(cè)休系的寡核 苷酸探針的序列是5' X- TCCACATACACAGCTGCTGTTCAAT-Y 3， )(SEQ II) NO: 3)，其中 X/Y表示熒光標(biāo)記檢測(cè)體系，包括能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基 團(tuán)和熒光淬火基團(tuán)的寡核苷酸探針。RT-PCR反應(yīng)酶系包含逆轉(zhuǎn)錄酶niMLV、 Taq酶和RNA酶抑制 劑(RNasin)。
根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，其中經(jīng)焦炭酸乙二脂(DEPC)處理的純水用于病毒 核酸溶解或者無RNase相關(guān)試劑的配制。 "
本發(fā)明所述的一步法試劑盒中的定量參考品用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過將樣品中靶多核苷 酸的閾循環(huán)次數(shù)與已知量靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，計(jì)算出樣品中靶多核苷酸的量。 其中定量參考品為體外轉(zhuǎn)錄RNA或經(jīng)滅活的利用空斑減數(shù)實(shí)驗(yàn)定量的病毒培養(yǎng)液。
建立體外轉(zhuǎn)錄RNA的技術(shù)路線如下使用引物5' -TTGGAAGGGAATGATAGTGAC-3' (SEQ ID NO: 4)和引物5' - ATTTGCTGGGCATTTGTG -3， (SEQ ID NO: 5)定性lf增病毒核酸，擴(kuò)增產(chǎn) 物純化后克隆至pGEM-T載體中，陽性克隆測(cè)序確定目的片段是否JT.確插入并確定插入方向。 提取重組質(zhì)粒pGEM-T-hMPV質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)，割膠純化后得到模板，用于體外轉(zhuǎn)錄。體外轉(zhuǎn) 錄后消化DNA模板,進(jìn)行RNA純化，得到RSV-RNA。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法如下紫外分光光度計(jì) 測(cè)定A260，對(duì)RSV-RNA進(jìn)行定量，使用DEPC處理水依次進(jìn)行10倍稀釋，_濃度范圍為].0:1 107拷 貝/ml,制備定量參考品，各濃度梯度RNA同時(shí)進(jìn)行一步法檢測(cè)，計(jì)算并繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過 比較待測(cè)樣品和定量參考品的循環(huán)域值實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量。
其屮，定量參考品包含下列序列或80%同源的核苷酸序列TGCTAGCACAAATGCCCAGCAAAT 。
建立定量滅活病毒培養(yǎng)液的技術(shù)路線如下病毒株，呼吸道合,胞病毒標(biāo)準(zhǔn)病毒株A型 (Long株/CCTCC編號(hào)GDV052)購自武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心；細(xì)胞株Hela細(xì)胞。細(xì) 胞培養(yǎng)病毒增毒擴(kuò)增，空斑減數(shù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行PFU測(cè)定，染色，計(jì)算，確定病毒濃度。建立標(biāo)準(zhǔn)曲 線的方法如下根據(jù)病毒定量結(jié)果，使用DEPC處理水依次進(jìn)行10倍稀釋，濃度范圍為10' 107PFU/ml，制備定量參考品，使用各濃度梯度病毒液與待測(cè)樣本同時(shí)進(jìn)行核酸提取，并進(jìn)行 一步法檢測(cè)，計(jì)算并繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過比較待測(cè)樣品和定量參考品.的循環(huán)域值實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè) 樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量。
本發(fā)明所述的一歩法試劑盒中的陰性質(zhì)控品為生理鹽水、正常人或其它病毒感染的鼻咽 分泌物樣本，陽性質(zhì)控品為體外轉(zhuǎn)錄RNA或RSV陽性的鼻咽分泌物樣本，用于實(shí)際檢測(cè)中的質(zhì) 量控制。
根據(jù)本發(fā)明提供的一步法試劑盒，對(duì)呼吸道合胞病毒進(jìn)行檢測(cè)，'該方法包括下列歩驟 用RNA提取試劑進(jìn)行陰、陽性質(zhì)控品、或/和定量參考品、待測(cè)樣本(痰液、鼻咽抽提液 或咽拭子抽提液)的RNA提取。RNA提収試劑除本發(fā)明提及的方法外，還可以使用其它成熟的 RNA提取力、法和試劑盒。
將提取的RNA和定量參考品加入到含有RT-PCR反應(yīng)液和RT-PCR反應(yīng)酶系的RT-PCR反應(yīng)管 中，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，使用熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。
利用定量參考品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線通過軟件分析確定待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的濃度。 根據(jù)本發(fā)明提供的用于呼吸道合胞病毒檢測(cè)的一步法試劑盒，其定量的機(jī)理為有一條兩 端標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的特異性熒光探針，它設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物 之間的序列配對(duì)。熒光基團(tuán)連接在探針的5'末端，而淬滅基團(tuán)則在3'末端。當(dāng)完整的 探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3'端的淬滅基團(tuán)接近而被淬滅。但在進(jìn) 行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5'外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅基閉分離。 隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈 正比關(guān)系。對(duì)呼吸道合胞病毒的定量可以與定量參考品的循環(huán)域值(CT， Threshold cycle) 比較得出，利用定量參考品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接得到待測(cè)樣本的起始濃度。
本發(fā)明所述的一步法試劑盒，除使用空斑減數(shù)方法直接對(duì)病毒細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行定量外， 還提供另一方法使用體外轉(zhuǎn)錄RSV-RNA定量后制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于待測(cè)樣本的核酸絕對(duì)定量;此外，針對(duì)呼吸道合胞病毒檢測(cè)中的特殊性，對(duì)反應(yīng)體系中引物探針濃度、Mg2+濃度，退火溫 度等均進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)合熒光定量RT-PCR技術(shù)，用于呼吸道合胞病毒的定量檢測(cè)，通過優(yōu)化 方案，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了定量檢測(cè)呼吸道合胞病毒的方法，并研制出用于呼吸道合胞病毒核 酸定量檢測(cè)的試劑盒，其中一步法試劑盒檢測(cè)標(biāo)本的靈敏度至少可達(dá)到5X 102PFU/ml。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有下列優(yōu)點(diǎn)
(1) 靈敏度更高；
(2) 全封閉反應(yīng)，提取病毒RNA后，直接用十RT-PCR檢測(cè)，避免了污染發(fā)牛.；
(3) 檢測(cè)速度快，整個(gè)過程僅需2小時(shí)；
(4) 操作簡單，可控性強(qiáng)，可進(jìn)行大批量樣品檢測(cè)，有利于產(chǎn)業(yè)化。


圖l顯不一步法試劑盒檢測(cè)呼吸道合胞病毒的條件設(shè)置。
圖2顯示一步法試劑盒檢測(cè)呼吸道合胞病毒時(shí)不同濃度樣本的擴(kuò)增曲線，三個(gè)標(biāo)本的Ct
值均小于27，擴(kuò)增曲線為S形，均能夠判定為陽性。
圖3顯示一步法試劑盒五個(gè)陰性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線，均不具S形特fiL能夠判定為陰性。 圖4顯示一歩法試劑盒兩個(gè)陰性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線，與熒光檢測(cè)閾值線沒有交點(diǎn)，能夠判
定為陰性。
圖5顯示一步法試劑盒定量檢測(cè)時(shí)的擴(kuò)增曲線，針對(duì)模板數(shù)為l(f 107pFU/ml進(jìn)行RT-PCR 分析。
圖6顯示一歩法試劑盒定量檢測(cè)時(shí)Std curve窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線 相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.991。
圖7顯示陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。圖示擴(kuò)增曲線為S型曲線，且CT值〈27，說明檢測(cè)體系有 效擴(kuò)增了呼吸道合胞病毒核酸。
圖8顯示陰性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線。圖示擴(kuò)增曲線為較平直的折線，與熒光檢測(cè)閾值線沒有交 點(diǎn)，且曲線不呈S型，說明檢測(cè)過程中沒有呼吸道合胞病毒核酸的污染。
具體實(shí)施例方式
下列實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。 實(shí)施例1:呼吸道合胞病毒的一步法試劑盒檢測(cè)方法 (1)標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存
由臨床醫(yī)師根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行標(biāo)本采集。常見標(biāo)本采集方式有以下幾種拭子浸入4-5 ml 采樣液中，密封送檢；痰標(biāo)本采集后應(yīng)立即送檢，或保存于-2(TC待測(cè)?？蓹z測(cè)的標(biāo)本包括，痰液、咽拭子和支氣管肺泡灌洗液。采集方法如下①痰液自然咳痰或誘導(dǎo)吸痰(如，氧 氣正壓法、 一次性嬰兒吸痰管法和霧化蒸氣吸入法)，吸取痰液，密封送檢；②鼻咽拭子用 拭子擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，避免接觸舌部、或沿平行鼻甲的方向?qū)⑹米硬迦氡乔?，在?定深度時(shí)停留幾秒鐘以蘸取分泌物.兩側(cè)鼻腔均應(yīng)取樣，將拭子浸入4-5ml采樣液中，密封送 檢；③支氣管肺泡灌洗液由臨床醫(yī)生收集支氣管肺泡灌洗液約lml，密封送檢。標(biāo)本可立即 用于測(cè)試，也可以保存于-7(TC待測(cè)，保存期為6個(gè)月。標(biāo)本運(yùn)送采用(TC冰壺
(2) 核酸提取
向新的經(jīng)高壓滅菌處理過的1.5ml離心管中加入10" 1充分浪勻的RNA提取液A(為 DEPC.H20稀釋，并高壓滅菌后的10XSi02; RNA提取液A易沉淀，取樣前需用移液器反復(fù)吸打混 勻后吸取)。然后加入200y 1的RNA提取液B (為異硫氰酸胍堿溶液)充分混勻。室溫放置5分 鐘后，8000轉(zhuǎn)/分(rpm)離心1分鐘，棄上清；重復(fù)加入200u 1的RNA提取液B充分混勻，8000 轉(zhuǎn)/分(rpm)離心1分鐘，棄上清；用75%的預(yù)冷乙醇(用DEPC水配制)洗沉淀兩次(取75% 乙醇400ul洗沉淀，充分震蕩混勻，8000轉(zhuǎn)/分(rpm)離心1分鐘后去上清后再用75%乙醇400 ixl洗一次)，65'C干燥并沉淀5分鐘。其中，配制75%乙醇時(shí)須使用試劑盒中提供的焦碳酸二 乙酯處理的純水(DEPC H20)。
在沉淀管加入25iil DEPC水，混懸沉淀物。處理過的樣品可直接用于后續(xù)RT-PCR檢測(cè) 或于-2(TC保存。若保存一個(gè)月以上，最好存于-7(TC。 .，
RNA提取試劑除本發(fā)明提及的方法外，還可以使用其他成熟的RNA提取方法和試劑。
(3) RT-PCR檢測(cè)
取10ul上述核酸溶液加入至RT-PCR反應(yīng)液中，3000rpm離心2分鐘，熒光定量PCR上機(jī)。 RT-PCR循環(huán)條件是40°C 30分鐘一94度3分鐘一(預(yù)擴(kuò)增步驟)93度45秒，55度60秒，IO個(gè) 循環(huán)一93度30秒，55度(讀熒光)45秒，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；或40。C 30分鐘一93度30秒，55度(讀 熒光)45秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(參見附圖l)。選擇熒光定量PCR儀上FAM/TAMRA通道進(jìn)行熒光信 號(hào)檢測(cè)。
(4) 結(jié)果分析
根據(jù)擴(kuò)增曲線設(shè)置Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值(start值 可以在1 10、 stop值可以在5 20、 Value值可以在0.01 0.2范圍'選擇)，在Analysis菜 單下選擇Analyze自動(dòng)分析結(jié)果。
(5) 結(jié)果判定
擴(kuò)增曲線呈S形，且CT值小于37 (或增加預(yù)擴(kuò)增歩驟時(shí)為27)，待檢樣本判為呼吸道合 胞病毒陽性(參見附圖2);
8擴(kuò)增曲線不呈S形，或CT值人于37 (或增加預(yù)擴(kuò)增步驟時(shí)為27)，待檢樣本判為呼吸道 合胞病毒陰性(參見附圖3和附圖4)。
實(shí)施例2:呼吸道合胞病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒中定量參考品和質(zhì)控品的配制及使用
呼吸道合胞病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒中定量參考品為體外轉(zhuǎn)錄RNA或滅活定量病毒細(xì)胞 培養(yǎng)液，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)待檢樣本進(jìn)行準(zhǔn)確定量，體外轉(zhuǎn)錄RM可直接用于RT-PCR檢測(cè)， 而滅活定量病毒細(xì)胞培養(yǎng)液操作方法同待檢樣本；質(zhì)控品包括陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，用 于臨床試驗(yàn)中質(zhì)量控制，操作方法同待檢樣本。
經(jīng)一歩法擴(kuò)增后，保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)分析參數(shù)使標(biāo)準(zhǔn)曲線(Std curve)窗U下的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖達(dá)到最佳(即相關(guān)性(correlation)數(shù)值<-0.95)。最后由儀 器自動(dòng)分析裝置計(jì)算出未知標(biāo)本的測(cè)定數(shù)值(Qty),即標(biāo)本中呼吸道佘胞病毒的RNA含量。其 中一步法定量參考品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增曲線參見附圖5，其標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)信息參見附圖6。
質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)要求在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足以下條件——陽性質(zhì)控品為陽性(參見附圖 7)、陰性質(zhì)控品為陰性(參見附圖8)、定量參考品制備得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)大于0.95; 否則，結(jié)果無效，需重新檢測(cè)。
以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明 的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本 發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范闈。序列表
<110>中山大學(xué)達(dá)安基岡股份有限公司
〈120〉呼吸道合胞病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒
<140>
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<160〉5
〈210〉 1 <211> 21 〈212〉 ■ 〈213〉人工序列 <220>
〈223〉根據(jù)特定核昔酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 〈400> 1
tggaaacatacgtgaacaagc
〈210> 2 <211〉 20 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220>
〈223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400〉 2
acatgggcacccatattgta
<210> 3 <211> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220〉<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以W作PCR擴(kuò)增的探針。 <400〉 3
tccacatacacagctgctgttcaat
〈210〉 4 《211〉 21 <212>醒 <213>人.T:序列 〈220>
〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400〉 4
ttggfuiggg朋tg3tagtg3c
<210> 5 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <220〉
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PC財(cái)廣增的引物。 <400〉 5
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權(quán)利要求
1、一種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR一步法檢測(cè)呼吸道合胞病毒的試劑盒，該試劑盒包括(1)RNA提取試劑、RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR反應(yīng)酶系、經(jīng)焦炭酸乙二脂(DEPC)處理的純水、定量參考品、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中RT-PCR反應(yīng)液由5×RT-PCR緩沖液、正向引物、反向引物、寡核苷酸探針、DEPC水組成，其特征在于用于靶多核苷酸擴(kuò)增的正向和反向引物的序列分別是5’-TGGAAACATACGTGAACAAGC-3’和5’-ACATGGGCACCCATATTGTA-3’。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征還在于用于靶多核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測(cè)體系的寡核苷酸 探針的序列是5' X-TCCACATACACAGCTGCTGTTCAAT - Y 3，，其中X/Y表示熒光標(biāo)記檢測(cè)體系， 包括能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷 酸探針。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征還在于陰性質(zhì)控品為生理鹽水、iH常人或其它病毒 感染的鼻咽分泌物樣本，陽性質(zhì)控品為體外轉(zhuǎn)錄RNA或呼吸道合胞病毒陽性的鼻咽分泌物樣 本。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征還在于RT-PCR反應(yīng)酶系包含逆轉(zhuǎn)錄酶niMLV、 Taq酶和 RNA酶抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，特別是涉及利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)呼吸道合胞病毒(Respiratory Sycytial Virus，RSV)的試劑盒。試劑盒通過對(duì)樣本中的呼吸道合胞病毒進(jìn)行定量檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于呼吸道合胞病毒感染的輔助診斷。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101580883SQ20081002807
公開日2009年11月18日 申請(qǐng)日期2008年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月14日
發(fā)明者瑰 何, 何蘊(yùn)韶, 明 李, 王方金, 鋼 程 申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司