專利名稱::一種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及一種基因芯片及其檢測方法,特別是一種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法。
背景技術(shù):
:近期,越南已有十多人感染禽流感死亡。WHO專家已多次發(fā)出警告,一旦禽流感在人與人之間傳播,有可能像前幾次流感大流行一樣,導(dǎo)致人類數(shù)以百萬計死亡的大突難。東南亞的人禽流感和登革熱,非洲、美洲的黃熱病等等,人類正面臨各種新發(fā)傳染病和死灰復(fù)燃的傳染病的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。廣東省地處對外交流的前沿,每天出入境人員很多,各種病原體從外國傳入并導(dǎo)致流行的危險性時刻存在。其中一個關(guān)鍵問題在于多種病原體至今仍缺乏快速準(zhǔn)確的檢測方法。及時、準(zhǔn)確、快速地診斷是病毒性傳染病疾病防控非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。由于病毒性傳染病疾病早期癥狀都以發(fā)熱為主,僅靠臨床很難做出準(zhǔn)確診斷。因此,實驗室檢測極為重要。病毒感染常規(guī)的病原學(xué)診斷包括電鏡形態(tài)觀察、病毒分離、血清中病毒抗體的檢測,以及病毒抗原、病毒核酸的檢測。病毒分離法是檢測病毒的"金標(biāo)準(zhǔn),,方法,但病毒培養(yǎng)的周期較長,既費時又繁瑣,不利于疾病的早期診斷;血清學(xué)檢查常用的有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫熒光分析法(IFA)、中和試^^等,這些方法更多用于回顧性診斷,而非早期診斷;病毒核酸的檢測,如RT-PCR和實時熒光PCR技術(shù),具有高度的特異性和敏感性,已成為最常用的核酸診斷技術(shù)。然而病毒林的變異較快以及有些病毒具有多種血清型等因素,使得根據(jù)已知病毒序列設(shè)計出來的引物可能無法擴增出相應(yīng)的基因片段,常常導(dǎo)致假陰性結(jié)果。而尋找新的亞型和病毒抹也是常規(guī)PCR技術(shù)所無法勝任的。而且,這些方法基本上是要每一種病毒逐一排查,常常由于樣品量不夠,時間不允許,成本過高等因素變得無法在實際工作中得到落實。因此,急需一種高通量的技術(shù)來實現(xiàn)大范圍的快速篩查,才能滿足口岸衛(wèi)生檢疫既要確保國門安全、又要在高流量的情況下仍能做到人、物都快速通關(guān)的實際工作需要。基因芯片技術(shù)是最近十幾年國際上才興起的一種快速、自動化基因檢測新技術(shù)。利用計算機芯片制備過程中的精密加工技術(shù),將大量DNA探針分子固化于平方厘米大小的固體表面,在特定的條件下與熒光標(biāo)記的樣品分子進行雜交,然后通過激光共聚焦顯微鏡或CCD相機掃描并收集雜交信號,并利用生物信息學(xué)軟件對雜交結(jié)果進行進一步的分析。DNA芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因表達分析、多態(tài)性檢測、克隆選擇與文庫篩選、腫瘤及遺傳性疾病的突變檢測及診斷和致病機理研究、藥物篩選等多個領(lǐng)域。也有應(yīng)用于微生物鑒定方面的研究,但多數(shù)集中在細(xì)菌鑒定為主,病毒方面相對較少,國內(nèi)外都開始這方面研究工作,但尚未見有多病毒基因芯片試劑盒研制成功的報道。國際上基因芯片制備技術(shù)取得了重大突破,但可用于臨床基因診斷的產(chǎn)品尚未出現(xiàn)。在國內(nèi),已有個別就單個疾病的診斷芯片向國家SFDA開始了申報工作,但成熟產(chǎn)品尚未面市,多病毒診斷的綜合性基因芯片產(chǎn)品尚未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的在于克服上述技術(shù)缺陷,提供一種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片。本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用上述出入境^f企疫中常見病毒聯(lián)合才全測分型基因芯片檢測病毒的4企測方法。本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的,采用如下技術(shù)方案本發(fā)明的一種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片,包括固相載體及固定在固相載體上的寡核苷酸探針,寡核苷酸探針包括流感病毒探針、登革熱病毒探針、黃熱病病毒探針和乙腦病毒探針。。流感病毒探針包括流感病毒H1N1型和流感病毒H3N2型。登革熱病毒探針包括登革熱病毒I型、登革熱病毒II型、登革熱病毒III型和登革熱病毒IV型。寡核苷酸探針序列為如SEQIDNO.1-SEQIDNO.22的寡核苷酸片段。本發(fā)明的一種利用上述的出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片檢測病毒的方法包括以下步驟(1)病毒核酸的提取及反轉(zhuǎn)錄;(2)病毒核酸的限制性熒光標(biāo)記;(3)雜交和檢測。其中,步驟(2)病毒核酸的限制性熒光標(biāo)記包括以下步驟(1)cDNA的限制性酶切取逆轉(zhuǎn)錄得到的cDM,用Sau3AI進行酶切,得到具有GATC的粘性末端的cDNA片段;(2)將步驟(1)得到的酶切片段加接頭將步驟(1)得到的酶切片段與與兩條寡核苷酸SIP、SIR退火,所迷SIP的序列為pGATTCACACCAGCCAAACCCA、所述SIR的序列為GGTTTGGCTGGTGTG;(3)以步驟(2)得到的已加接頭的酶切片段為模板,用熒光標(biāo)記的通用引物U進行PCR擴增。本發(fā)明的一種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片采用特異性的60mer寡核苦酸作為流感病毒、登革熱病毒、黃熱病病毒和乙腦病毒等病原體診斷芯片檢測的探針,可以一次檢測多種病原體,并能有效的分型。相對于一些PCR產(chǎn)物作為探針或短鏈的寡核苷酸來說,長鏈寡核苷酸作為探針具有較高的特異性,因而以60mer寡核苷酸作為探針可以有效的降低假陽性率。本發(fā)明的一種利用上述出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片檢測病毒的檢測方法中采用了限制性熒光標(biāo)記技術(shù)處理臨床咽漱液及血清樣品。臨床樣品中病毒的拷貝數(shù)可能比較低,用常規(guī)的隨機引物延伸標(biāo)記效率低,因而大多數(shù)研究者采用數(shù)對特異性引物進行PCR擴增后檢測,這種方法不能體現(xiàn)芯片檢測的優(yōu)越性,且有漏診的可能。采用限制性熒光標(biāo)記,可對病毒全基因組進行擴增,從而對提高檢出率有較大意義。此外,限制性標(biāo)記技術(shù)并非針對特定靶片段設(shè)計,故無論樣品中有何種病原體的核酸,都可以得到有效擴增,有效克服PCR擴增法熒光標(biāo)記樣品時多種引物互相干擾、擴增病毒核酸受很大限制等缺點,解決了一個檢測芯片同時檢測多種病毒時遇到的關(guān)鍵問題。應(yīng)用在多種病原體高通量檢測上,有重要的意義。大量的實驗結(jié)果證實,該技術(shù)標(biāo)記樣品,芯片檢測靈敏度、準(zhǔn)確度都大幅度提高。本發(fā)明將流感病毒探針、登革熱病毒探針、黃熱病病毒探針和乙腦病毒探針多種病毒探針集合在同一芯片的多種病毒聯(lián)合芯片,在同一實驗條件下,負(fù)&準(zhǔn)確檢測出各種病毒核酸,同時可以對曱型流感病毒H1N1和H3N2亞型、登革病毒I-IV型作分型。該類檢測芯片不但可應(yīng)用于出入境檢驗檢疫系統(tǒng)口岸疾病監(jiān)測時大規(guī)模樣本的篩查,而且可應(yīng)用于疾病預(yù)防控制系統(tǒng)、醫(yī)院等單位的疾病監(jiān)測,對及早發(fā)現(xiàn)和控制該類傳染病非常重要。圖1是本發(fā)明的一種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片的芯片陣列設(shè)計圖的一個優(yōu)選實施例;圖2是甲型流感病毒H1N1、H3N2、登革病毒I-IV型、JEV(乙腦病毒)和YFV(黃熱病毒)分別與本發(fā)明的基因芯片的雜交結(jié)果;圖3是DVI(登革熱I型)RNA樣品RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝月交電泳圖4是DVI(登革熱I型)樣品的芯片雜交結(jié)果;圖5是芯片穩(wěn)定性實驗結(jié)果;圖6是^^擬樣品污染實驗雜交結(jié)果圖7是模擬樣品降解實驗雜交結(jié)果圖。具體實施例方式為使本發(fā)明更加容易理解,下面將進一步闡述本發(fā)明的具體實施例。實施例1本發(fā)明的一種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片的制備的一個優(yōu)選實施例。(1)60mer寡核苷酸探針及陣列的設(shè)計根據(jù)以下原則①Tm值在78°C±5°C;②重復(fù)的堿基連續(xù)不超過6個,③探針內(nèi)部的發(fā)夾結(jié)構(gòu)不超過6個;④BLAST與其它序列的相似性小于40%;BLAST比較與其它基因的重復(fù)片段連續(xù)不超過20個堿基。另外加入陰性和空白對照各3個,將芯片設(shè)計成12x14的陣列。(2)60mer寡核苷酸基因芯片的制備參照斯坦福大學(xué)PatBrown實驗室方案,用poly-L-lysine溶液包被DAKO硅烷化玻片,室溫放置2周備用。用ABI公司3900DNA合成儀合成寡核苷酸片段后,將其溶解在50%DMSO中,調(diào)整終濃度為lmg/mL,選取HBV70meroligo作為陰性對照,50%DMSO為空白對照,用CartesianPixsys5500基因芯片打印儀將探針片段打印成12x14的陣列,將芯片正面朝下至于3xSSC鹽水濕盒上方再水合化,然后迅速的置入IO(TC溫箱中干燥,用紫外交聯(lián)儀以65mJ的總能量進行交聯(lián)固定,以使探針共價交聯(lián)結(jié)合在玻片表面,用封閉液(335mll-曱基-2-吡咯酮烷,6g琥珀酸酐,1^11M硼酸鈉pH8)進行封閉后備用。實施例2本發(fā)明的一種出入境4企疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片陣列的一個優(yōu)選實施例。將根據(jù)試驗結(jié)果篩選出的22條寡核苷酸探針、2條GFP陽性外對照探針和polyU陽性內(nèi)對照探針一起打印在芯片上,同時設(shè)置空白對照,進一步優(yōu)化多種病毒聯(lián)合檢測芯片實驗條件。每個探針6個重復(fù)點,點距為300nm。陣列設(shè)計如圖1。實施例3本發(fā)明的一種利用出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片檢測病毒的檢測方法中病毒核酸的提取及反轉(zhuǎn)錄步驟的一個優(yōu)選實施例。采用樣品加等體積水飽合酚混勻,65。C加熱10min后在迅速水上冷卻,加1/2體積氯仿抽提,取上清加1/10體積pH5.2的3MNaAc,2倍體積無水乙醇于-80°<:沉淀301^11,4'C離心沉淀,70%乙醇洗滌后干燥,加DEPC水溶解。取上述制備的RNA5pL,10mMdNTP5(iL,5x第一鏈緩沖液10(iL,RnaseInhibitor2-5^L,隨機引物5^L,反轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptII2.5[xL,力oDEPC處理水至50|oL總體積。42。C反應(yīng)50min。向第一鏈反應(yīng)混合物中加入10x第二鏈緩沖液25joL,E.coliDNAPol4pL,E.coliRNAseHl|oL,E.coliDNALigase1.5pL,力口ddH20至總體積250nL,12。Clh,22。Clh,加入2.5pL0.5MEDTA中止反應(yīng)后用酚氯仿(25:24)抽提一次,乙醇醋酸鈉沉淀后溶于l(^LddH20中。實施例4本發(fā)明的一種利用出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片檢測病毒的檢測方法中病毒核酸的限制性熒光標(biāo)記的一個優(yōu)選實施例。(1)cDNA的限制性酶切取全量逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA,加入1.6(jL&m3AI,2.4|iL10xH酶切緩沖液,用ddH20將體積調(diào)定到24jxL,在37。C下酶切4h,IO(TC水浴2min滅活,酶切后所有cDNA片段均具有GATC的粘性末端。(2)酶切片段加接頭酶切片段兩端加上的通用接頭由兩條單鏈寡核苷酸SIP(500pg4iL)、SIR(600iag/nL)逐漸降溫退火而成,含有可與Sau3AI酶切位點互補的粘性末端。在EP管中加入cDNA酶切反應(yīng)液,3^L通用接頭,2pLT4DNA連接酶,10xbuffer,17pLddH20,16。C保持2h,最后以PharmaciaS-400離心柱除去接頭二聚體和小于100bp的小片段,收集洗脫液作為限制性熒光標(biāo)記的模板。(3)限制性cDNA片段的熒光標(biāo)記根據(jù)接頭序列和內(nèi)切酶粘端序列設(shè)計熒光標(biāo)記的通用引物U,于PE公司9700型PCR儀進行擴增并熒光標(biāo)記,反應(yīng)體系為3pL通用引物,lpL加接頭的cDNA反應(yīng)液,25(jL2xPCR預(yù)混液,21ddH20,反應(yīng)參數(shù)為95°C變性5min,(95。C30s,60。C30s,72。C60s)共25個循環(huán),72。C延伸7min,-20°(:儲存。實施例5雜交與檢測分析的一個優(yōu)選實施例。(1)雜交取5^1熒光標(biāo)記好的限制性cDNA片段加入等體積的2x雜交液(50%Formamide、10xSSC、0.2%SDS),95。C變性5min,最大速度離心2min冷卻,滴加到陣列上,蓋上蓋玻片封閉,42。C雜交2h。然后依次在2xSSC/0.1%SDS,0.1xSSC/0.1%SDS,O.lxSSC溶液中清洗玻片,滅菌水漂洗后,無水乙醇脫水,室溫下干燥。(2)掃描結(jié)果的分析及統(tǒng)計學(xué)處理用Agilent48道芯片掃描儀掃描芯片,F(xiàn)eatureExtraction軟件分析數(shù)據(jù)處理分析所有探針的以熒光強度取均值,以Cy5的雜交信號為參照,對Cy3熒光標(biāo)記的檢測信號進行均一化處理。芯片的診斷以均一化值ratio值來判斷均一化值計算R卜(探針Cy3熒光值-空白對照Cy3熒光值)/(探針Cy5熒光值-空白對照Cy5熒光值);R2=探針Rl值x2/(陽性內(nèi)對照1的Rl值+陽性內(nèi)對照2的Rl值);R3=HIV探針的R2/陰性對照的R2(2.73.3)結(jié)果判斷R3小于2.7的為陰性;R3大于等于2.7和小于等于3.3的為可疑樣本;R3大于3.3的為陽性。通過分析,確定芯片打印及雜交條件是否均一,評價結(jié)果的敏感度和精確度,并對點樣和雜交的過程做進一步的優(yōu)化。實施例6芯片特異性實驗一個優(yōu)選實施例。芯片上打印有2條60mer的GFP寡核苷酸探針,針對不同的RNA或者DM樣品,在樣品的標(biāo)記過程中分別摻入相應(yīng)的GFP基因的DNA和RNA,用RD標(biāo)記后的樣品與芯片雜交并檢測其熒光信號,通過對芯片上熒光信號的判讀來確定樣品中是否含有要檢測的目的基因。如果芯片上除了陽性內(nèi)對照探針poly(U)外,其它揮:針全為陰性,那么可能樣品并非真的陰性,而見良應(yīng)條件的不佳或者操作的失誤導(dǎo)致樣品標(biāo)記效率低所引起的;只有作為陽性外對照的GFP探針為陽性而診斷探針為陰性時才可以判斷為陰性結(jié)果。經(jīng)優(yōu)化后設(shè)計的芯片能對曱1型流感病毒、甲3型流感病毒、DV1~4型、JEV和YFV進行聯(lián)合;f企測及分型。不同樣品與改進后的芯片雜交結(jié)果如圖2所示,結(jié)果表明上述芯片能將甲型流感病毒H1N1、H3N2、登革病毒14型、JEV和YFV明確的分別檢測出來。篩選出的oligo探針都能特異性地與相應(yīng)樣品雜交,檢測到較強的熒光信號,而陰性及空白對照探針均沒有檢測到信號。用所制備的芯片檢測HBV、HCV、HDV等其他病毒樣品,結(jié)果均為陰性,顯示有較好的特異性。實施例7芯片檢測靈敏度比較的一個優(yōu)選實施例。為了比較芯片與其它方法的靈敏度,我們將芯片方法與熒光RT-PCR檢測方法在PCR產(chǎn)物水平進行了比較。將登革病毒I型的RNA樣品進行101、102和103倍稀釋,然后進行逆轉(zhuǎn)錄、熒光標(biāo)記后分別與芯片進行雜交,掃描芯片并通過分析軟件GenPix6.0分析熒光強度(方法同前),同時用RT-PCR技術(shù)檢測相應(yīng)樣品,RT-PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖電泳檢測。檢測結(jié)果圖如圖3。登革病毒I型的RNA樣品101、102和103倍稀釋后,分別進行RT-PCR;f企測及與芯片進行雜充其結(jié)果如圖丄4所示,由上述結(jié)果可知病毒檢測芯片的靈敏度與普通RT-PCR基本相同。實驗中將登革病毒I型的RNA樣品進行101、102和103倍稀釋后分別進行RT-PCR檢測及與芯片進行雜交,RT-PCR檢測結(jié)果表明當(dāng)樣品稀釋至102倍時,瓊脂糖電泳不能檢測出相應(yīng)的條帶片段,而芯片檢測結(jié)果也是當(dāng)樣品稀釋至102倍時,相應(yīng)的特異性探針未能檢測出陽性熒光信號。說明上述方法制備的病毒檢測基因芯片的靈敏度與普通RT-PCR基本相同。實施例8芯片穩(wěn)定性實驗的一個優(yōu)選實施例。將制備好的芯片取四片儲存于37。C溫箱中加速保存(此條件下保存1天相當(dāng)于在4。C條件下保存1.5個月)的條件下對芯片的穩(wěn)定性進行驗證,留樣觀察期為8天,分別于第2、4、6、8天進行取樣檢測①芯片外觀,看有無顏色變化;②與熒光標(biāo)記后的JEV樣品雜交,觀察雜交結(jié)果。雜交、洗脫、掃描及數(shù)據(jù)分析方法參照前面章節(jié)。結(jié)果見圖5。實驗中通過將芯片儲存于37t:溫箱中加速保存的條件下對芯片的穩(wěn)定性進行驗證,在留樣觀察期8天內(nèi),第2、4、6、8天的取樣檢測結(jié)果均合格,并且與熒光標(biāo)記后的JEV樣品雜交后其雜交特異性良好,說明本實驗室制備的芯片保質(zhì)期至少為十二個月。實施例9芯片重復(fù)性實驗的一個優(yōu)選實施例。選捧登革病毒I型及甲型流感病毒H1N1、H3N2進行芯片檢測的重復(fù)性實驗,每樣品分別用5張芯片進行4企測,具體的樣品處理、芯片的雜交、洗脫、掃描及數(shù)據(jù)分析方法參照前面章節(jié)。選擇登革病毒l型及曱型流感病毒H1N1、H3N2進行芯片檢測的重復(fù)性實驗,具體的檢測結(jié)果見表l,該檢測結(jié)果表明應(yīng)用上述方法制備的寡核苷酸芯片檢測上述中傳染性病毒樣品具有較好的重復(fù)性。選擇登革病毒I型及曱型流感病毒HlNl、H3N2進行芯片檢測的重復(fù)性實-瞼,表l為芯片的重復(fù)性檢測結(jié)果,表中數(shù)據(jù)表明,應(yīng)用上述方法制備的寡核苷酸芯片檢測傳染性病毒樣品具有較好的重復(fù)性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*SNR為每種病毒樣品特異探針點的熒光信號値與背景信號値之比(信噪比)實施例10模擬樣品污染實驗(1)取K562細(xì)胞加接頭的連接產(chǎn)物(含GFP樣品加接頭產(chǎn)物)各5pL,分別加入至2個0.2mL的Ep管中,標(biāo)記為實驗管和對照管。(2)取熒光標(biāo)記DV1樣品l|iL,稀釋100倍,從稀釋液中各取l|xL加入上述實驗管和對照管中。(3)在實驗管中加入以下反應(yīng)液反應(yīng)物體積Sau3AIlpl10xH緩沖液1^1ddH202p_l對照管中加入4plddH20,同時置于37。Clh,IO(TC2min終止反應(yīng)。(4)對上述實驗管和對照管中的樣品進行熒光標(biāo)i已具體方法參照實施例4。(5)芯片的雜交、洗脫、掃描及數(shù)據(jù)分析方法參照實施例5所述。(6)比較上述兩樣品的雜交結(jié)果。雜交結(jié)果見圖6,結(jié)果顯示實驗管樣品的雜交結(jié)果未受到模擬污染片段的影響,而對照管樣品的雜交結(jié)果則出現(xiàn)了假陽性。實施例11模擬樣品降解實驗(1)取DV1和GFP混合RNA樣品各9^1,分別加入至2個0.2mL的Ep管中,標(biāo)記為實驗管和對照管。(2)取l]tiLRNaseA(20ug/mL),稀釋100倍,從稀釋液中取lpL加入上述實驗管中,對照管中加入DEPC處理水。(3)對上述實驗管和對照管中的樣品進行逆轉(zhuǎn)錄及熒光標(biāo)記,具體方法參照實施例3和實施例4。芯片的雜交、洗脫、掃描及數(shù)據(jù)分析方法參照實施例5所述。(4)比較上述兩樣品的雜交結(jié)果。實驗結(jié)果見圖7,結(jié)果表明實驗管樣品的雜交結(jié)果受到RNaseA的影響,僅陽性內(nèi)對照有陽性信號,出現(xiàn)了假陰性,而對照管樣品的雜交結(jié)果則陽性內(nèi)對照、陽性外對照以及特異性診斷探針均能檢測出陽性信號。最后所應(yīng)當(dāng)說明的是,以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制,盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換,而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。14序歹'J表<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>A/HA1<400>1aacaaagagaaagaagtccttgtactatggggtgttcatcacccgcctaacataggggac60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>A/HA3<400>2ttgggagaccctcattgtgatggcttccaaaataaggaatgggacctttttgttgaacgc60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>A/HA3<400>3atcgagaaaacgaacgagaaattccatcaaattgaaaaagaattctcagaagtagaaggg60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>A/HA1<400>4ggagcagacggagtaaaggggttttcatacaaatatggtaatggtgtttggataggaagg60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>A/MP<400>5ctcccagcacaggtctcataggcaaatggtggcaacaaccaatccattaataaggcatga60<no〉廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>A/MP<400>6tcaggccaggcaaatggtgcaggcaatgagagccattgggactcatcctagctccagtgc60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>DV1<400>7ccgagggggagagccgcacatgatagttagcaagcaggaaagaggaaaatcacttttgtt60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>24<170>Patentlnversion3.2<210>1<211〉60<212>DNA<213>DV1<400>8ggattgttgggcaggtctcaagtaggagtaggagtttttcaagaaggcgtgttccacaca60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>DV1<400>9tggaaaccccaaatctagccgaaagagtcctcgactggttgaaaaaacatggcaccgaga60<110>廣東出入境檢驗4全疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>DV2<400>10ggggaacccaccctgaatgaagagcaggacaaaaggtttgtctgcaaacattccatggta60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>DV2<400〉11aatcattcccagcatgttcgagccagagcgtgaaaaggtggatgccattgacggtgaata60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>DV2<400>12ctccttgctattgggtgttactcacaagtcaaecctataaccctcacagcggctcttctt60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>DV3<400>13ggcccagaacatactcacagcaatccaacaggtgagaagcctcataggcaatgaagagtt60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>DV3<400>14gataactcccaggtcaccatcggtggaagtcaaattgccggactatggagaactaacact60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>'Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>DV4<400>15ggcag沐atgctactagtcttgtgtgctggacaactactcttgatgagaacaacatggg60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>DV4<400>16ttagaggagaccccccgcacaacaacaaacagcatattgacgctgggagagaccagagat60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>YFV<400>17cgtggaacgcctggccgtcatgggagacaccgcctgggatttcagctccgctggagggtt60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>YFV<400>18ggaggcccagttagctctcacaatcatatccctggatacaaggttcagacgaacggacct60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>YFV<400>19aaaccgagcttgttcaaagtgaggaatgggggagaaatcggggctgtcgctcttgactat60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>JEV<400>20gaatgcagtggacctcagtgtggttgtgaacaagcccgtgggaagatatcgetcagcccc60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>JEV<400>21gacctcagtgtggttgtgaacaagcccgtgggaagatatcgctcagcecctaaacgccta60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>JEV<400>22gacttcggctttggcatcacatcaacccgt卿ggctgaaaattagagaggagagcact60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>21<212>DNA<213>SIP<400>23gatccacaccagccaaaccca21<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>15<212>DNA<213>SIR<400>24ggtttggctggtgtg15<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>GFP1<400>25ccgtcctcgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttgtcg60<110>廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心<120>—種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法<160>26<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>GFP2<400>26ctgttgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgatg60權(quán)利要求1.一種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片,包括固相載體及固定在固相載體上的寡核苷酸探針,其特征在于所述寡核苷酸探針包括流感病毒探針、登革熱病毒探針、黃熱病病毒探針和乙腦病毒探針。2、如權(quán)利要求l所述的一種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片,其特征在于所述流感病毒探針包括流感病毒H1N1型和流感病毒H3N2型。3、如權(quán)利要求1所述的一種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片,其特征在于所述登革熱病毒探針包括登革熱病毒I型、登革熱病毒II型、登革熱病毒ni型和登革熱病毒iv型。4、如權(quán)利要求1所述的一種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合^f企測分型基因芯片,其特征在于所述寡核苷酸4笨針序列為如SEQIDNO.1-SEQIDNO.22的寡核苷酸片段。5.—種利用如權(quán)利要求1至4之一所述的出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片的;f企測方法,其特征在于包括以下步驟(1)病毒核酸的提取及反轉(zhuǎn)錄;(2)病毒核酸的限制性熒光標(biāo)記;(3)雜交和檢測。6.如權(quán)利要求5所述的一種檢測方法,其特征在于所述步驟(2)包括以下步驟(1)cDNA的限制性酶切取逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA,用Sau3AI進行酶切,得到具有GATC的粘性末端的cDNA片段;(2)將步驟(1)得到的酶切片段加接頭將步驟(1)得到的酶切片^:與兩條寡核苷酸SIP、SIR退火,所述SIP的序列為pGAITCACACCAGCCAAACCCA、所述SIR的序列為GGTTTGGCTGGTGTG;(3)以步驟(2)得到的已加接頭的酶切片段為模板,用熒光標(biāo)記的通用引物U進行PCR擴增。全文摘要本發(fā)明提供了一種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測分型基因芯片及其檢測方法。本發(fā)明的一種出入境檢疫中常見病毒聯(lián)合檢測及分型基因芯片,包括固相載體及固定在固相載體上的寡核苷酸探針,寡核苷酸探針包括流感病毒探針、登革熱病毒探針、黃熱病病毒探針和乙腦病毒探針。本發(fā)明采用病毒核酸的限制性熒光標(biāo)記的方法對待檢核酸進行處理。本發(fā)明將流感病毒、登革熱病毒、黃熱病毒、乙腦病毒多種病毒的探針集合在同一芯片的多種病毒聯(lián)合芯片,能準(zhǔn)確檢測出各種病毒核酸,同時可以對甲型流感病毒H1N1和H3N2亞型、登革病毒I-IV型作分型。文檔編號C12Q1/70GK101386892SQ200810029988公開日2009年3月18日申請日期2008年8月5日優(yōu)先權(quán)日2008年8月5日發(fā)明者濤商,師永霞,幸蘆琴,張海燕,李小波,燁洪,相大鵬,胡龍飛,夔鄭,鄭文嶺,郭波旋,鐘玉清,馬文麗,黃吉城申請人:廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心;南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所