專利名稱：一種檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留試紙的制備及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域具體涉及一種檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留試紙的制備及其使用方法。
背景技術(shù)：
目前，農(nóng)藥殘留已成為威脅食品安全的重大問題。加大農(nóng)藥殘留檢測(cè)力度，加強(qiáng)市場(chǎng)上 蔬菜水果等食品農(nóng)藥殘留的監(jiān)控顯得非常迫切。農(nóng)藥殘留分析傳統(tǒng)上主要采用氣相色譜、氣 相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和高效液相色譜等技術(shù)，能較準(zhǔn)確測(cè)出殘留量，但需要大型儀器，前處理 操作繁瑣，需受過專門訓(xùn)練的人員才可掌握，而且儀器不方便攜帶移動(dòng)，很難適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)簡(jiǎn)單 快速和大數(shù)量樣品殘留分析的要求。所以快速簡(jiǎn)便，成本低廉的速測(cè)技術(shù)檢測(cè)蔬菜水果中農(nóng) 藥殘留勢(shì)在必行。近年來，國(guó)內(nèi)這方面申請(qǐng)的專利很多，有利用抗原抗體的方法，如"用于
檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的免疫抗體及其應(yīng)用"(200410041895. X)、有通過氧化發(fā)光和測(cè)定光譜 進(jìn)行比色的方法，如"化學(xué)發(fā)光有機(jī)磷農(nóng)藥殘留分析儀及其檢測(cè)方法"(200510041791.3)、
"一種蔬菜有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的分析方法"(200410026892.9)、"蔬菜和水果中有機(jī)磷農(nóng)藥 殘留量的快速測(cè)定方法"(200310119273. X)。也有與本項(xiàng)目相似利用酶抑制的方法，如"快 速檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的魚酯酶試劑"(02115152. 0)、"一種定性檢驗(yàn)有機(jī)磷的試劑的制 備及含量測(cè)定方法"(99109293.7)、"快速測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥的植物酯酶片"(99114268.3)、
"殘留有機(jī)磷農(nóng)藥快速測(cè)試盒及制造方法"(00135716. 6)、"快速檢測(cè)痕量有機(jī)磷和氨基 甲酸酯農(nóng)藥的方法"(01144343. X)。但這些專利方法所用的植物酯酶或苯基一 (偶氮一 1 )
2 —醋酸萘酯與本項(xiàng)目所用的酶源或底物不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以新鮮母雞或母鴨血中的乙酰膽堿酯酶為原料，通過有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶 的抑制作用，使酶的底物乙酸萘酯不能分解，從而加入固藍(lán)B后的顏色變淺。最后通過顏色 的深淺達(dá)到判斷樣品中是否含有有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的目的。 本發(fā)明是如下實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一種檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留試紙的制備及其使用方法。 本發(fā)明所述的檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留試紙的制備方法包括如下步驟(1)以新鮮母雞或母 鴨血為原料制備乙酰膽堿酯酶；(2)乙酰膽堿酯酶固定于濾紙上；(3)將濾紙冷凍干燥后切 片。
上述步驟(1)中制備乙酰膽堿酯酶的方法是母雞或母鴨的新鮮血液室溫下凝固后，于
0 4。C冰箱放置過夜使血清析出，取其血清上清液，所得血清上清液再在16000r.p.m轉(zhuǎn)速， 0 4'C下離心5rain，其上清液即為乙酰膽堿酯酶粗酶；然后將裝有乙酰膽堿酯酶粗酶的三角 瓶放入冰水中，往粗酶液中緩慢攪拌加入飽和硫酸銨，使酶液中硫酸銨的飽和度在55% 60 %的范圍內(nèi)；所得溶液于15000r.p.m， 0 4'C下離心8 min，棄去上清；沉淀再用蒸餾水溶 解，并裝入分子量1萬(wàn)的透析袋，于4'C冰箱透析40小時(shí)，其間換液8次，然后將透析后 所得的酶液冷凍干燥，即為純化的乙酰膽堿酯酶。
上述步驟(2)中將凍干的乙酰膽堿酯酶用蒸餾水配成濃度為0. 10 0. 40mg/mL，將濾紙 浸入酶液中，3分種后取出，置于冷凍真空干燥箱中進(jìn)行凍干。
上述步驟(3)中用特定的打孔機(jī)將凍干的濾紙酶片打成直徑5cm大小的園形小片，置于 帶瓶塞的瓶中密封保存。
本發(fā)明所述的檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留試紙使用方法有如下步驟(1)以50%甲醇配置氯化乙 酰膽堿底物液，濃度為2.0 mg/mL，以蒸餾水配置固藍(lán)B顯色液，濃度為1.0 mg/mL，用蒸 餾水將3%的溴水稀釋為0.5 1.0%的濃度，用于增敏液；(2)檢測(cè)時(shí)，先取定量蔬菜或水果 的提取液500u L加入倍比的0. 5 1. 0%的溴水靜置10 15min，對(duì)照用蒸餾水500n L加入 倍比的0.5 1.0%的溴水靜置10 15min;取2片上述已固定乙酰膽堿酯酶的酶片，分別加 入上述溴水處理過的樣品提取液和對(duì)照各40 60wL，靜置10min;再加入50 80uL氯化 乙酰膽堿底物液，靜置10min; (3)加入30 50iiL固藍(lán)B顯色液，觀察樣品酶片與對(duì)照酶 片顏色深淺，如果顏色一致，表明沒有農(nóng)藥殘留，如果樣品酶片比對(duì)照酶片顏色淺，表明有 農(nóng)藥殘留。
本專利方法與現(xiàn)有專利和產(chǎn)品相比，試紙的制備方法簡(jiǎn)單，所用酶源豐富，成本低，使用更方便，是一種簡(jiǎn)單快速實(shí)用的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留測(cè)定產(chǎn)品。能適于現(xiàn)場(chǎng)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留
快速測(cè)定。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施列1:
用蒸餾水配置2. 0u g/mL的敵敵畏，取2支1. 5mL的印pdof離心管， 一支管中加入500 u L 2. 0u g/mL的敵敵畏和500 w L 0. 5%的溴水靜置15min，另一支管中加入500u L蒸餾水 和500u L 0. 5%的溴水靜置15min，取2片乙酰膽堿酯酶的酶片，分別加入上述溴水處理過 的敵敵畏農(nóng)藥液和對(duì)照各40u L，靜置10min;再加入60y L氯化乙酰膽堿底物液，靜置10min; 最后加入50yL固藍(lán)B顯色液，觀察到加入敵敵畏的酶片近乎無色，而對(duì)照酶片顯淺紅色。 實(shí)施列2:
用蒸餾水配置1. 5u g/mL的甲胺磷，取2支1. 5mL的印pdof離心管， 一支管中加入500 uL 1.5y g/mL的甲胺磷和500uL 0.5%的溴水靜置15min，另一支管中加入500y L蒸餾水 和500uL 0.5%的溴水靜置15min，取2片乙酰膽堿酯酶的酶片，分別加入上述溴水處理過 的甲胺磷農(nóng)藥液和對(duì)照各60u L，靜置10rain;再加入70p L氯化乙酰膽堿底物液，靜置10min; 最后加入50nL固藍(lán)B顯色液，觀察樣品酶片與對(duì)照酶片顏色深淺，加入甲胺磷的酶片近乎 無色，而對(duì)照酶片顯淺紅色。 實(shí)施列3:
從蔬菜市場(chǎng)隨機(jī)買回葉菜5份，取其中100g葉用蒸餾水100mL不斷沖洗后，然后編號(hào)5 支1. 5mL印pdof離心管并各加入500" L不同葉菜沖洗液與500y L 0. 5%的溴水靜置15min， 第6支管中加入500y L蒸餾水和500u L 0. 5%的溴水靜置15min，取6片乙酰膽堿酯酶的 酶片，分別加入上述溴水處理過的葉菜樣品沖洗液和對(duì)照各60y L，靜置10min;再加入60 "L氯化乙酰膽堿底物液，靜置10min;最后加入50uL固藍(lán)B顯色液，觀察樣品酶片與對(duì) 照酶片顏色深淺，4個(gè)樣品的顏色與對(duì)照酶片一致近淺紅色，其中一個(gè)樣品的顏色比對(duì)照淺， 表明該樣品含有農(nóng)藥殘留，后又重復(fù)測(cè)試并用液相色譜確證該樣品含有乙酰甲胺磷殘留。
權(quán)利要求
1. 一種檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留試紙的制備方法，其特征在于制備該試紙包括如下步驟(1)以新鮮母雞或母鴨血為原料制備乙酰膽堿酯酶；(2)乙酰膽堿酯酶固定于濾紙上；(3)將濾紙冷凍干燥后切片。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述試紙的制備方法，其特征在于上述步驟(1)中制備乙酰膽堿酯 酶的方法是母雞或母鴨的新鮮血液室溫下凝固后，于0 4。C冰箱放置過夜使血清析出，取其血清上清液，所得血清上清液再在16000r.p.m轉(zhuǎn)速，0 4。C下離心5min，其上清液即為 乙酰膽堿酯酶粗酶；然后將裝有乙酰膽堿酯酶粗酶的三角瓶放入冰水中，往粗酶液中緩慢攪 拌加入飽和硫酸銨，使酶液中硫酸銨的飽和度在55% 60%的范圍內(nèi)；所得溶液于 15000r.p.m， 0 4。C下離心8 min，棄去上清；沉淀再用蒸餾水溶解，并裝入分子量1萬(wàn)的 透析袋，于4'C冰箱透析40小時(shí)，其間換液8次，然后將透析后所得的酶液冷凍干燥，即 為純化的乙酰膽堿酯酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述試紙的制備方法，其特征在于上述步驟(2)中將凍干的乙酰膽 堿酯酶用蒸餾水配成濃度為0. 10 0.40mg/mL，將濾紙浸入酶液中，3分種后取出，置于冷 凍真空干燥箱中進(jìn)行凍干。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述試紙的制備方法，其特征在于上述步驟(3)中用特定的打孔機(jī) 將凍干的濾紙酶片打成直徑5cm大小的園形小片，置于帶瓶塞的瓶中密封保存。
5. —種如權(quán)利要求l所述的檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留試紙的使用方法，其特征在于該使用方 法有如下步驟(1)以50%甲醇配置氯化乙酰膽堿底物液，濃度為2.0 mg/mL，以蒸餾水配 置固藍(lán)B顯色液，濃度為1. 0 mg/mL，用蒸餾水將3%的溴水稀釋為0. 5 1. 0%的濃度，用于 增敏液；(2)檢測(cè)時(shí)，先取定量蔬菜或水果的提取液500uL加入倍比的0.5 l.(m的溴水靜 置10 15min，對(duì)照用蒸餾水500iiL加入倍比的0. 5 1.0%的溴水靜置10 15min;取2片 上述已固定乙酰膽堿酯酶的酶片，分別加入上述溴水處理過的樣品提取液和對(duì)照各40 60 PL，靜置10min;再加入50 80uL氯化乙酰膽堿底物液，靜置10min; (3)加入30 50 uL固藍(lán)B顯色液，觀察樣品酶片與對(duì)照酶片顏色深淺，如果顏色一致，表明沒有農(nóng)藥殘留， 如果樣品酶片比對(duì)照酶片顏色淺，表明有農(nóng)藥殘留。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留試紙的制備及其使用方法，制備方法包括如下步驟(1)以新鮮母雞或母鴨血為原料制備乙酰膽堿酯酶；(2)乙酰膽堿酯酶固定于濾紙上；(3)將濾紙冷凍干燥后切片；使用時(shí)配置底物液、顯色液和增敏液；其原理是利用增敏液處理后的有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)雞或鴨血清中乙酰膽堿酯酶的抑制作用，使乙酰膽堿酯酶的底物乙酸萘酯不能分解，從而加入固藍(lán)B后顯示的顏色深淺不一致，達(dá)到判斷樣品是否含有有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的目的，本發(fā)明成本低，操作簡(jiǎn)便快速，能適于現(xiàn)場(chǎng)特異測(cè)定蔬菜、水果和食品中是否存在有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/46GK101299029SQ20081002843
公開日2008年11月5日 申請(qǐng)日期2008年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日
發(fā)明者元 彭, 趙肅清, 洪 黃 申請(qǐng)人:廣西科學(xué)院