專利名稱：Lrrc4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測在腦膠質(zhì)瘤診斷中的應(yīng)用及其檢測系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腦組織特異性表達(dá)基因LRRC4啟動(dòng)子區(qū)高甲基化在腦膠質(zhì)瘤 早期診斷中的應(yīng)用以及一種用于腦膠質(zhì)瘤早期診斷的LRRC4基因啟動(dòng)子區(qū)甲 基化檢測系統(tǒng)的開發(fā)。
背景技術(shù)：
2007年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)表明在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，膠質(zhì)瘤發(fā)病率最高， 約占40.49%，綜合發(fā)病年齡高峰在30-40歲，或10-20歲，嚴(yán)重影響了社會(huì) 生產(chǎn)力。幾十年來，盡管嘗試了各種改進(jìn)的治療及診斷方案，包括手術(shù)治療、 化療、放療和影像診斷技術(shù)等，但惡性膠質(zhì)瘤生存期仍沒有明顯提高。因此， 對(duì)人腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行高危人群篩查和早期診斷，以便進(jìn)行早期治療，顯著提高 患者生存率， 一直是神經(jīng)科學(xué)臨床研究的重要課題。
目前，腦膠質(zhì)瘤的診斷、分期和分型所參考的標(biāo)準(zhǔn)，均是以臨床、病理 學(xué)和影像學(xué)信息為基礎(chǔ)，仍處于經(jīng)驗(yàn)性標(biāo)準(zhǔn)的階段，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)對(duì)人腦膠 質(zhì)瘤進(jìn)行高危人群篩查和早期診斷的需求。由于遺傳性腫瘤標(biāo)志物"單基因多 靶點(diǎn)"的本質(zhì)特征和實(shí)體瘤細(xì)胞水平上的高度異質(zhì)性嚴(yán)重地干擾遺傳性(突 變，LOH和SNP)和表達(dá)性分子標(biāo)志物的檢出數(shù)據(jù)，使得生物標(biāo)志物(遺傳 性及表達(dá)性)在臨床上的應(yīng)用具有很大的局限性。近年來，以DNA甲基化為 代表的腫瘤表觀遺傳學(xué)及其在臨床診斷、化療敏感性和預(yù)后評(píng)價(jià)等方面的應(yīng) 用價(jià)值，已經(jīng)愈來愈受到生命科學(xué)工作者的重視，并顯示出腫瘤特異性基因 甲基化異化譜式在探尋腫瘤分子標(biāo)志物方面的巨大潛力。DNA甲基化的異化 可導(dǎo)致基因表達(dá)異常和基因組穩(wěn)定性的降低，并能以半保守的方式高保真的 傳遞到子代細(xì)胞的基因組中，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。利用甲基化特異 性聚合酶鏈反應(yīng)方法(MSP)分析所獲得的腫瘤特異性甲基化譜式，有著定 性、正性指標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)，很好地避免了上述生物標(biāo)志物的不足。只要所分析的 靶點(diǎn)區(qū)在正常和腫瘤樣品中為甲基化狀態(tài)相反，用MSP法能夠從多達(dá)104個(gè) 正常細(xì)胞中檢測出l個(gè)腫瘤細(xì)胞，有著作為早期診斷手段的特異性和敏感性。
目前，通過各種體液或固態(tài)排泄物進(jìn)行DNA甲基化譜式分析，對(duì)腫瘤高危人群進(jìn)行普査已被提上議事日程。己有研究表明肺癌發(fā)病早期的輕度異型
增生階段，痰中的脫落細(xì)胞中抑癌基因pl6INK4a啟動(dòng)子CpG島可處于高甲 基化狀態(tài)，預(yù)警著肺癌的到來。大便標(biāo)本中SFRP2甲基化的程度是診斷結(jié)腸 癌最靈敏的標(biāo)記。MGMT、 P73、 RB1、 P16INK4、 RASSF1A和p16啟動(dòng)子區(qū) CpG島的高甲基化，被認(rèn)為與膠質(zhì)瘤的發(fā)生相關(guān)。定量測定血漿中MGMT、 P73啟動(dòng)子的甲基化水平，可以作為診斷膠質(zhì)瘤狀態(tài)的生物學(xué)指標(biāo)。此外，根 據(jù)hMLHl啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)可判斷惡性膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于明確證實(shí)腦組織特異性表達(dá)基因LRRC4 (leucine-rich repeat C4)是腦膠質(zhì)瘤特異性甲基化異化基因，因此提示腦組織特異性表達(dá)基 因LRRC4可用于膠質(zhì)瘤的早期診斷。
本發(fā)明的另一目的在于制備出LRRC4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測系統(tǒng)，并
應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤的早期診斷、篩查和患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)腦組織特異性表達(dá)基因LRRC4在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞、組織表達(dá) 下調(diào)或缺失。LRRC4啟動(dòng)子的活性區(qū)域-835至-293bp為一典型的CpG島， 該CpG島中CpG位點(diǎn)在正常的腦組織和配對(duì)血漿中均處于非甲基化狀態(tài)，而 在LRRC4表達(dá)缺失或下調(diào)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞、組織和配對(duì)血漿中卻存在高度的 甲基化。即使在膠質(zhì)細(xì)胞增生(膠質(zhì)瘤發(fā)生的極早期階段)的組織和配對(duì)血 漿中，LRRC4的表達(dá)與正常腦組織的表達(dá)幾乎沒有任何差異時(shí)，仍然可以檢 測到膠質(zhì)細(xì)胞增生的組織和配對(duì)血漿中存在LRRC4啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀 態(tài)。用甲基化抑制劑5-氮-2脫氧胞苷處理LRRC4基因表達(dá)缺失的膠質(zhì)瘤細(xì)胞， 可恢復(fù)LRRC4的表達(dá)，提示腦組織特異性表達(dá)基因LRRC4是腦膠質(zhì)瘤特異 性甲基化異化基因，是膠質(zhì)瘤敏感/特異性的早期診斷標(biāo)志。
發(fā)明人在上述研究基礎(chǔ)上，制備了用于人腦膠質(zhì)瘤早期診斷的LRRC4基 因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒和 LRRC4啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性PCR擴(kuò)增試劑盒。DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑 盒包括A液—3M NaOH， B液--lOmM對(duì)苯二酚(氫醌)，C液—3.6M亞硫酸 氫鈉(pH值5.0)，D液2MNaOH，E液10M醋酸胺以及硅膠純化柱。LRRC4 啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性PCR擴(kuò)增試劑盒包括用于一對(duì)甲基化引物和一對(duì)非甲 基化引物，甲基化特異性引物為
5,- AGCGTAGTATTTAGCGAGTGC -3 ， (F )， 5，-TAAACCCTAACACCGACTCG-3， (R);非甲基化特異性引物為
5 ，-GGGAGTGTAGTATTTAGTGAGTGT-3 ， ( F ) 5'-TAAACCCTAACACCAACTCACTC隱3， (R)。
以及用于甲基化對(duì)照的經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾Sssl甲基化轉(zhuǎn)移酶處理后的gDNA (-2(TC保存)；用于非甲基化對(duì)照的經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾正常血gDNA (-20°C
保存)；及PCR擴(kuò)增體系的其它常用試劑，如dNTP、 DNA聚合酶、緩沖液(-20
'C保存)等。
用本發(fā)明制備的腦組織特異性表達(dá)基因LRRC4啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測系 統(tǒng)，從血漿中進(jìn)行LRRC4啟動(dòng)子區(qū)特異性甲基化檢測，可以定量檢測各人群 血漿LRRC4啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，從而預(yù)測腦膠質(zhì)瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)，篩査易感 者，并對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者做出早期、快速的無創(chuàng)性診斷。利用本發(fā)明所述檢測 系統(tǒng)檢測血衆(zhòng)LRRC4啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的特異性好，可達(dá)92%;靈敏度高， 只需經(jīng)亞硫酸鹽修飾后50ng組織或血漿gDNA即可檢測出LRRC4的甲基化 狀態(tài)。該檢測系統(tǒng)操作簡便、穩(wěn)定性好，不僅可以用于腦膠質(zhì)瘤的早期診斷， 而且適合用于腦膠質(zhì)瘤的早期大規(guī)模人群篩查與患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測，為腦膠質(zhì)瘤 的早期診斷與防治提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。


圖l LRRC4基因啟動(dòng)子的CpG島的識(shí)別結(jié)果圖2 A圖為膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LRRC4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性PCR產(chǎn)物 電泳圖；B圖為正常腦組織細(xì)胞中LRRC4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性PCR 產(chǎn)物電泳圖3不同濃度甲基化酶抑制劑5-氮-2脫氧胞苷處理SF126和SF767膠 質(zhì)瘤細(xì)胞后LRRC4表達(dá)RT-PCR產(chǎn)物電泳圖4 A圖為用本發(fā)明檢測系統(tǒng)檢測腦膠質(zhì)瘤患者組織LRRC4啟動(dòng)子甲 基化狀態(tài)的特異性PCR產(chǎn)物電泳圖；B圖為用本發(fā)明檢測系統(tǒng)檢測腦膠質(zhì)瘤 患者血漿LRRC4啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的特異性PCR產(chǎn)物電泳圖。
具體實(shí)施例方式
腦組織特異性表達(dá)基因LRRC4 (leucine-rich repeat C4)是采用定位克隆 策略從染色體7q31-32區(qū)域克隆的新基因，GeneBank登錄號(hào)AF196976。該 基因在腦瘤尤其是腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)或缺失，但未發(fā)現(xiàn)LRRC4基因的突變、 缺失與重排等遺傳方式的改變。表觀遺傳學(xué)可能參與了 LRRC4基因的表達(dá)調(diào) 控。采用Promoterscan， Genomatix Promoter Inspector及CpGplot等生物信息 學(xué)軟件對(duì)LRRC4基因5'端側(cè)翼序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明LRRC4 基因的啟動(dòng)子區(qū)域可能位于-2475bp至-101bp處(以起始密碼子ATG中A為 +1)。通過構(gòu)建系列缺失片段的熒光素酶(luciferase)報(bào)告基因方法初步確定 LRRC4啟動(dòng)子區(qū)域位于-835處至-293bp處(以起始密碼子ATG中A為+1 )。 將LRRC4啟動(dòng)子的活性區(qū)域-835bp至-293bp與綠色熒光蛋白(GFP)編碼區(qū) 相連，該片段能啟動(dòng)綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)。LRRC4啟動(dòng)子的活性區(qū) 域-835bp至-293bp為一典型的CpG島(參見附圖1)。
針對(duì)LRRC4啟動(dòng)子活性區(qū)域-835bp至-293bp的CpG島，設(shè)計(jì)并合成BSP 引物，擴(kuò)增LRRC4啟動(dòng)子活性區(qū)域，并對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常腦組織進(jìn)行經(jīng)亞 硫酸鹽處理后的基因組測序(BGS)，發(fā)現(xiàn)LRRC4基因啟動(dòng)子CpG島中CpG 位點(diǎn)正常的腦組織均處于非甲基化狀態(tài)，而在LRRC4表達(dá)缺失的膠質(zhì)瘤細(xì)胞 SF126和SF767中卻存在高度的甲基化(參見附圖2)。采用不同濃度甲基化 酶抑制劑5-氮-2脫氧胞苷處理LRRC4基因表達(dá)缺失的膠質(zhì)瘤細(xì)胞72h后，可 恢復(fù)LRRC4的表達(dá)(參見附圖3)。
為了驗(yàn)證LRRC4啟動(dòng)區(qū)CpG島在腦膠質(zhì)瘤組織和配對(duì)血漿中的甲基化 狀態(tài)，申請(qǐng)人收集了正常腦組織和配對(duì)血漿10例，不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo) 本和配對(duì)血漿(手術(shù)之前)(I級(jí)10例，n-III級(jí)20例，四級(jí)暫缺)30例，用 LRRC4啟動(dòng)子區(qū)特異性甲基化引物，進(jìn)行了 LRRC4啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的 檢測，發(fā)現(xiàn)所有的正常腦組織中LRRC4啟動(dòng)子區(qū)均為完全非甲基化狀態(tài)，而 所有的腦膠質(zhì)瘤組織中LRRC4的啟動(dòng)子區(qū)均為半甲基化狀態(tài)(參見附圖 4-A), I級(jí)和II-III級(jí)膠質(zhì)瘤的LRRC4啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平?jīng)]有明顯的差異 (p>0.05)。同時(shí)，在配對(duì)血漿中也做了相應(yīng)的檢測，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤患者的血漿 中LRRC4的啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)檢出率雖然沒有腦組織的甲基化狀態(tài)檢出率 高(參見附圖4-B)，但與正常人血漿相比，明顯升高((pO.Ol)。
以上研究結(jié)果提示，腦組織特異性表達(dá)基因LRRC4是一個(gè)腦膠質(zhì)瘤特異 性甲基化基因，是一個(gè)敏感/特異性的膠質(zhì)瘤早期診斷標(biāo)志。 實(shí)施例1:腦組織特異性基因LRRC4甲基化檢測系統(tǒng)的制備和操作
本發(fā)明的腦組織特異性基因LRRC4甲基化檢測系統(tǒng)利用PCR的方法可 快速、準(zhǔn)確地確定CpG島的甲基化狀況。根據(jù)系統(tǒng)工作原理，該系統(tǒng)包含2 類試劑盒DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒和LRRC4的甲基化特異性PCR擴(kuò)增 試劑盒。該系統(tǒng)工作的原理分為3個(gè)步驟
(一) DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒制備及操作步驟
原理將DNA樣本經(jīng)亞硫酸氫鹽處理，這種處理的特點(diǎn)是能夠?qū)⑽醇谆?DNA序列中的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化DNA序列中的胞嘧啶由于受 到甲基的保護(hù)而不發(fā)生轉(zhuǎn)變。
內(nèi)容該試劑盒主要包含試劑A液—3MNaOH 200pl， B液—10mM對(duì)苯二 酚(氫醌)lml， C液—3.6M亞硫酸氫鈉(pH值5.0) 15ml， D液2MNaOH 200^1， E液10M醋酸胺1 ml;硅膠純化柱50個(gè)。
操作步驟
如不特別指出，所用雙蒸水(DDW)均經(jīng)高壓蒸汽滅菌。 1:將約2嗎DNA于1.5mlEP管中使用DDW稀釋至50pl; 2:加5.5nlA液，42-C水浴30min;
3:加30iilB液至上述水浴后混合液中(溶液變成淡黃色)；
4:加C液520pl至上述水浴后溶液中；
5: EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液；
6:加200)il石蠟油(自備)，防止水分蒸發(fā)，限制氧化；
7: 5(TC避光水浴16h;
8:經(jīng)修飾的DNA用硅膠純化柱純化后溶入50 水中，向純化后的DNA中加
入D液5. 5pL，室溫孵育20min。 9:加入E液33pL，加入3倍體積的無水乙醇(自備)，混勻，-8(TC過夜，離心，用70%乙醇(自備)洗滌，干燥后用20pL水溶解。 此操作過程中，基因組DNA的量不需十分精確，寧多勿少，因?yàn)樵谝院?純化回收步驟中會(huì)有丟失，且此方法修飾最多可至4ug;步驟7最好達(dá)16小 時(shí)，雖可以短至8小時(shí)，但后者修飾會(huì)有不完全。
(二) LRRC4的甲基化特異性PCR擴(kuò)增試劑盒
內(nèi)容該試劑盒包括用于檢測LRRC4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化引物和一對(duì)非甲基 化引物。
甲基化引物(M型)5'-AGCGTAGTATTTAGCGAGTGC-3， (F)
5'-TAAACCCTAACACCGACTCG-3， (R); 非甲基化弓l物(U型)5'-GGGAGTGTAGTATTTAGTGAGTGT畫3， (F)
5'誦TAAACCCTAACACCAACTCACTC-3， (R)
甲基化對(duì)照經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾SssI甲基化轉(zhuǎn)移酶處理后的gDNA (-20'C保存)
非甲基化對(duì)照經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾正常血gDNA (-2(TC保存) PCR擴(kuò)增體系(-20'C保存)
原理利用甲基化和非甲基化特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增確定LRRC4啟動(dòng)子 的甲基化狀態(tài)。該組引物含2種類型， 一類稱為U型引物，另一類稱為M型 引物。前者利用A-U配對(duì)只能與亞硫酸氫鹽處理后的未甲基化DNA結(jié)合， 后者利用G-C配對(duì)只能與亞硫酸氫鹽處理后甲基化DNA結(jié)合。 操作步驟
1. 取經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后的樣品DNA2pl (總量約50ng)，分別加入含甲 基化和非甲基化特異性引物(各2pl)的PCR擴(kuò)增體系(23|li1)，使用 LAT叫酶進(jìn)行擴(kuò)增。 PCR擴(kuò)增體系為
LATaq(5U/|il) 0.25|il 2XGC buffer I 12， dNTP Mixture(各2.5mM) 4jxi Primers 2|il H20 4.25^1
23 pi
2. 加樣后，置PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下
95 。C 5 min
94 °C 45 sec
58°C 45 sec 38 Cycles
72°C 45 sec —
72 °C 10 min
(三)瓊脂糖電泳鑒定，判斷甲基化情況
取5^1 PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳30min，經(jīng)溴乙啶染色，紫外 燈觀察特異性條帶情況，甲基化引物和非甲基化引物的產(chǎn)物均為153bp(參考 甲基化和非甲基化對(duì)照)。如果只有甲基化引物有特異性條帶，表示LRRC4 啟動(dòng)子為完全甲基化狀態(tài);如果只有非甲基化引物有特異性條帶，表示LRRC4 啟動(dòng)子為完全非甲基化狀態(tài)；如果甲基化引物和非甲基化引物均有特異性條 帶，則表示LRRC4的啟動(dòng)子為不完全或半甲基化狀態(tài)。實(shí)施例2:腦組織特異性基因LRRC4甲基化檢測系統(tǒng)的特異性、靈敏性及穩(wěn)定 性檢測
收集30例膠質(zhì)瘤病人手術(shù)前的全血5ml分離血漿(-7(TC冰箱儲(chǔ)存)，并 收集同一病人的膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本(液氮灌凍存)，同時(shí)收集10例正常腦組織 及配對(duì)血漿作正常對(duì)照。
取lml血漿按照上海華舜生物公司Cell-Free DNA Isolation Kit抽提步驟 提取血漿中游離的gDNA。取30mg腦瘤或正常腦組織剪碎，加入200^1 TE 緩沖液，400nl細(xì)胞裂解液(10 mmol/LTris-Cl (pH 8.0)， lmmol/L EDTA (pH 8.0)， 0.5% SDS)，再加20|il蛋白酶K(20mg/ml)， 55。C過夜消化。煮沸10min, 滅活蛋白酶K， 6000rpm離心10min，取上清液加等量的酚氯仿異丙醇 =25:24:1，顛倒混勻，14000rpm離心10min，取上層水相，加等量的氯仿，顛 倒混勻，14000rpm離心10min;取上層水相，加0.2倍體積的乙酸鈉(pH 5.2)， 2倍體積無水乙醇，顛倒混勻，置-20。C lh后，14000rpm離心5min。再加70% 的乙醇lml漂洗沉淀，7500rpm離心5min，沉淀干燥20min，力[U00nlTE(含 RNAase 100ug/ml)，置37'C搖床振搖至沉淀溶解。分光光度計(jì)測量DNA的濃 度及質(zhì)量，OD260/OD280比值在1.6 1.8。
取上述抽提的血槳或腦組織/腦膠質(zhì)瘤組織的gDNA2pg，采用本發(fā)明腦組 織特異性基因LRRC4甲基化檢測系統(tǒng)中的亞硫酸氫鹽修飾試劑盒進(jìn)行修飾， 步驟見(一)，使未甲基化的C轉(zhuǎn)化為U。
分別取上述修飾后的DNA，加入本發(fā)明腦組織特異性基因LRRC4的甲 基化特異性PCR擴(kuò)增試劑盒中含甲基化和非甲基化特異性引物的PCR擴(kuò)增體 系，置PCR儀上按步驟(二)中條件擴(kuò)增。取5plPCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電 泳，按步驟(三)判定LRRC4啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。
通過該方法檢測發(fā)現(xiàn)30例膠質(zhì)瘤病人組織中LRRC4的啟動(dòng)子均為完全 甲基化狀態(tài)，而10例正常腦組織均為完全非甲基化狀態(tài)；30例膠質(zhì)瘤病人血 漿中28例檢測出LRRC4的啟動(dòng)子存在甲基化狀態(tài)，2例檢測為完全非甲基化 狀態(tài)，而10例正常人血清均為完全非甲基化狀態(tài)。因此，檢測腦組織特異性 基因LRRC4啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)用于膠質(zhì)瘤的診斷具有良好的特異性，并且血 漿中LRRC4的甲基化狀態(tài)能較好反映腦組織中LRRC4的甲基化狀態(tài)，說明 該試劑盒具有很好的特異性。
本發(fā)明檢測系統(tǒng)能夠檢測出經(jīng)亞硫酸鹽修飾后50ngDNA的LRRC4的特 異性甲基化狀態(tài)，說明該試劑盒具有較高的靈敏度。分別取同一批正常人(20例)和同一批腦膠質(zhì)瘤病人(20例)的血衆(zhòng)， 利用本發(fā)明進(jìn)行LRRC4甲基化狀態(tài)的檢測，共重復(fù)10次，按公式變異系數(shù) CV-S/XX100。/。(S為標(biāo)準(zhǔn)差，X為平均值)計(jì)算批間及批內(nèi)變異系數(shù)。最終得 到批內(nèi)與批間變異系數(shù)分別為5.01%和4.63%，說明該檢測方法穩(wěn)定性好。
實(shí)施例3腦組織特異性基因LRRC4甲基化檢測系統(tǒng)的臨床應(yīng)用
收集100例經(jīng)臨床及影像學(xué)診斷疑似腦膠質(zhì)瘤患者手術(shù)前的全血5ml，按 前述方法分離血槳中游離的gDNA，同時(shí)對(duì)患者手術(shù)后的組織進(jìn)行病理診斷。 利用本發(fā)明腦組織特異性基因LRRC4甲基化檢測系統(tǒng)進(jìn)行患者血漿gDNA的 LRRC4基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化檢測。
先用本發(fā)明的DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒對(duì)血漿gDNA樣本進(jìn)行亞硫酸 氫鹽修飾，具體操作見前述步驟(一)。
再取經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后的樣品DNA 2|il，分別加入本發(fā)明腦組織特異 性基因LRRC4的甲基化特異性PCR擴(kuò)增試劑盒中含甲基化和非甲基化特異 性引物(各2pl)的PCR擴(kuò)增體系(23^1)，置PCR儀上按步驟(二)中條件 擴(kuò)增。取5plPCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，按步驟(三)判定LRRC4啟動(dòng)子 甲基化狀態(tài)。
100例疑似膠質(zhì)瘤病人中92例患者血漿中LRRC4啟動(dòng)子存在甲基化狀 態(tài)，判定為腦膠質(zhì)瘤病人。病理結(jié)果顯示92例患者為膠質(zhì)瘤病人，與本發(fā)明 檢測的結(jié)果完全一致。
權(quán)利要求
1.腦組織特異性表達(dá)基因LRRC4啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測在腦膠質(zhì)瘤的早期診斷、篩查和患病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測中的應(yīng)用。
2. —種LRRC4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的檢測方法，將組織或血漿樣本gDNA 經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾處理，將未甲基化DNA序列中的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶；再 利用甲基化和非甲基化特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，確 定LRRC4啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)；所述甲基化特異性引物為5 ，- AGCGTAGTATTTAGCGAGTGC -3 ， ( F)， 5'-TAAACCCTAACACCGACTCG-3， (R);所述非甲基化特異性引物為5 ，-GGGAGTGTAGTATTTAGTGAGTGT畫3 ， ( F ) 5，-TAAACCCTAACACCAACTCACTC-3， (R)。
3. —種LRRC4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測系統(tǒng)，其特征在于包括DNA亞硫 酸氫鹽修飾試劑盒和LRRC4啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性PCR擴(kuò)增試劑盒；所述 DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒包括A液—3MNaOH， B液—10mM對(duì)苯二酚(氫 醌)，C液—3.6M亞硫酸氫鈉(pH值5.0)， D液2 M NaOH， E液10M醋 酸胺以及硅膠純化柱；所述LRRC4啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性PCR擴(kuò)增試劑盒 包括一對(duì)甲基化引物5'-AGCGTAGTATTTAGCGAGTGC-3， (F)5，國TAAACCCTAACACCGACTCG-3， (R); 和一對(duì)非甲基化引物5'-GGGAGTGTAGTATTTAGTGAGTGT-3， (F)5,-TAAACCCTAACACCAACTCACTC-3， (R);以及 作為甲基化對(duì)照的經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾SssI甲基化轉(zhuǎn)移酶處理后的gDNA;作為 非甲基化對(duì)照的經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾正常血gDNA和dNTP、 DNA聚合酶和緩沖 液。
4. 如權(quán)利要求3所述的檢測系統(tǒng)，其特征在于所述DNA聚合酶為5U/pl 的LATaq，所述緩沖液為2.5mM的2XGC buffer I，所述dNTP濃度為2.5mM。
5. LRRC4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測系統(tǒng)的使用方法，其特征在于包括以下使 用步驟(1) 提取待測樣品血漿gDNA，用所述亞硫酸氫鹽修飾試劑盒對(duì)血漿gDNA 進(jìn)行修飾；(2) 取經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后的gDNA，用所述LRRC4啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異 性PCR擴(kuò)增試劑盒對(duì)經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后的gDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3) 取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，判定LRRC4啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明公開了LRRC4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測在腦膠質(zhì)瘤診斷中的應(yīng)用及其檢測系統(tǒng)，腦組織特異性表達(dá)基因LRRC4是腦膠質(zhì)瘤特異性甲基化異化基因，因此提示LRRC4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測可應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的早期診斷，并制備出LRRC4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測系統(tǒng)，包括DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒和LRRC4啟動(dòng)子區(qū)甲基化特異性PCR擴(kuò)增試劑盒。本發(fā)明檢測系統(tǒng)檢測血漿LRRC4啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的特異性可達(dá)92％，靈敏度高，可以定量檢測各人群血漿LRRC4啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，從而對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者做出早期、快速的無創(chuàng)性診斷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101298629SQ20081003154
公開日2008年11月5日 申請(qǐng)日期2008年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月20日
發(fā)明者劉恩伊, 張祖萍, 丹 李, 李夏雨, 李小玲, 李桂源, 武明花, 攀 陳 申請(qǐng)人:中南大學(xué)