專利名稱：一種培養(yǎng)篩選微生物菌種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物菌種的篩選方法，具體是對極端環(huán)境樣品中微生物菌 種的篩選分離培養(yǎng)方法。
技術(shù)背景微生物特別是極端環(huán)境(如酸/堿/溫/冷/鹽樣品、深海樣品、火山口樣品、 高海拔樣品、太空樣品等)中的微生物，在自然生物、地球化學(xué)循環(huán)等方面 扮演著極為重要的角色。研究極端環(huán)境微生物不僅有助于我們了解和認(rèn)識生 命起源與生命進(jìn)化，極端環(huán)境的耐受機(jī)制以及其與環(huán)境之間的相互作用等； 而且其基因資源、酶資源及其代謝產(chǎn)物資源產(chǎn)業(yè)被稱為21世紀(jì)可持續(xù)發(fā)展的 朝陽產(chǎn)業(yè)。微生物菌種資源，特別是具有特殊價(jià)值的菌種資源的爭奪已成為 當(dāng)今國際生物資源爭奪的一個(gè)重要組成部分。微生物種類繁多、分布極為廣泛，但目前受技術(shù)的限制，超過99%的微 生物是未知的，或在當(dāng)前認(rèn)識水平或試驗(yàn)條件下是"不可培養(yǎng)的"。為此，研究 建立新的微生物培養(yǎng)與選育方法，突破傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法的制約，以獲得 更多的微生物的種類，是當(dāng)今微生物工作者迫切需要解決的問題。近年來， 微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)、宏基因組技術(shù)、生物信息技術(shù)、地球化學(xué)物質(zhì)循環(huán) 分析相關(guān)技術(shù)及多學(xué)科強(qiáng)交叉學(xué)科平臺(tái)的形成等，這些為建立新的微生物培 養(yǎng)與選育方法提供了強(qiáng)力的支持。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種從各類樣品中篩選所含微生物菌種的方法，即 通過建立樣品中各類微生物的個(gè)性化富集培養(yǎng)體系，來富集分離樣品中的微 生物菌種。本發(fā)明微生物菌種培養(yǎng)篩選方法的詳細(xì)技術(shù)方案包括以下步驟1) 樣品處理及DNA抽提溶解洗滌樣品，收集菌體顆粒物質(zhì)，去雜質(zhì)， 收集沉淀物；酚一氯仿一異戊醇抽提沉淀物中的DNA;2) PCR擴(kuò)增，克隆、酶切、測序及序列分析，檢測樣品中微生物種類多 樣性分別采用細(xì)菌、古細(xì)菌和真菌通用引物擴(kuò)增DNA抽提物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 凝膠電泳檢測后用凝膠回收試劑盒純化，純化產(chǎn)物連接克隆后通過藍(lán)白篩選陽性克隆子；再對陽性克隆子進(jìn)行克隆序列的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切電泳后 初步判斷樣品中所含微生物的種類數(shù)；對各種類進(jìn)行測序分析，獲知樣品中 的微生物種類、豐度、生物多樣性和分布規(guī)律；3)微生物菌種的個(gè)性化富集培養(yǎng)用掃描電鏡分析樣品的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)； 用能譜儀、X-射線采集樣品礦物元素的成份及其有機(jī)物種類的信息；采集樣 品所在的環(huán)境信息，包括溫度、酸堿度、鹽度等；通過序列比對分析，初步 判斷各類微生物的種屬及生長特征情況，參照已有的該類微生物的相關(guān)信息； 對于新種則參照與之在系統(tǒng)發(fā)育樹中親緣關(guān)系最近的微生物的生長環(huán)境特點(diǎn) 等信息；根據(jù)上述信息建立個(gè)性化富集培養(yǎng)體系；應(yīng)用個(gè)性化富集培養(yǎng)體系 富集各類微生物，分離純化各富集分離物，獲得純培養(yǎng)物。在本發(fā)明的步驟l)中，抽提沉淀物中的DNA的步驟具體為① 向沉淀物中加入高濃度細(xì)胞裂解液，充分混勻，放入沸水浴中8 15min;② 55 65。C水浴30min以上；③ 隨后72。C水浴30min以上；④ 加入酚/氯仿/異戊醇混和液，混勻，在室溫下靜置10min左右，離心， 將上清液用酚/氯仿/異戊醇重復(fù)抽提，收集上清液；⑤ 上清液用-20。C 4。C的無水乙醇沉淀，沉淀溫度為4°C ，沉淀時(shí)間30 min 以上，離心收集沉淀；⑥ 用濃度為70%的乙醇洗滌沉淀物兩次；⑦ 沉淀物置于室溫或真空干燥，用TE或無菌去離子水溶解沉淀，即得到 基因組DNA提取液。上述細(xì)胞裂解液包括以下各組分0.10 0.3Omol/L的EDTA; 0.005 0.15mol/L的Tris'HCl; 0.10 0.3Omol/L的NaCl水溶液；質(zhì)量百分濃度為2°/。
7.5%的SDS;質(zhì)量百分比濃度為0.30% 0.75%的CTAB。本發(fā)明區(qū)別于傳統(tǒng)的選擇性篩選培養(yǎng)、富集培養(yǎng)等方法，其優(yōu)點(diǎn)是先用 分子生態(tài)相關(guān)技術(shù)檢測樣品中所含微生物的種類、豐度等特征信息；再根據(jù) 各種屬的生長代謝特征、該菌所在樣品的生長環(huán)境特點(diǎn)(如溫度、酸堿度、 鹽度和物質(zhì)組成等)等系列信息建立分別適合各微生物生長的個(gè)性化富集培 養(yǎng)體系，有的放矢的富集與選育樣品中特定的微生物。采用該方法能使得更 多的"不能培養(yǎng)的微生斷'變成可培養(yǎng)的。本方法克服了在分離培養(yǎng)樣品中微生 物種類的過程中，存在的效率低、損失新種的概率大、樣品耗量大、隨機(jī)性與盲目性程度高等問題，針對各類樣品特別是珍稀樣品，能分離培養(yǎng)出更多 的微生物種類，從而提高了從樣品培養(yǎng)和選育微生物的產(chǎn)率和種類數(shù)。


圖l:實(shí)施例中沉積物礦物元素的能譜圖；圖2:菌株DS-0205的光學(xué)顯微圖xi000;圖3:菌株DS-0205的SEM圖20KVx5500;圖4:菌株DS-0205的TEM圖100KV x46800;圖5:菌株DS-0205的莢膜染色圖；圖6:菌株DS-0205固體培養(yǎng)7天后的菌落形態(tài)；具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖，以富集分離深海沉積樣品中微生物進(jìn)一步詳述本發(fā)明的 具體實(shí)施(一)樣品中總基因組的抽提(1) 在無菌條件下，稱取深海沉積樣品3g并移入體積為50ml的無菌帶蓋 的離心管中，加30ml無菌人工海水基本鹽，充分振蕩后置于搖床上以180rpm 速率勻速搖10-20 min，然后3000rpm離心3min，上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管 中；沉淀再重復(fù)洗滌兩次，均收集上清液，沉淀保存?zhèn)溆谩?2) 上清液，以12000rpm離心15min，收集沉淀。(3) 往沉淀中加入20ml滅菌磷酸鹽緩沖液，充分振蕩后置于搖床上以 180rpm速率勻速搖10min，以12000rpm離心15min，收集沉淀。(4) 重復(fù)步驟(3)兩次。沉淀即為實(shí)驗(yàn)樣品。顯微鏡下初步觀察樣品中微生 物的形態(tài)。(5) 把樣品完全轉(zhuǎn)移到5ml離心管中，加入高濃度細(xì)胞裂解液的配置(總 體積100ml)為Tris HCl(pH8.0， lmol/L) 12.5ml; EDTA(pH8.0, 0.5mol/L)， 50ml; 5ml濃度為5mol/L的NaCl溶液；25ml質(zhì)量百分比濃度為20%的SDS; 7.5ml質(zhì)量百分比濃度為10。/。的CTAB。充分振蕩10min，立即放入沸水浴中 并開始計(jì)時(shí)8 15min。如果樣品中以革蘭氏陰性菌居多時(shí)，則沸水浴時(shí)間控 制在10min以內(nèi)；如果樣品中主要以革蘭氏陽性菌或細(xì)胞壁外有莢膜或多糖 或胞外吸附眾多的顆粒物的微生物居中多時(shí)，沸水浴時(shí)間最好控制在10 15min,每隔2 3min輕輕翻轉(zhuǎn)離心管5 8次。(6) 接著轉(zhuǎn)入55 65。C水浴中水浴lh，每隔15min輕輕翻轉(zhuǎn)離心管5 8次。(7) 隨后轉(zhuǎn)入72。C水浴中水浴lh，每隔15min輕輕翻轉(zhuǎn)離心管5 8次。(8) 向離心管中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(V/V/V: 25: 24: 1)，上下 輕輕倒轉(zhuǎn)離心管15min后，隨后室溫靜置10min，接著12000rpm離心5min， 輕輕收集上清液并轉(zhuǎn)入到新的離心管中。(9) 重復(fù)步驟(8)—次。柳往離心管中加入2.5倍體積的-20'C冷凍的無水乙醇，上下輕輕倒轉(zhuǎn)離 心管10次后，置于4'C冰箱中沉淀至少lh。沉淀完畢后12000rpm離心15min，收集沉淀。(11)向載有沉淀的離心管中加入2ml70。/。的乙醇，輕輕倒轉(zhuǎn)溶液8次后靜 置15min,隨后12000rpm離心15min，棄上清，收集沉淀。 肪重復(fù)步驟(ll)一次。(13)沉淀物置于室溫或真空干燥后，加適量TE或無菌雙蒸水溶解沉淀， 即為基因組DNA提取液，4'C保存?zhèn)溆谩?二) PCR擴(kuò)增，克隆、酶切、測序及序列分析分別用細(xì)菌、古細(xì)菌與真菌的16SrDNA、 16SrDNA和18SrDNA通用引 物擴(kuò)增從樣品中獲得的總基因組DNA。選用的細(xì)菌16SrDNA通用引物為 (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAGA-3'， 5'-GTTACCTTGTTACGACTT-3');選 用的古細(xì)菌16SrDNA通用引物為5'-TTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3'， 5'-CTTTCGGTCGCCCCTACT-3'; 選用的真菌 18SrDNA通用引物 為:5 '-ACCTGGTTGAT CCTG C國3'， 5 '國TGATCCTTCYGCAGGTTCAC陽3'。下面以真菌的擴(kuò)增為例在50jxlPCR反應(yīng)體系組成5pl的10xPCRbuffer， 3^1的2.5mMMgCl2， 的0.2mMDntp，每一條引物l(J， 4^1的DNA樣品， 1^1的2.5單位的Taq polymerase, 34^1的ddH20。 PCR擴(kuò)增步驟95。C4min; (94。C60s， 60。C90s， 72。C2.5min; 30~32循環(huán);72。C6min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠 電泳檢測后，用膠回收試劑盒純化回收，隨后按照真菌克隆試劑盒操作說明 進(jìn)行操作，克隆子經(jīng)藍(lán)白篩選，擴(kuò)增陽性克隆子；擴(kuò)增片段經(jīng)酶切后電泳檢 測種數(shù)多樣性，對具有不同酶切片段的克隆子進(jìn)行測序，序列在 h加:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2sea/wblast2.cgi網(wǎng)站中講《亍Blast分析，按照親源關(guān)系遠(yuǎn)近依次選取一些有代表性種屬序列，利用系統(tǒng)發(fā)育樹軟件ClustalX2.0繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)而劃定各所測序列可能代表的種屬情況。序列比對分析發(fā)現(xiàn)代號為DS-1的克隆子的18SrDNA基因序列與i^odas;7on'(i/Mm ^^ov"rt^ | AB073271.ll的相似度達(dá)到了 99.5%，提示沉積樣品里含有朋o^w/7onWww^oZjow^謂類酵母菌。(三)7 /20cfos; onWMm力o6ovaft/m類酵母菌的個(gè)性化富集培養(yǎng) 能譜儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉積樣品的元素組成及含量如表1,沉積物礦物元素的能譜圖見附圖1。表l沉積物礦物元素組成與含量元素組成Wt%At%OK44.7659.30NaK3.603.32MgK1.130.99A1K9.607.54SiK33.5025.28C1K0.680.40KK3.341.81CaK0.530.28FeK2.881.09X-射線結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉積樣品主成分為硅酸鹽。樣品取樣點(diǎn)理化參數(shù)為水深約5200米，pH為7.60、溫度為4'C、鹽度 約為2%。供參考的已知種屬的特征信息，已報(bào)道的海水或河水中 i^o^wponVZ/ww力o6ovaft/m的富集培養(yǎng)條件麥芽浸出物、酵母浸出物、葡 萄糖、海水等，最佳生長溫度約為25°C。根據(jù)上述信息，及/zo^wponW/wm Wo6ova^m類酵母菌的個(gè)性化富集培養(yǎng)體 系被設(shè)定為酵母浸出物、葡萄糖、pH為7.60、培養(yǎng)溫度為15°C、生長大 氣壓為l個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓、配置用水為人工海水，液體培養(yǎng)。人工海水基本鹽的 組分(g/1)是NaCl: 24.4770; Na2S04: 3.9170; KCl: 0.6640; MgCl2*6H20: 4.9810; CaCl2'H20: 1.1020; NaHC03: 0.1920; KH2P04: 0.1500; MnCl2'4H20: 0.2000; FeSO4'7H2O:2.0000; Na2S204: 1.0000。取約0.5克沉積樣品放在建立好的個(gè)性化富集培養(yǎng)體系中開始富集、富集 一個(gè)星期后、再進(jìn)行固體培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基成分與液體培養(yǎng)基成分相同，所 用凝固劑為瓊脂粉。通過劃線分離3次以上后，獲得一種呈大小不一的粉紅色 點(diǎn)狀隆起菌落，菌落表面粘稠，邊緣光滑、完整、無透明圈，光鏡下檢測發(fā) 現(xiàn)菌體形如頭盔、呈單細(xì)胞多多細(xì)胞珠連、有明顯的厚莢膜層，有分裂生殖的現(xiàn)象。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)該菌的18rDNA序列與DS-l的克隆子18SrDNA的序列完 全相同，為此認(rèn)為該菌與DS-1為同一菌。隨后經(jīng)ITSl-5.8SrDNA-ITS2間序列 檢測分析結(jié)果，形態(tài)學(xué)分析結(jié)果、生理生化結(jié)果發(fā)現(xiàn)DS-l與朋o^^on'^謹(jǐn) Wo^w^/m屬內(nèi)菌有較高的相似性，但仍存在一些差異。為此，認(rèn)為DS-1屬 于i /zc^os/ oW(i/w附d/o6ov^腦內(nèi)的一個(gè)新菌株(朋ot/os/ orW, (i/o6ovaf謂 JCM 0205)，根據(jù)18SrDNA序列和ITSl-5.8SrDNA-ITS2間序列的登陸 DQ854820 (18SrDNA)， DQ981849 (ITSl-5.8SrDNA-ITS2區(qū)域序列)。該菌 分離培養(yǎng)結(jié)果如附圖2 附圖6所示。隆起菌株及/2<^0^0〃'^^^060卩^"附JCM0205描述如下形如頭盔，呈能 運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞或雙細(xì)胞狀，如附圖2。在掃描電鏡下呈中央凹陷的半球狀，凹 陷的直徑大小約為1.5nm 5|im，凹陷深度變化約為0.5pm 2.0^im，在細(xì)胞 表面有許多網(wǎng)狀纖維，如附圖3。在透射電鏡下發(fā)現(xiàn)DS-0205外表面有一個(gè) 厚約為0.3nm lnm細(xì)胞壁，而在菌體近中央也有一個(gè)環(huán)狀的細(xì)胞壁，胞內(nèi) 液泡不僅數(shù)量少而且體積偏小，如附圖4。莢膜染色結(jié)果顯示DS-0205胞外有 一層很厚的莢膜，如附圖5，圖中箭頭所示為莢膜。在15'C瓊脂培養(yǎng)5-7天后， 在有氧條件下，菌落形如表面柔軟，邊緣完整，呈粉紅色/紅色，菌落表面 粘稠發(fā)光，邊緣光滑、完整、無透明圈；菌落呈大小不一的粉紅色點(diǎn)狀隆起， 見附圖6。然而，厭氧培養(yǎng)時(shí)，菌落顏色最初為乳白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長變 為粉紅色/紅色。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)篩選微生物菌種的方法，其特征在于包括以下步驟1)樣品處理及DNA抽提溶解洗滌樣品，收集菌體顆粒物質(zhì)，去雜質(zhì)，收集沉淀物；酚-氯仿-異戊醇抽提沉淀物中的DNA；2)PCR擴(kuò)增，克隆、酶切、測序及序列分析，檢測樣品中微生物種類多樣性分別采用細(xì)菌、古細(xì)菌和真菌通用引物擴(kuò)增DNA抽提物，擴(kuò)增產(chǎn)物，純化，純化產(chǎn)物連接克隆后通過藍(lán)白篩選陽性克隆子；對陽性克隆子進(jìn)行克隆序列的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切電泳后初步判斷樣品中所含微生物的種類數(shù)；對各種類進(jìn)行測序分析，獲知樣品中的微生物種類、豐度、生物多樣性和分布規(guī)律；3)微生物菌種的個(gè)性化富集培養(yǎng)用掃描電鏡分析樣品的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)；用能譜儀、X-射線采集樣品礦物元素的成份及其有機(jī)物種類的信息；采集樣品所在的環(huán)境信息，包括溫度、酸堿度、鹽度等；通過序列比對分析，初步判斷各類微生物的種屬及生長特征情況，參照已有的該類微生物的相關(guān)信息；對于新種則參照與之在系統(tǒng)發(fā)育樹中親緣關(guān)系最近的微生物的生長環(huán)境信息；根據(jù)上述信息建立個(gè)性化富集培養(yǎng)體系；應(yīng)用個(gè)性化富集培養(yǎng)體系富集各類微生物，分離純化各富集分離物，獲得純培養(yǎng)物。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟l)中抽提沉淀物中的DNA 的過程為① 向沉淀物中加入高濃度細(xì)胞裂解液，充分混勻，放入沸水浴中8 15min;② 55 65。C水浴30min以上；③ 隨后72。C水浴30min以上； 加入酚/氯仿/異戊醇混和液，混勻，在室溫下靜置10min左右，離心， 將上清液用酚/氯仿/異戊醇重復(fù)抽提，收集上清液；⑤ 上清液用-2(TC 4'C的無水乙醇沉淀，沉淀溫度為4。C，沉淀時(shí)間30 min 以上，離心收集沉淀；⑥ 用濃度為70%的乙醇洗滌沉淀物兩次；⑦ 沉淀物置于室溫或真空干燥，用TE或無菌去離子水溶解沉淀，得到基 因組DNA提取液。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞裂解液各組分的濃度 分別為EDTA: 0.10 0.30mol/L; Tris.HCl: 0.005 0.15mol/L; NaCl: 0.10 0.30mol/L; SDS的質(zhì)量百分濃度為2% 7.5%; CTAB質(zhì)量百分比濃度為 0.30% 0.75%。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞裂解液的組成為pH8.0， lmol/L的Tris . HC1、 pH8.0， 0.5mol/L的EDTA、 5mol/L的NaCl水溶液、質(zhì) 量百分比濃度為20。/。的SDS，質(zhì)量百分比濃度為10。/。的CTAB，各組分的體 積百分比為12.5: 50: 5: 25: 7.5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)篩選微生物菌種的方法，先通過提取各樣品的總基因組，再利用PCR技術(shù)及RFLP分子生物學(xué)技術(shù)檢測物樣品中微生物的種類、豐度、生物多樣性及其分布規(guī)律，用能譜儀分析樣品的礦物元素的成份，并結(jié)合取樣時(shí)獲得的取樣點(diǎn)的理化信息構(gòu)建針對樣品中各類微生物的個(gè)性化富集培養(yǎng)體系，以個(gè)性化富集培養(yǎng)體系來篩選分離樣品中各類微生物，特別是目的微生物。與傳統(tǒng)的選擇性微生物篩選培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明使得一些不可培養(yǎng)的微生物變成可培養(yǎng)的；克服了損失新種概率大、樣品耗量大、隨機(jī)性與盲目性程度高、效率低等問題，提高了從樣品培養(yǎng)和選育微生物的產(chǎn)率和種類。
文檔編號C12Q1/68GK101250578SQ20081003087
公開日2008年8月27日 申請日期2008年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月24日
發(fā)明者曾樂平, 黃菊芳 申請人:中南大學(xué)