專利名稱：溶藻弧菌外膜蛋白va0760的表達(dá)和作為疫苗組份的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及溶藻弧菌(WZvvo"/g/'"o/"/"")表達(dá)的一種外膜蛋白(outer membrane protein, OM protein) VA0760的免疫調(diào)節(jié)功能。
背景技術(shù)：
溶藻弧菌廣泛分布于世界各地海水及河口處，并且數(shù)量居海水類弧菌之首，對于溶藻弧 菌致病微生物，研究的重點就是免疫學(xué)分析，闡明其致病機理并找出有效的防治方法，防治 的辦法主要包括藥物即抗生素防治以及免疫防治，其中抗生素雖然在最初的使用中取得了巨 大的進展，然而隨著抗生素的廣泛使用，也出現(xiàn)了一系列的相關(guān)問題， 一方面抗生素的不合 理使用，增加抗生素耐藥菌的產(chǎn)生，細(xì)菌感染增多；另一方面，因抗生素的耐藥性而人為地 加大劑量，加劇耐藥性的產(chǎn)生。因此，研制以具有免疫保護作用的高效中和抗原為成分的疫 苗具有廣闊的應(yīng)用前景。
在各種動物疾病的防治中，疫苗的使用是一個具有低成本、高效的方法，并且已經(jīng)有部 分疫苗得到大規(guī)模使用并取得了不錯的防治效果。疫苗種類很多，以細(xì)菌為例，包括全菌疫 苗、亞單位疫苗以及DNA疫苗等。從實際應(yīng)用的情況來看，全菌疫苗雖然具有制作相對簡 單而且成本也較低的優(yōu)點，但它也存在不少由于使用全菌體而固有的一些缺點。如減毒全f^ 疫苗可能出現(xiàn)菌株突變而導(dǎo)致的毒性恢復(fù)等不良后果；滅活全菌疫苗則往往由于對細(xì)菌的滅 活過程而導(dǎo)致一些免疫保護基團活性的改變，而影響免疫保護的效果。而且對全菌疫苗來說， 由于細(xì)菌成分的復(fù)雜性，其中往往存在一些毒性成分(如LPS等)，會導(dǎo)致機體產(chǎn)生不良反 應(yīng)。并且常規(guī)制得的全菌疫苗免疫保護效果不理想。然而，全菌疫苗仍然是目前最為主要的 疫苗種類。其原因可能與高效中和抗原的發(fā)現(xiàn)和鑒定困難有關(guān)。
隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄分布圖技術(shù)的發(fā)展，這就為細(xì)菌疫苗提供了新的契機。 基因工程疫苗由于具有高效、且擺脫了傳統(tǒng)疫苗的種種缺點，成為疫苗研究的重點，具有廣 闊的應(yīng)用與開發(fā)前景。外膜蛋白是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分之一，由于外膜蛋白直接面 對宿主的體液及組織，細(xì)菌利用外膜蛋白進行黏附、侵入和炎癥等生理活動，更容易被宿主 識別作為攻擊目標(biāo)，使得革蘭氏陰性菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不僅可以刺激體液 免疫，而且對細(xì)胞免疫亦有刺激作用。近年來，細(xì)菌的一些外膜蛋白已經(jīng)被證實具有良好的 免疫原性，用其制備基因工程疫苗具有良好的前景。如在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)外膜蛋白OmpX的
免疫保護功能。但在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中提及的溶藻 弧菌外膜蛋白VA0760的免疫調(diào)節(jié)功能。
本專利率先采用分子克隆和免疫學(xué)等現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，以溶藻弧菌為研究對象，對外膜 蛋白基因VA0760進行克隆、表達(dá)和純化，并在此基礎(chǔ)上深入研究其免疫保護性。免疫和攻 毒實驗結(jié)果表明溶藻弧菌的外膜蛋白VA0760顯示出對溶藻弧菌較高的免疫保護作用。其相 對免疫保護率(RPS)為75%，此外還顯示出對熒光假單胞菌的交叉免疫原性，其免疫保護 率(RPS)達(dá)到52.6%。這些結(jié)果說明VA0760可作為疫苗組分。

發(fā)明內(nèi)容
外膜蛋白具有良好的免疫原性，對細(xì)胞免疫和體液免疫均有刺激作用。本發(fā)明涉及通過 對表達(dá)的溶藻弧菌外膜蛋白VA0760免疫保護性以及免疫交叉性的分析，發(fā)現(xiàn)免疫鯽魚后可 以顯著提高對重要致病菌溶藻弧菌以及熒光假單胞菌的抵制力。初步評價其作為候選疫苗的 可行性，對水產(chǎn)疾病的防治具有重要意義。


圖1. VA0760基因PCR產(chǎn)物0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析
圖2. pET-28a- VA0760重組子的雙酶切鑒定
圖3.克隆子BL21-pET-28a- VA0760在五.co/Z-BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)
圖4. SDS-PAGE分析純化的重組蛋白.lane 1:克隆子BL21-pET-28a- VA0760誘導(dǎo)表
達(dá)上清；lane 2:純化的重組蛋白
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例 如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的條 件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1
溶藻弧菌外膜蛋白VA0760基因的克隆和鑒定 1.溶藻弧菌VA0760基因的擴增
由于溶藻弧菌基因的全序列還未測定，目前也無該菌的VA0760基因序列報道。鑒于副 溶血弧菌已完成全序列測定，并于2006年3月在數(shù)據(jù)庫GenBank (BA000031)公布，我們 按其數(shù)據(jù)庫上已公布的VP0760序列設(shè)計了 VA0760基因引物，用于溶藻弧菌VA0760的PCR
擴增。所設(shè)計的引物是上游引物5'-ATAge^ECCATGTCTTACCTAAAGAAAAGCC-3'; 下游引物5，- CGCAAGCTTTTAGAAGTAGTATTCAAC-3':橫線所示為酶切位點，上游引 物引入5amH/酶切位點，下游引物引入/^>^///酶切位點。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑 盒(TIANGEN公司)，按照試劑盒內(nèi)的使用說明書提取溶藻弧菌的全基因組DNA作為模板， 采用上述引物進行PCR擴增，圖1所示PCR擴增結(jié)果。從圖可見，基因擴增產(chǎn)物為單一特 異條帶，va0760基因約1119bp，與預(yù)計的片段大小相當(dāng)。
2、溶藻弧菌va0760基因的克隆、篩選和鑒定
將基因PCR產(chǎn)物使用0.8。/。瓊脂糖/溴化乙錠凝膠進行電泳，通過新配置的瓊脂糖凝膠電 泳純化，按購自TIANGEN公司的凝膠回收試劑盒(DNA Gel Extraction Kit)的說明書進行 回收。用干凈的、鋒利的刀片，在短波長紫外燈下，切下目的PCR擴增片段，盡可能地切除 多余的膠，置于干凈、已稱重的離心管中，稱重并記錄切下目的膠的重量；然后按照說明書 的步驟，依次加入各種溶液、離心、過柱、洗脫等，最后得到基因PCR回收產(chǎn)物，置于-20 'c保存。取少量進行回收效果電泳檢測。
待基因PCR擴增產(chǎn)物回收后，分別采用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶^""^/浙//7^////(1^&1"3 公司)進行雙酶切，同時對載體pET-28a (Novagen公司)進行雙酶切(37'c酶切過夜)， 酶切后使用乙醇沉淀回收。方法如下向酶切體系加入1/10體積的NaAc (3M， pH5.2)和 2.5倍體積的無水乙醇，經(jīng)-2(tc靜置60min后，12000卬m離心15min，棄上清，加500 、1 70 %的乙醇洗滌，12000rpm離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌一次，洗滌完后小心地倒盡液體， 用濾紙吸盡乙醇，置超凈臺中自然風(fēng)干，風(fēng)干后直接溶于適量的去離子無菌水。
將兩者回收后加入連接酶(Takara公司)，調(diào)節(jié)水溫16°c，之后連接過夜。將連接產(chǎn) 物與約100(11/)//5 感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30min后42。c熱激90s，并立即冰浴5min，加新 鮮LB培養(yǎng)基補足體積至lml，置于37'C搖床150rpm緩慢培養(yǎng)45min，取培養(yǎng)液10000rpm 離心30s，棄85(^1上清，余下菌液重懸均勻，涂布含卡那霉素(100 、g/ml) LB平板，待 轉(zhuǎn)化液被平板完全吸收后，于37'C倒置培養(yǎng)12 16小時。
從轉(zhuǎn)化平板中隨機挑取6個單菌落，接種到5ml按1:500比例添加卡那霉素(50mg/ml) 的LB液體培養(yǎng)基中，37'c培養(yǎng)8h，采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒。方法如下將菌液轉(zhuǎn)入 1.5mL微量離心管中，4'Cl0000g離心1 min，吸出培養(yǎng)液，力卩100 冰預(yù)冷的溶液I (50 mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl pH 8.0， 10 mmol/L EDTA)劇烈振蕩至細(xì)菌沉淀完全重 懸。室溫下靜止2min，力卩200hL現(xiàn)配的溶液I1 (0.2mmol/LNaOH， 1% SDS)，蓋緊管口，
快速上下輕微顛倒幾次混勻，冰浴5min，加15 Mu L冰預(yù)冷的溶液III (60mL 5mol/L乙酸鉀， 11.5mL冰乙酸，28.5mLH20)，反復(fù)顛倒幾次使粘稠的細(xì)菌裂解物分散均勻，冰浴5min。 4°C 下12000g離心7 min，轉(zhuǎn)移350pL上清到另一離心管，用等量體積的酚/氯仿抽提2次，加 2倍體積的冰冷無水乙醇，上下顛倒混勻。室溫靜置2min， 4。Cl2000g離心5 min。小心去 上清，75%乙醇洗滌2次，棄上清，再將附于管壁上的液滴除盡，用30pL含RNA酶的TE (pH8.0)溶解質(zhì)粒DNA，稍加振蕩，貯存于-2(TC。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進行雙酶切進 一步鑒定。如圖2所示，重組質(zhì)粒pET-28a-VA0760可酶切出與PCR產(chǎn)物大小相當(dāng)片段大 小一致的片段，表明基因已成功地插入到pET-28a載體中。運用Beckman CEQ末端標(biāo)記循 環(huán)測序?qū)⒁呀?jīng)克隆的重組質(zhì)粒VA0760進行序列測定。 實施例2
溶藻弧菌VA0760蛋白的表達(dá) 1預(yù)測氨基酸序列
基因VA0760為中等長度片段，并運用DNAssist軟件分析，獲得其完整的開放閱讀框
ORF
2重組子的原核表達(dá)
挑取重組質(zhì)粒的單菌落接種于lml按1:500比例添加卡那霉素(50mg/ml)的LB液體培 養(yǎng)基中37t:過夜培養(yǎng)至飽和，按l:100接種量接種飽和培養(yǎng)物到5mL的LB培養(yǎng)基中，于37'C 培養(yǎng)約2h至OD6。。約等于0.6左右。在培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為lmmol/L， 37。C繼續(xù)培養(yǎng) 3h。取出經(jīng)過誘導(dǎo)的培養(yǎng)物室溫高速離心lmin，收集菌體。同時設(shè)立對照組，沉淀重懸于 訓(xùn)nL2xSDS凝膠加樣buffer中，10(TC加熱5min。 12000rpm，離心10min。取適量上請樣品 上樣于12%SDS聚丙烯酰胺凝膠，電泳至溴酚蘭遷移到分離膠底部?？捡R斯亮藍(lán)染色，掃描 輸出照片。結(jié)果表明VA0760基因重組子已轉(zhuǎn)入E. coli BL21 并獲得陽性表達(dá)如圖3。其重組蛋 白大小約為41kD。因此重組蛋白的分子量在表達(dá)圖譜上與預(yù)期相符。 實施3
溶藻弧菌VA0760蛋白的純化
挑取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21/(DE3)，根據(jù)相應(yīng)的載體pET-28a，分別在含有 10Mu g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。隨即挑取單菌落，加5mLLB液于37℃ 振蕩過夜，按1:100的比例轉(zhuǎn)接至含抗生素的液體LB培養(yǎng)基200mL，37℃振蕩培養(yǎng)約2.5-3h， OD600-0.6時，于瓶中加IPTG (終濃度為1 mmol/L)進行誘導(dǎo)，30°C 200r/min搖3h。 6000g， 4℃離心10min收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體2次，稱菌體濕重。
收取的菌體以1:100 (g/mL)溶于buffer D(8M尿素；0.1MNaH2PO4 ; lOmmTris-HCl， pH 8.0)懸浮菌體，超聲破碎，輸出功率60%， 5s/次，間隔9s，超聲30min。超聲破碎后的 菌液，9000g， 4r離心15min，收集上清。超聲離心上清用Ni-NTA親和柱進行純化。采用 pH5.9(buffer F)和pH4.5(buffer G)兩個不同pH值的緩沖液純化蛋白。用沖洗緩沖液buffer E(8M尿素；0.1MNaH2PO4; lOmmTris-HCl, pH6.3)洗滌50次，每次lmL;用洗脫緩沖 液buffer F(8M尿素；0.1MNaH2PO4; lOmmTris-HCl， pH5.9)洗脫目的蛋白4次，每次lmL， 收集洗脫液；用洗脫緩沖液bufferG(8M尿素；0.1MNaH2PO4; 10mmTris-HCl， pH4.5)洗脫 蛋白4次，每次lmL，收集洗脫液。取收集液進行SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖4， Bradford蛋 白定量法定量，低溫保存?zhèn)溆谩?br> 實施例4
溶藻弧菌外膜蛋白VA0760對溶藻弧菌以及熒光假單胞菌的免疫保護作用 純化外膜蛋白VA0760共1.0mg，對鯽魚進行腹腔注射，每次免疫的抗原量為25、g/尾， 每組共20尾。首次免疫使用弗氏完全佐劑乳化，隔兩周加強免疫一次，加強免疫用弗氏不完 全佐劑乳化。同時對照組則注射生理鹽水。并且對健康的鯽魚進行溶藻弧菌以及熒光假單胞 菌半數(shù)致死劑量LD5o的測定，根據(jù)等對數(shù)間距選擇試驗濃度。在加強免疫后第10天，使用5 倍LD5。劑量的溶藻弧菌(5xl07cfU/mL)及熒光假單胞菌(5x 107 cfo/mL)進行攻毒保護性實 驗。腹腔注射攻毒后的第2天，對照組魚的游動開始變得遲緩，并不斷死亡，而具有免疫保 護作用的VA0760實驗組無異常反應(yīng)。5天后魚不再陸續(xù)死亡，觀察記錄實驗組和對照組對死 亡情況，注射溶藻弧菌以及熒光假單胞菌的對照組存活率分別為20%和5%，而實驗組 VA0760的免疫保護效果有明顯的差別，對溶藻弧菌的免疫保護率(RPS)高達(dá)75%，具有 顯著性差異(PO.Ol)。同時VA0760還顯示出對熒光假單胞菌的交叉保護作用，其免疫保護 率(RPS)為52.6% (P<0.05)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)計算表明VA0760具有顯著的免疫保護作用。說明 VA0760可以刺激機體產(chǎn)生保護性抗體，提高宿主免疫保護能力，是一個很好的免疫保護原。
序列表
<110>中山大學(xué)
<120〉溶藻弧菌外膜蛋白VA0760的表達(dá)和作為疫苗組份的應(yīng)用
<160>2
<210〉1 <211>1122 <212〉DNA <213>溶藻弧菌
<400>1
atgtcttacc taaagaaaag cctacttgcc acggcaatta ccggcatgat gttcagtggt 60
gttgcatttg ctgatggtgc aaacagtgac gcagcaaaag agtttctaac caaagattca 120
ttttcttatg 3agttt3cgg gatcatcgcg 3tgcaggccg cgtaccgcga ttacgattct 180
ggcagcaaag caacggacga tgacttgggt ggcatgcagc taaacaacga atctcgtatc 240
ggtttccgtg gtaagaaaca atttgctaac ttcgacccta cttttatttg gcaaatcgaa 300
ggcggttatg tagaccctag ctttggtggc gagggcgcag gtcttggtga acgtgacaca 360 ttcgtcggtt ttgaaagtgc atcttggggg caaattcgcc tgggtcgcgt tttgacacct 420
atgtacgaat tggttgactg gcctgcatct aaccctggcc tgggcgatgt atacgactgg 480
ggtggtgcta ttggtggcgc caagtaccaa gaccgtcaat caaacactat ccgctgggac 540
tctccaatgt ttgctgacaa attctcccta gatatcgcag ctggtgcagg tgataaagca 600
ggtctaggtg aaggggatga ctactggggt ggtatcgctg cacactacaa aattggtcct 660
atccagttag atgcggcata tgaaggtaac cgtaatatca agatggaaag ccaaacgtgg 720
gaaaacaaca cgtacttggt aggggcacaa ggctg柳g ataacggaat ctctttcttc 780
gcgcaataca aatacatgga ggcggacgca agcaatggtg tgagtgaaaa gcaagatgca 840
atgtctgccg ctatcatgta caccacgggt gattggcaat acaaactggc ttacgccgct 900
aactttgatc tagagcgtga tggtaagaaa attaacgata cagcggacga tgtgttatca 960
gcacaagtta tgtatttcgt agacccatcg gcagtgctgt acgtacgtgc tcgtactcta 1020gactttggcg acggtgcgtc tcaattagat aaaccaacag aagcacgttg gaagtctgct 1080 gactacgacg agttctctgt aggtgttgaa tactacttct aa 1122
<210>2 <211>378 <212>PRT <213>溶藻弧菌
<400>2
Met Ser Tyr Leu Lys Lys Ser Leu Leu Ala Thr Ala lie Thr Gly Met 15 10 15
Met Phe Ser Gly Val Ala Phe Ala Asp Gly Ala Asn Ser Asp Ala Ala
20 25 30
Lys Glu Phe Leu Thr Lys Asp Ser Phe Ser Tyr Glu Val Tyr Gly lie
35 40 45
lie Ala Met Gin Ala Ala Tyr Arg Asp Tyr Asp Ser Gly Ser Lys Ala
50 55 60
Thr Asp Asp Asp Leu Gly Gly Met Gin Leu Asn Asn Glu Ser Arg lie 65 70 75 80
Gly Phe Arg Gly Lys Lys Gin Phe Ala Asn Phe Asp Pro Thr Phe lie
85 90 95
Trp Gin He Glu Gly Gly Tyr Val Asp Pro Ser Phe Gly Gly Glu Gly
100 105 110
Ala Gly Leu Gly Glu Arg Asp Thr Phe Val Gly Phe Glu Ser Ala Ser
115 120 125
Trp Gly Gin He Arg Leu Gly Arg Val Leu Thr Pro Met Tyr Glu Leu
130 135 140
Val Asp Trp Pro Ala Ser Asn Pro Gly Leu Gly Asp Val Tyr Asp Trp 145 150 155 160
Gly Gly Ala lie Gly Gly Ala Lys Tyr Gin Asp Arg Gin Ser Asn Thr
165 170 175
lie Arg Trp Asp Ser Pro Met Phe Ala Asp Lys Phe Ser Leu Asp lie
180 185 l卯
Ala Ala Gly Ala Gly Asp Lys Ala Gly Leu Gly Glu Gly Asp Asp Tyr
195 200 205
Trp Gly Gly lie Ala Ala His Tyr Lys lie Gly Pro lie Gin Leu Asp
210 215 220
Ala Ala Tyr Glu Gly Asn Arg Asn lie Lys Met Glu Ser Gin Thr Trp 225 230 235 240
Glu Asn Asn Thr Tyr Leu Val Gly Ala Gin Gly Trp Phe Asp Asn Gly
245 250 255
lie Ser Phe Phe Ala Gin Tyr Lys Tyr Met Glu Ala Asp Ala Ser Asn
260 265 270
Gly Val Ser Glu Lys Gin Asp Ala Met Ser Ala Ala lie Met Tyr Thr
275 280 285
Thr Gly Asp Trp Gin Tyr Lys Leu Ala Tyr Ala Ala Asn Phe Asp Leu
290 295 300
Glu Arg Asp Gly Lys Lys lie Asn Asp Thr Ala Asp Asp Val Leu Ser 305 310 315 320
Ala Gin Val Met Tyr Phe Val Asp Pro Ser Ala Val Leu Tyr Val Arg
325 330 335
Ala Arg Thr Leu Asp Phe Gly Asp Gly Ala Ser Gin Leu Asp Lys Pro
340 345 350
Thr Glu Ala Arg Trp Lys Ser Ala Asp Tyr Asp Glu Phe Ser Val Gly
355 360 365
Val Glu Tyr Tyr Phe 370
權(quán)利要求
1. 一種溶藻弧菌外膜蛋白VA0760，其氨基酸序列序列表400<2>所示。
2. 編碼權(quán)利要求1所述的溶藻弧菌外膜蛋白VA0760的DNA，其核苷酸序列 如序列表400<2>所示。
3. 權(quán)利要求1所述的溶藻弧菌外膜蛋白VA0760作為疫苗組份的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1所述的溶藻弧菌外膜蛋白VA0760免疫保護作用的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1所述的溶藻弧菌外膜蛋白VA0760作為提高宿主免疫功能制劑 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的一種重組外膜蛋白(outermembrane proteins)VA0760的表達(dá)和疫苗組份的作用功能。本發(fā)明通過克隆溶藻弧菌重組外膜蛋白VA0760基因、表達(dá)及純化，純化產(chǎn)品可以顯著地提高魚類對溶藻弧菌、熒光假單胞菌等病原菌的抵抗力。可作為亞單位疫苗的候選靶位，且對控制弧菌感染的免疫學(xué)防治具有十分重要的意義。
文檔編號C12N15/31GK101386642SQ20081002983
公開日2009年3月18日 申請日期2008年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月29日
發(fā)明者彭宣憲, 惠 李, 熊莜鵬 申請人:中山大學(xué)