專利名稱：一種酵母展示脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及己酸乙酯的制備方法，特別是涉及一種用全細胞酶制劑高效地催化合成 己酸乙酯的新生產工藝。
背景技術：
己酸乙酯是釀酒行業(yè)常用的調香物質，是濃香型白酒(如五糧液)的主體風味物質， 其含量高低直接影響曲酒的品質也是白酒質量的重要指標之一。每年我國用于濃香型曲
酒調香的己酸乙酯達3000多噸，價值上億元。目前這些標著食品級的己酸乙酯的生產采
用基本上.采用化學合成法，用硫酸或對甲苯磺酸作催化劑，由己酸和乙醇直接酯化反應。
化學法合成的己酸乙酯調配白酒時會產生外加香精的"浮香"，殘留的催化劑會與加漿用
水中的金屬離子產生白色混濁或沉淀，直接影響白酒質量，同時副反應容易生成有毒物
質。同時山于副反應造成后處理困難，產品質量不高，酸催化后還造成大量廢液?，F雖有
使川其他催化劑的報道，如鈦酸四異丙酯、硫酸鋯、水合硫酸鐵等，但山于催化劑成本、
活性、以及產品質量等問題還難以取代酸催化方法。
隨著人們對生產環(huán)境的關注，對高品質、尤其是對天然品的需求F1益增加，用生物
技術生產己酸乙酯酯引起了人們的廣泛興趣。本專利提出的微生物酶法合成己酸乙酯是
有望取代化學合成法的工藝。微生物酶法不但反應條件溫和、能耗低，三廢少，反應速
率和轉化率高，而且產品純度高，使用微生物酶法合成的己酸乙酯調配白酒時，產品風
味柔和、香醇自然。美國聯(lián)邦法規(guī)已確認酶在有機相中催化合成的己酸乙酯是高質量的
天然品。和化學合成法相比，微生物酶法具有反應條件溫和、轉化率高、專一性好、易
提取、易控制等優(yōu)點，被看成是很有希望工業(yè)化的新途徑。
^利號為03116567. 2的中國發(fā)明專利公丌了一種高轉化率的生物催化合成己酸乙酯
的r藝方法，改方法采用己酸和乙醇為原料，在生物催化劑脂肪酶的作用下發(fā)生酯化反
應，得到己酸乙酯產品；在反應過程中，反應產生的水分不斷地通過選擇性水透過膜被
吸水性鹽或水合鹽吸收，使反應持續(xù)地朝酯化合成方向進行，直至反應物接近完全轉化。
該方法既可以吸收反應的生成水，又可以使反應體系保持微水環(huán)境，技術上保證了高效
合成己酸乙酯。但該方法是用聚苯乙烯大孔吸附樹脂固定脂肪酶，不適用于柱反應系統(tǒng)，酶在固定化過程種難免出現酶活損失，酶固定化也需要一定的條件，傳質過程常有擴散 限制，重復使用中酶活力逐漸降低，導致產物轉化率低。還有采用游離的脂肪酶通過生 物催化合成己酸乙酯。由于酶的分離、再生、循環(huán)使用很困難，存在反應時間長、特別 是生產過程中酶易失活，如選用高活力的脂肪酶如Novo435,價格昂貴，應用于工業(yè)化大 生產成本過高。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現有技術的缺點，提供反應時間短、產率高、操作穩(wěn)定性好、 成本低的全細胞酶制劑催化合成己酸乙酯的方法。 本發(fā)明的目的通過如下技術方案實現
一種酵母展示脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，在于包括如下歩驟
(1) 全細胞酶制劑的生產將脂肪酶基因克隆到攜帶釀酒酵母絮凝素基因(pKFS) 的畢赤酵母表面展示載體中，構建畢赤酵母表面展示表達載體pKFS-lipase (真核絮凝素 脂肪酶融合蛋白表達載體)，pKFS-lipase經線性化后轉化畢赤酵母宿主菌，篩選獲得在 畢赤酵母表面展示活性酶蛋白的重組酵母基因工程菌，工程菌經搖瓶發(fā)酵，收獲菌體真
空冷凍干燥24h以上制成全細胞酶制劑；
(2) 己酸乙酯的合成采用己酸和乙醇為原料，以全細胞酶制劑為催化劑，以能夠
溶解己酸和乙醇的液態(tài)物質為溶劑發(fā)生酯化反應，得到己酸乙酯產品，底物中己酸含量 為().2 moL/L 1.8 mol/L，己酸和乙醇的摩爾比為1:0. 75 1:5，酯化反應溫度為20— 9(rC;反應物中全細胞酶制劑用量為10—90g/L (反應體系中的濃度)，反應時間12h以上。
相對于現有技術本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果
本發(fā)明采用以展示有高活力脂肪酶的畢赤酵母全細胞酶制劑作為催化劑，具有固定 化酶的優(yōu)點，反應時間短、產率高、操作穩(wěn)定性好。反應后離心收集菌體即可重復利用， 大大降低生產成本。酵母具有良好的生物安全性，其取代化學載體固定脂肪酶生產己酸 乙酯，完全符合綠色食品的要求。本發(fā)明涉及這種畢赤酵母全細胞酶制劑凍干粉在非水 相的反應體系中，以有機溶劑為溶劑，能有效的催化己酸和乙醇酯化生成己酸乙酯，反
應12h后，己酸的摩爾轉化率可超過98%，經過10批次的連續(xù)使用，全細胞酶制劑仍然 在每批次中使己酸的轉化率保持在95%以上，具有良好的操作穩(wěn)定性。


圖i是pKFS載體結構示意圖。
具體實施方式
以下結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，需要說明的是，這些實施例并不構成對 本發(fā)明保護范圍的限制。
本發(fā)明提供了可用來克隆酶基因的指導脂肪酶展示在畢赤酵母表面攜帶釀酒酵母絮 凝素基因的展示載體沐FS (真核絮凝素脂肪酶融合蛋白表達載體)。如圖1所示。此展 示載體在pPIC9K (Invitrogen公司真核表達載體)的基礎上利用限制性內切酶feoRI和 將原載體上的信號肽部分基因切除，在此基礎上用來源于釀酒酵母的絮凝素基因FS U換。該質粒主要包含5，A0X1 (醇氧化酶-l基因的啟動子)、3'A0X1 (醇氧化酶-l基因 的轉錄終止？)、 FS (絮凝素基因)、HIS4 (組氨酸脫氫酶基因)，以及A叩"(氨芐青霉素 抗性)、KnZ (卡那霉素抗性)等元件，同時包含可用來克隆脂肪酶基因的多克隆位點， 包括限制性內切酶酶切位點M/wI (來源于M/cracocc^/w^^，滕黃微球菌)、^ dl (來源 于^ceto6a"er p"5&w/awiw 戶(X^ewn-amw， 巴氏酉昔桿菌巴氏亞禾中)、SacII (來源于 S加/ /o附y(tǒng)cei' ac/2rawoge"es，產色鏈霉菌)、五coRI(來源于大腸桿菌RY13)、 (NEB 公司)、Abfl (來源于Abcar^3ot"A/^-caWaray77，珊瑚紅諾卡氏菌)。將脂肪酶基因 (包含南極假絲酵母脂肪酶B基因、米黑根毛酶的脂肪酶基因以及二者衍生的突變脂肪 酶基[S)與展示載體pKFS實現體外連接，提供了可指導畢赤酵母表面展示脂肪酶的重組 性展示表達載體，沐FS-lipase (真核絮凝素脂肪酶融合蛋白表達載體)。
菌體千粉制備過程如下首先，針對擬克隆的脂肪酶基因設計引物，以基因組模板 或含脂肪酶基因的質粒為模板進行PCR(聚合酶鏈式反應)擴增，PCR產物與展示載體pKFS 經IHJ樣的限制性內切酶處理，經T4連接酶體外連接后，轉化大腸桿菌感受態(tài)，涂布抗性 平板，挑選鑒定陽性單克隆。陽性單克隆搖瓶培養(yǎng)提取重組質粒pKFS-lipase。重組質粒 PKFS-lipase線性化后轉化畢赤酵母宿主菌，轉化物涂布抗性平板，28 32'C培養(yǎng)2 3d 后，篩選獲得重組轉化子。重組轉化子經BMGY擴大培養(yǎng)24 48h后，采用6000 g 10000g離心力室溫離心收集菌體，再用同體積的BMMY誘導培養(yǎng)，每隔24h添加甲醇 至終濃度為1%。 7000g 10000g離心力、4'C離心10 15分鐘，棄上清，用去離子水洗 滌菌體三次，重懸菌體經真空冷凍干燥24h以上收獲菌體干粉。
己酸乙酯的合成用己酸和乙醇為原料，以全細胞酶制劑為催化劑，以能夠溶解己酸 和乙醇的液態(tài)物質為溶劑，發(fā)生酯化反應，得到己酸乙酯產品，底物中己酸含量為0.2 mol/L 1.8 moL/L，己酸和乙醇的摩爾比為1:0. 75 1:5,酯化反應溫度為20—90。C; 反應物中全細胞酶制劑用量為10—90g/L (反應體系中的濃度)，反應時間12h以上，取 樣10000rpm離心10min。上清與乙酸正丁酯內標物混合溶于正己烷中，振蕩混勻，1注入氣相色譜測定產物中己酸乙酯、己酸的含量。 實施例1
O)表面展示南極假絲酵母脂肪酶B (簡稱c"/6)的畢赤酵母全細胞酶制劑的生產。 首先，根據南極假絲酵母脂肪酶(M/6J基因LF058的核苷酸序列設計引物，以南極 假絲酵母基因組DNA為模板進行PCR擴增全長ca/6，PCR程序如下94 。C預變性5min， 以94 。C lmin、 60。C lmin、 72 。C lmin進行30個循環(huán)，72°C延伸10min。 100 P L的PCR 擴增產物經&o WI和Not I酶切，同時把20 ii L質粒pPIC9K-Fl叩l經￡co i I和I酶 切，純化后用T4DNA連接酶連接，與pMD18-T連接，轉化￡. co// ToplO，篩選陽性轉 化子。
驗證的重組質粒pKFS-CALB經Sac I線性化后用電轉移的方轉化P. pastorisGS 115 。 涂轉化物涂布于G418梯度平板，30'C培養(yǎng)2d。挑取部分抗高濃度G418的轉化子接種于 5mlYPD培養(yǎng)液，30°C， 250r/min培養(yǎng)過夜，堿滴定法檢測脂肪酶活力，得到展示高酶 活的中.赤酵母丄程菌。畢赤酵母工程菌先經YPD培養(yǎng)種子液，經BMGY擴大培養(yǎng)24h 后；6000g室溫離心收集菌體。再用同體積的BMMY誘導培養(yǎng)，每隔24h添加甲醇至終 濃度為1%。 3CTC、 250rpm搖床培養(yǎng)4d。 7000rpm、 4。C離心10分鐘，棄上清，用去離 子水洗滌菌體三次，重懸菌體經真空冷凍干燥24h。
(2)非水相酯化反應制備己酸乙酯。試劑都預先用3A分子篩充分除水。將無水乙醇 和il:己酸加入iK庚烷中。加入后，無水乙醇的濃度為1.75 mol/L，正己酸的濃度為1.4 mol/L。取5mL底物(其中正己酸125uL，無水乙醇73uL，正庚垸4800"L，酸醇摩 爾比為1: 1.25)混合物于50 mL具塞三角瓶中，加入含量為40g/ L的步驟(1)所得 菌體凍干粉，反應溫度40'C，然后于200rpm下振蕩反應，0.5 h后加入0.6g分子篩，5h 后加入0.3g分子篩，反應24h，己酸的轉化率達到96.5%。在上述條件下反應后，離心 回收菌體，經溶劑iF.庚垸洗滌，去除產物和殘余的微量底物，再加入到含有新鮮底物的 反應體系中催化酯化反應，經過10批次的連續(xù)使用，畢赤酵母展示CALB仍然在每批次 中使己酸的轉化率保持在90%以上。
實施例2
(1)表面展示米黑根毛霉脂肪酶(簡稱i M丄)的畢赤酵母全細胞酶制劑的生產。 根據GenBank中己報道的米黑根毛霉脂肪酶RML前體序列(P19515， GI: 417256) 設計引物，以質粒PMD18-T-RML為模板進行PCR擴增。PCR體系為模板1 p L; 10XTaqDNA聚合酶buffer 5 y L(含Mg2+); 2.5mmol/L dNTP 4 y L: 20 y M mol/L的上下游引物
各luL; TaqDNA聚合酶0.75 W L，加無菌水至總體積為50 W L。反應條件為94'C預
變性5min; 94。C變性45s， 45'C退火45s, 72。C延伸2min，共30個循環(huán)；第30個循環(huán)
72。C延伸10min，將PCR產物和pKFS質粒都用SnaBI和AvrII雙酶切，構建重組質粒
pPIC9K-RML后用CaCl2轉化法轉入E.coli ToplOF"，在Amp+ LB (50mg/mL)平板上涂板，
過夜培養(yǎng)。提取陽性轉化子質粒進行SnaBI和AvrII雙酶切鑒定。
以LiCl法將Sail線性化的重組質粒pKFS-RML轉化宿主菌R pastorisKM71 ，轉化物
涂布于MD平板，3CTC培養(yǎng)2d。將MD平板上的轉化子分別接種于含G418 0.5mg/mL，
1.0mg/mL， 1.5 mg/mL， 2.0 mg/mL, 3.0 mg/mL的YPD平板上，30。C培養(yǎng)3d，觀察結
果。將高濃度G418-YPD平板(3.0 mg/mL)上出現的轉化子接種于MM-羅丹明B平板(MM
培養(yǎng)基加5g/L橄欖油和lmg/L羅丹明B)上，培養(yǎng)皿倒置，在蓋上加100u L甲醇，30°C
誘導培養(yǎng)48h后，選取365nm紫外光下形成較大熒光圈的轉化子挑取其對應的單克隆，
即為展示高酶活的畢赤酵母工程菌。畢赤酵母工程菌先經YPD培養(yǎng)種子液，經BMGY
擴大培養(yǎng)24h后；6000g室溫離心收集菌體。再用同體積的BMMY誘導培養(yǎng)，每隔24h
添加甲醇至終濃度為1%。 30°C、 250rpm搖床培養(yǎng)4d。 7000rpm、 4'C離心10分鐘，棄
上清，用去離子水洗滌菌體三次，重懸菌體經真空冷凍干燥24h。
(2)非水相酯化反應制備己酸乙酯。試劑都預先用3A分子篩充分除水。將無水乙醇 和正己酸加入正庚垸中。加入后，無水乙醇的濃度為0.25 mol/L，正己酸的濃度為 ().2mol/L。取5mL底物(其中正己酸125"L，無水乙醇73yL，正庚烷4800yL，酸醇 摩爾比為l: 1.25)混合物于50mL具塞三角瓶中，加入含量為90g/ L的菌體凍干粉， 反應溫度％°C ，然后于200 rpm下振蕩反應，0.5 h后加入0.6g分子篩，5h后加入0.3g 分子篩，反應12h，己酸的轉化率達到96. 59%。在上述條件下反應后，離心回收菌體， 經溶劑正庚烷洗滌，去除產物和殘余的微量底物，再加入到含有新鮮底物的反應體系中 催化酯化反應，經過10批次的連續(xù)使用，畢赤酵母展示CALB仍然在每批次中使己酸的
轉化率保持在92%以上。 實施例3
(1)表面展示米黑根毛霉脂肪酶(簡稱/ M丄)的畢赤酵母全細胞酶制劑的生產。 根據GenBank中已報道的米黑根毛霉脂肪酶RML前體序列(P19515, GI: 417256) 設計引物，以質粒PMD18-T-RML為模板進行PCR擴增。PCR體系為模板1 U L; 10XTaq DNA聚合酶buffer 5 u L(含Mg2+); 2.5mmol/L dNTP 4 u L; 20 u M mol/L的上下游引物 各lyL; TaqDNA聚合酶0.75 yL,加無菌水至總體積為50y L。反應條件為94'C預變性5min; 94'C變性45s， 45'C退火45s， 72。C延伸2min，共30個循環(huán)；第30個循環(huán)
72'C延伸10min，將PCR產物和pKFS質粒都用SnaBI和AvrII雙酶切，構建重組質粒
pPIC9K-RML后用CaC12轉化法轉入E.coli ToplOF'，在Amp+ LB (50mg/mL)平板上涂板，
過夜培養(yǎng)。提取陽性轉化子質粒進行SnaBI和AvrII雙酶切鑒定。
以LiCl法將Sail線性化的重組質粒pKFS-RML轉化宿主菌P. pastorisKM71 ，轉化物
涂布于MD平板，3(TC培養(yǎng)2d。將MD平板上的轉化子分別接種于含G418 0.5 mg/mL，
1.0 mg/mL, 1.5 mg/mL, 2.0 mg/mL， 3.0 mg/mL的YPD平板上，30。C培養(yǎng)5d，觀察結
果。將高濃度G418-YPD平銜(3.0 mg/mL)上出現的轉化子接種于MM-羅丹明B平板(MM
培養(yǎng)基加5g/L橄欖油和lmg/L羅丹明B)上，培養(yǎng)皿倒置，在蓋上加100 u L甲醇，30°C
誘導培養(yǎng)48h后，選取365nrn紫外光下形成較大熒光圈的轉化子挑取其對應的單克隆，
即為展示高酶活的畢赤酵母工程菌。畢赤酵母工程菌先經YPD培養(yǎng)種子液，經BMGY
擴大培養(yǎng)24h后；6000g室溫離心收集菌體。再用同體積的BMMY誘導培養(yǎng)，每隔24h
添加甲醇至終濃度為1%。 30°C、 250rpm搖床培養(yǎng)4d。 7000rpm、 4"C離心10分鐘，棄
上淸，用去離子水洗滌菌體三次，重懸菌體經真空冷凍干燥24h。
(2)非水相酯化反應制備己酸乙酯。試劑都預先用3A分子篩充分除水。將無水乙醇 和:iT:己酸加入正庚垸中。加入后，無水乙醇的濃度為0.3mol/L，正己酸的濃度為0.2mol/L。 取5 mL底物(其中正己酸125uL，無水乙醇87.6uL，正庚烷4787.4uL，酸醇摩爾比 為1: 1. 5)混合物于50 mL具塞三角瓶中，加入含量為60g/ L的菌體凍干粉，反應溫 度20'C,然后于200rpm下振蕩反應，0.5 h后力口入0.6g分子篩，5h后加入0.3g分子篩， 反應24h，己酸的轉化率能達到98%。在上述條件下反應后，離心回收菌體，經溶劑正庚 烷洗滌，去除產物和殘余的微量底物，再加入到含有新鮮底物的反應體系中催化酯化反 應，經過iO批次的連續(xù)使用，畢赤酵母展示CALB仍然在每批次中使己酸的轉化率保持 在92%以上。
權利要求
1、 一種酵母展示脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于包括如下步驟(1)全細胞酶制劑的生產將脂肪酶基因克隆到攜帶釀酒酵母絮凝素基因的畢赤酵母表面展示載體(pKFS)中，構建畢赤酵母表面展示表達載體pKFS-lipase(真核絮凝素脂肪酶融合蛋白表達載體)，pKFS-lipase經線性化后轉化畢赤酵母宿主菌，篩選獲得在畢赤酵母表面展示活性酶蛋白的重組酵母基因工程菌，工程菌經搖瓶發(fā)酵，收獲菌體真空冷凍干燥24h以上制成全細胞酶制劑；(2)己酸乙酯的合成采用己酸和乙醇為原料，以全細胞酶制劑為催化劑，以能夠溶解己酸和乙醇的液態(tài)物質為溶劑發(fā)生酯化反應，得到己酸乙酯產品，底物中己酸含量為0.2mol/L～1.8mol/L，己酸和乙醇的摩爾比為1∶0.75～1∶5，酯化反應溫度為20-90℃；反應物中全細胞酶制劑用量為10-90g/L(反應體系中的濃度)，反應時間12h以上。
2、 根據權利要求l所述的全細胞酶制劑催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于所述 的溶劑選自iH己烷、正庚烷、環(huán)己垸中的一種或多種。
3、 根據權利要求l所述的全細胞酶制劑催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于所述 的底物己酸含量為O. 5 mol/L L5 mol/L (反應體系中濃度)。
4、 根據權利要求l所述的全細胞酶制劑催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于所述 的全細胞酶制劑為有脂肪酶的重組酵母菌菌體凍干粉。
5、 根據權利要求1所述的全細胞酶制劑催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于所述 攜帶釀酒酵母絮凝素基因的畢赤酵母表面展示載體(pKFS)包含5'A0X1 (醇氧化酶-l基 因的啟動子)、3'A0X1 (醇氧化酶-l基因的轉錄終止子)、FS (絮凝素基因)、HIS4 (組氨 酸脫氫酶基因)，以及八1^+ (氨芐青霉素抗性)和Kn^ (卡那霉素抗性)元件。
6、 根據權利要求1或5所述的全細胞酵制劑催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于 所述畢赤酵母表面展示載體中含有用來克隆脂肪酶基因的多克隆位點，多克隆位點包括 限制性內切酶酶切位點MM、輛I、 SacII、 ￡coRI、加II和淑I。
7、 根據權利要求1所述的全細胞酶制劑催化合成己酸乙酯的方法，其特征在于所述 脂肪酶基因包括南極假絲酵母脂肪酶B基因、米黑根毛酶的脂肪酶基因以及二者衍生的 突變脂肪酶基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母展示脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法，該方法包括全細胞酶制劑的生產和己酸乙酯的合成兩個步驟，是將脂肪酶基因克隆到畢赤酵母表面展示載體pKFS中構建畢赤酵母表面展示表達載體pKFS-lipase，pKFS-lipase經線性化后轉化畢赤酵母宿主菌，篩選獲得在畢赤酵母表面展示活性酶蛋白的重組酵母基因工程菌，工程菌經搖瓶發(fā)酵，收獲菌體真空冷凍干燥24h以上制成全細胞酶制劑；然后采用己酸和乙醇為原料，在表面展示有脂肪酶的畢赤酵母全細胞酶制劑作為生物催化劑的作用下發(fā)生酯化反應，得到己酸乙酯產品。該方法反應時間短、產率高、操作穩(wěn)定性好，且反應后離心收集菌體即可重復利用，大大降低生產成本。
文檔編號C12N15/57GK101285078SQ20081002863
公開日2008年10月15日 申請日期2008年6月10日 優(yōu)先權日2008年6月10日
發(fā)明者影 林, 潘志友, 鄭穗平, 韓雙艷, 黃登峰 申請人:華南理工大學