專利名稱：：一種篩選腫瘤遺傳分子標(biāo)記物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬腫瘤分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及腫瘤遺傳分子標(biāo)記物的篩選。技術(shù)背景人體局部組織發(fā)生癌變后，在其組織形態(tài)學(xué)逐步改變的過程中，癌變細(xì)胞中會有不同的基因(或基因群)及其表達產(chǎn)物隨之產(chǎn)生變化，如果能檢測到這些分子構(gòu)成方面的變化，篩選出與腫瘤遺傳相關(guān)的分子標(biāo)記物，則無疑能對腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷、療效監(jiān)測提供巨大幫助。在不同的腫瘤組織中篩選出一些起關(guān)鍵作用的基因或基因群，篩選出用于腫瘤早期診斷、分子分類、療效檢測、預(yù)后判斷等方面的分子標(biāo)記物，正是當(dāng)前腫瘤遺傳學(xué)上積極探索的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種篩選腫瘤遺傳分子標(biāo)記物的方法。本發(fā)明通過以下詳細(xì)技術(shù)方案實現(xiàn)(1)對腫瘤組織標(biāo)本和非腫瘤組織標(biāo)本進行顯微切割；(2)純化組織標(biāo)本，提取純化組織標(biāo)本中的RNA;(3)體外轉(zhuǎn)錄、線性擴增合成aRNA，aRNA再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、二輪體外線性擴增制備生物素標(biāo)記cRNA探針；(4)探針經(jīng)片段化后與人類全基因組表達譜芯片雜交，信號掃描，輸出數(shù)據(jù)，構(gòu)建腫瘤純化組織的基因表達譜；(5)運用weightedvoting算法，使用leave-one-outcross-validation對數(shù)據(jù)歸一化處理，篩選與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程相關(guān)的分子標(biāo)記物。本發(fā)明結(jié)合使用基因芯片、顯微切割、線性擴增技術(shù)，構(gòu)建并研究不同病理類型、不同臨床分期的腫瘤組織中腫瘤基因表達譜，為篩選出不同用途的腫瘤分子標(biāo)記物和潛在的腫瘤藥物作用靶點提供了一種新的方法。同時本發(fā)明結(jié)合RNA保護以克服組織中RNA降解，采用顯微切割以獲得純凈的癌細(xì)胞，利用線性擴增技術(shù)解決了RNA量少問題。并且，結(jié)合現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)和統(tǒng)計學(xué)分析，從海量信息中去偽存真，通過信息分析、比對，從多種病理類型、不同臨床發(fā)展階段腫瘤組織中篩選出起關(guān)鍵作用的基因。圖1:本發(fā)明的流程示意圖。具體實施方式下面以鼻咽癌遺傳相關(guān)分子標(biāo)記物的篩選為例，詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實施。實施例l:篩選鼻咽癌分子標(biāo)記物(1)收集、保存、顯微切割、純化鼻咽部組織標(biāo)本①組織標(biāo)本的收集保存過程門診收集鼻咽癌標(biāo)本和鼻咽炎性上皮組織標(biāo)本34例。組織標(biāo)本分為2份，一份固定于10%甲醛溶液中送病理科獲得病理診斷書；一份保存于RNAlaterRNAStabilizationReagent。忙存于-20。C用于顯微切割、組織RNA提取。具體RNAlaterRNAStabilizationReagent存儲組織標(biāo)本程序為普通1.5ml塑料試管經(jīng)滅活RNA酶處理，每管預(yù)置l~1.5mlRNAlaterRNAStabilizationReagent-20°<:凍存?zhèn)溆?，鼻咽部活檢組織標(biāo)本離體后，立刻以生理鹽水沖洗血跡，lOmin內(nèi)浸入到RNAlaterRNAStabilizationReagent中，-20。C凍存。②組織標(biāo)本的顯微切割與純化過程普通載玻片和染色盒經(jīng)自來水清洗，雙蒸水沖洗后放入0.1%DEPC水中浸泡8小時，隨后18(TC干烤3小時，置-2(TC凍存?zhèn)溆?。將LeicaCM1800冰凍切片機預(yù)冷至-2(TC，RNAlaterRNAStabilizationReagent-20'C凍存組織標(biāo)本及RNA酶滅活載玻片以冰盒轉(zhuǎn)至冰凍切片機箱。組織塊上柱，調(diào)整切片刀，將切片控制在1518^im之間，直接貼敷在預(yù)制的載玻片上。根據(jù)組織切片的大小，每載玻片可以粘貼4~8切片不等。將粘貼好組織切片的載玻片放在位于冰凍切片機箱的預(yù)制染色缸中，冰盒轉(zhuǎn)移至實驗臺，進入下一步組織切片固定、染色試驗階段。無水乙醇中加入DEPC水配制梯度酒精，濃度分別70%、95%和100%。冰盒中取出切片，切片染色順序如下70%酒精5min—95%酒精2min—無水酒精2min—蘇木素染色5min—DEPC水洗3min—70%酒精5min—0.5%伊紅酒精溶液染色30s—70%酒精2min—95%酒精2min—無水酒精保存。改良ONO-121ErgonomicJoystickMicromanipulator系統(tǒng)，無菌注射針頭作為顯微切割刀具，借助移動架協(xié)助固定，倒置正像顯微鏡下首先分辨出癌巢或粘膜柱狀上皮區(qū)，鏡下移動針頭，將目標(biāo)組織塊切下，置于無水乙醇中立即轉(zhuǎn)入RNA提取。(2)腫瘤組織標(biāo)本的RNA提取純化按照AbsolutelyRNAMicroprepKit說明操作，操作步驟如下顯微切割后純凈的組織細(xì)胞中，加入0.7P1的0-ME加入到100P1的LysisBuffer,100ul70。/。乙醇，搖勻。加入RNA離心管中，10，000Xg離心3060sec，棄去離心管中液體，加入600u1Low-SaltWashBuffer,lO，OOOXg30~60sec，棄去離心管中液體，離心2min;加入5"1DNaseI，37°C孵育15min;加入500y1High-SaltWashBuffer,10,000Xg離心30-60sec,棄去管中液體；加入600u1Low-SaltWashBuffer,10,000Xg離心30-60see,棄去管中液體；加入300u1Low-SaltWashBuffer,10,000Xg離心2min;取出離心管芯，放入1.5ml新收集管，力Q30u1ElutionBuffer,室溫孵育2min;10,000Xg離心lmin，RNA即收集于管中。(3)線性擴增RNA，構(gòu)建基因表達譜①RNA線性擴增，獲得aRNA具體步驟如下RNA與T7Oligo(dT)Primer混合，加水至12ul，70°C10min，加入8ulReverseTranscriptionMasterMix，42。C孵育2h;加入cDNA第二鏈合成混合試劑，16。C孵育2h;加入250WcDNABindingBuffer,10W去核酸酶水洗提cDNA二次，加水使cDNA溶液總量達16W;室溫配制體外轉(zhuǎn)錄混合液至總?cè)萘?0W，37。C孵育14h，加入2WDNaseI，37。C孵育30min，加入60WaRNA洗提溶液使總量達100W;250W乙醇中加入50W預(yù)熱50XaRNA洗提液10,000Xg離心，先后洗提二次，收集aRNA，取少量電泳、紫外分光光度計檢測，余-8(TC凍存。②二輪線性擴增，探針標(biāo)記，探針與芯片雜交，經(jīng)掃描后輸出數(shù)據(jù)具體步驟為(l)aRNA逆轉(zhuǎn)錄；(2)二輪體外線性擴增合成生物素標(biāo)記cRNA探針；(3)基因探針片段化；(4)探針與上海博芯H80s芯片雜交，經(jīng)掃描后GCOS扣除本底信號，計算并輸出芯片中全部基因表達數(shù)據(jù)。本實施例選用了上海博芯H80s芯片，該芯片8464點包含7945個人類已知基因，在同一玻璃片基上構(gòu)建了上述顯微切割，線性擴增的34例樣本(1個重復(fù)樣本)的全基因組表達譜。(4)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，利用weightedvotingclasspredictionmodel篩選鼻咽癌分子標(biāo)志物。將34例樣本的全基因組表達譜數(shù)據(jù)，即每例樣本的7945個基因的表達值匯總成一個數(shù)據(jù)表，輸入GeneCluster軟件(2.0版，下載網(wǎng)址http:〃www.broad.mit.edu/cancer/software/genecluster2/gc2.html)。禾U用該軟件提供的權(quán)重賦值(weightedvoting)算法，采用逐個剔除交叉驗證('leave-one-out，crossvalidation)的方法，篩選可以用于鼻咽癌和正常鼻咽上皮分類預(yù)測的分子標(biāo)記。首先篩選出250個在鼻咽癌和正常鼻咽上皮中表達差異最大的基因，然后用這250個基因的基因表達數(shù)據(jù)對34例樣本進行分類預(yù)測，再和34例樣本的實際分類情況(鼻咽癌或者正常鼻咽上皮)進行比較，判斷正確率和統(tǒng)計學(xué)P值，隨后在這250個基因中，逐個剔除鼻咽癌和正常上皮中表達差異最小的基因，每剔除一個，進行一次分類預(yù)測判斷，直至最后只剩1個基因。通過以上預(yù)測分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)利用6個基因預(yù)測得到的準(zhǔn)確性最高，統(tǒng)計學(xué)P值最小，這6個基因是鼻咽癌上調(diào)基因RB1，STMN1，DSP和下調(diào)基因SERPINB6，AGTRL1，SYTL2(參見表1)。表1weightedvoting分類予細(xì)的6個基因基因基因信息GeneBankIDUp-regualatedinNPCRBIRetinoblastoma1(includingosteosarcoma)畫—000321ST畫1Stathmin1/oncoprotein18NM—005563DSPDesmoplakinNM—004415Down-regulatedinNPCSerine(orcysteine)proteinaseinhibitor,cladeBSERPINB6(ovalbumin),member6NM—004568AGTRL1AngiotensinIIreceptor-like1畫—005161SYTL2Synaptotagmin-like2NM—032943在這6個鼻咽癌候選的分子標(biāo)志物中，RB1，STMN1和DSP1在鼻咽癌中表達上調(diào)，SERPINB6，AGTRL1和SYTL2在鼻咽癌中表達下調(diào)。實施例2:對本發(fā)明篩選到的鼻咽癌候選分子標(biāo)志物加以驗證制作含448X2個點陣的鼻咽癌組織微陣列組織微陣列芯片，組織芯片的樣本數(shù)及組織點數(shù)見表2。用芯片，利用免疫組化方法檢測RBI蛋白的表達，用原位雜交方法檢測SERPINB6、AGTRL1的mRNA的表達。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>總計410(896)具體利用免疫組化檢測RBI基因在組織微陣列中的蛋白表達的具體過程為組織微陣列切片經(jīng)實驗前處理后，脫蠟、水化。PBS先，5minX3。組織微陣歹iJ(TMAs)切片入3y。H202中，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫30min。PBS洗，5minX3。抗原修復(fù)根據(jù)所檢測蛋白的部位和抗體說明書推薦修復(fù)方法，使用微波或酶消化抗原修復(fù)。微波抗原修復(fù)時，TMAs切片置于0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液中，緩沖液沸騰后，調(diào)節(jié)至低火檔，修復(fù)切片20min。酶消化抗原修復(fù)時，滴加0.1%胰蛋白酶液于切片，37"C下消化25min。PBS洗，5minX3。滴加300j^1/TMAs片的正常山羊或兔血清封閉，室溫30min，甩去多余液體。滴加即用型或濃縮一抗(按抗體說明書按1:50或1:100、1:200不等的比例稀釋)300^d/TMAs，保持切片在密封的濕盒中，4T:冰箱內(nèi)孵育過夜。PBS洗，5minX3。滴加即用型二抗，300|xl/TMAs片，室溫(25""C以上)lh。PBS洗，5minX3。DAB顯色520min，顯微鏡下控制染色程度。入雙蒸水中止反應(yīng)，雙蒸水沖洗10min。蘇木素染復(fù)染2min，溫水分化。雙蒸水沖洗1015min。脫水、透明、TMAs切片膠帶轉(zhuǎn)移切片系統(tǒng)專用封片膠封片，膠帶轉(zhuǎn)移切片系統(tǒng)配制的紫外線燈下交聯(lián)lmin。原位雜交檢測SERPINB6、AGTRL1基因在組織微陣列中的mRNA表達的具體過程為(1)組織微陣列切片雜交前處理4'C保存的組織微陣列切片置于58'C烤片30min,熔化表面石蠟。二甲苯依次脫蠟3X5min。梯級酒精洗滌，100%酒精2X2min—95%酒精lX5min—70%酒精1X5min—50%酒精1X5min—DEPC水洗滌2X3min—DEPC-PBS洗滌2X5min。滴加300|J胃蛋白酶K(10ng/ml)于切片上，37。C消化20min。切片入PBS(0.1MPBS+2mg/ml谷氨酸)洗滌lmin，中止反應(yīng)。切片入0.2NHCL，于37'C反應(yīng)20-30min,增加組織的通透性。切片用4。/。多聚甲醛(0.1MPBS溶解)后固定10min，室溫。為了增加組織陽性雜交強度，對切片進行乙酰處理。切片入0.25%乙酸酐BufferI(O.IM三乙醇胺)，室溫10min。1MPBS洗滌2X5min。(2)預(yù)雜交-20°(:保存的預(yù)雜交液，先置于37'C孵育60min，預(yù)雜交液的用量為2cmx2cm切片面積50^1，本實驗組織微陣列切片組織面規(guī)格為6.5cmx2.8cm和6.2cmx2.8cm大小，每一切片預(yù)雜交液的用量均用250(_d，相應(yīng)大小的石蠟?zāi)ぢ纳w切片，37'C濕盒中預(yù)雜交2小時。(預(yù)雜交液成份包括2XSSC，10%Dextransulphate，IXDenhardt，ssolution,50mMPhosphateBuffer(PH7.0)，50mMDTT，250^1，100(xg/mlpolyA，5jxg/mlpolydA，250|xg/mlyeastt-RNA，500pg/mlssDNA，47%Deionizedformamide)。移去石蠟?zāi)?，甩掉預(yù)雜交液，切片置于2XSSC中5min。(3)雜交反應(yīng)37'C雜交過夜(18-20h)。每一切片加入250pl雜交液并用石蠟?zāi)ぢ纳w。預(yù)雜交液中加入相應(yīng)的探針就成為雜交液。雜交液在預(yù)雜交時配制，放置37'C孵育，使探針充分溶解于雜交液中，本實驗用多條寡核苷酸探針混合，按每一探針500ng/ml濃度配制成探針雜交液。地高辛加尾標(biāo)記試劑盒標(biāo)記探針濃度計算依據(jù)每一探針的濃度按其與陽性定量探針時檢測反應(yīng)時顯色進行比對和lOOpmol30個堿基的裸探針標(biāo)記反應(yīng)理論探針產(chǎn)量為900ng兩種標(biāo)準(zhǔn)進行綜合計算出標(biāo)記探針的濃度。雜交后洗滌，切片浸入2XSSC，10min，揭去石蠟?zāi)?。依次于搖床上搖動洗滌，2XSSC(0.5%SDS)，2X15min—0.25XSSC(0.5%SDS)，2X15min。(4)雜交后顯色檢測反應(yīng)采用Anti-Digoxigenin-POD檢測地高辛探針與mRNA結(jié)合復(fù)合物；TSA放大系統(tǒng)增強原位雜交反應(yīng)顯色反應(yīng)的陽性信號，DAB顯色。切片轉(zhuǎn)至TNT緩沖液中，3X5min。滴加TNB阻斷緩沖液，300nl/TMAs，室溫，30min。不洗，吸去多余阻斷劑，1:100稀釋的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0.1%TritonX-100+l%阻斷劑)，室溫4小時。TNTBuffer(0.1MTris-CL，PH7.5，0.15MNaCL，0.05%Tween20)洗滌，3x5min。切片上滴加信號放大試劑BiotinylTyamid，300(xl/TMAs，(BiotinylTyramid忙存液BiotinylTyramid溶解于0.2mlDMSO，BiotinylTyramid工作液IX稀釋液，1:50稀釋BiotinylTyramid貯存液)，室溫10分鐘。TNT洗，3X5min。切片滴加SA-HRP(鏈霉卵白素-辣根過氧化物酶)，300^1/TMAs,室溫30min。TNT洗，3X5min。蒸溜水洗滌，lXlmin。DAB顯色，顯微鏡下控制顯色反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，酒精梯級脫水，切片干燥。滴加組織微陣列切片專用封片膠，相應(yīng)規(guī)格的蓋玻片蓋片，切片膠帶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)配備的紫外燈下交聯(lián)切片lmin。結(jié)果顯示，RB1蛋白在鼻咽癌組織中表達上調(diào)，SERPINB6、AGTRL1的在鼻咽癌組織中mRNA的表達下調(diào)(參見表3)，這與用本發(fā)明的方法所篩選的RB1為上調(diào)基因，SERPINB6、AGTRL1為下調(diào)基因的結(jié)果相符。表3RB1蛋白、AGTRL1、SERPINB6基因mRNA的表達與鼻咽癌病理形態(tài)的關(guān)系RB1(陽性率)AGTRL1(陽性率)SERPINB6(陽性率)正常鼻咽上皮57扁(53.80/0)61/81(75.310/0)54/71(76.06%)不典型增生鼻咽上皮56/79(70.9%)39/54(72.22%)30/44(68.18%)鼻咽癌354/396(89.4%)173/343(50.44%)186/337(55.19%)權(quán)利要求1.一種篩選腫瘤遺傳分子標(biāo)記物的方法，其特征在于包含以下步驟(1)對腫瘤組織標(biāo)本和非腫瘤組織標(biāo)本進行顯微切割；(2)純化組織標(biāo)本，提取純化組織標(biāo)本中的RNA；(3)體外轉(zhuǎn)錄、線性擴增合成aRNA，aRNA再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、二輪體外線性擴增制備生物素標(biāo)記cRNA探針；(4)探針經(jīng)片段化后與人類全基因組表達譜芯片雜交，信號掃描，輸出數(shù)據(jù)，構(gòu)建腫瘤純化組織的基因表達譜；(5)運用權(quán)重賦值算法，逐個剔除交叉驗證，對數(shù)據(jù)歸一化處理，篩選與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程相關(guān)的分子標(biāo)記物。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述腫瘤為鼻咽癌。全文摘要本發(fā)明公開了一種篩選腫瘤遺傳分子標(biāo)記物的方法顯微切割腫瘤組織標(biāo)本；純化提取RNA，體外轉(zhuǎn)錄、線性擴增合成aRNA；逆轉(zhuǎn)錄、二輪體外擴增制備生物素標(biāo)記cRNA探針；探針與人類全基因組表達譜芯片雜交，信號掃描，輸出數(shù)據(jù)，構(gòu)建腫瘤純化組織的基因表達譜；運用權(quán)重賦值算法，使用逐個剔除交叉驗證對數(shù)據(jù)歸一化處理，分析篩選與腫瘤相關(guān)的分子標(biāo)記物。本發(fā)明結(jié)合使用高通量基因芯片、結(jié)合顯微切割、線性擴增技術(shù)，構(gòu)建不同病理類型、不同臨床分期的腫瘤組織中腫瘤基因表達譜，為篩選不同用途的腫瘤分子標(biāo)記物和潛在的腫瘤藥物作用靶點提供了新的方法。文檔編號C12Q1/68GK101245385SQ20081003091公開日2008年8月20日申請日期2008年3月26日優(yōu)先權(quán)日2008年3月26日發(fā)明者周艷宏,張文玲,曾朝陽,李小玲,李桂源,煒熊,羅曉敏,范松青申請人:中南大學(xué)