專利名稱：非洲爪蟾xpapc基因啟動子及其組織特異性增強子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域，更具體地，本發(fā)明涉及非洲爪蟾非洲爪蟾軸 旁原鈣粘連蛋白基因(Je/ o/ iA5尸araWa7尸rotoca必eri/j (J7M/^)啟動子及其用途。
背景技術：
細胞生物的早期發(fā)育中，原腸運動是最基本的形態(tài)發(fā)生事件之一。通過原 腸運動中精細調(diào)控的大規(guī)模細胞遷移和重排，胚胎的體軸得以建立，即將形成 的三個胚層的邊界也得以確定。非洲爪蟾le"o/ "s 作為兩棲動物的代 表被廣泛地使用來研究原腸運動中細胞的運動和分子機制。通過使用各種顯微 成像技術，非洲爪蟾胚胎原腸運動中的細胞遷移已經(jīng)被詳細地觀察和描述。然 而，關于這些運動的動力來源和調(diào)控這些運動的分子機制還所知不多。
在非洲爪蟾胚胎中，包括原鈣粘連蛋白(尸r"oca必e/v'/7)、整聯(lián)蛋白 (integrins)和纖連蛋白(f ibronectin)在內(nèi)的結(jié)構(gòu)分子都參與原腸運動中的 細胞遷移。非洲爪蟾的Je/ o/3fAS尸ara;o'a7尸r"oca必arj'/ (J尸力/"基因是一個 原鈣粘連蛋白基因，它在進行原腸運動的胚胎中首先表達在Spemann組織者 (Spemann organizer),隨后表達在軸旁中胚層。先前的研究表明i7M尸C在原 腸運動中能促進匯聚伸展運動(convergent extension, CE)，此外，也 參與中胚層和內(nèi)胚層之間的組織分離(tissue s印aration)、體節(jié)形成 (somitogenesis)以及器官發(fā)生(organogenesis)。與其它的粘附分子類似， J/^4尸C作為細胞結(jié)構(gòu)分子的同時也作為信號通路的成員參與生物學事件。最近 的研究工作揭示J/M,C通過與非經(jīng)典Wnt信號通路相互作用以及下調(diào)細胞內(nèi) C-cadherin分子的粘附能力來調(diào)控細胞的粘附能力和遷移。此外，Chung等人 最近發(fā)現(xiàn)J7M尸C與FGF信號通路的下游基因^W5在原腸運動中存在具有生物 學意義的相互作用。然而除了 r/7tfe和Zi歷7被研究證實能激活i7M/^的表達 之外，關于7/M/^的表達調(diào)控機制仍然是一個有待研究的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供非洲爪蟾近軸原鈣粘連蛋白基因(XPAPC)的啟動子 及其用途。
本發(fā)明的另一目的在于提供含有所述啟動子的表達載體和宿主細胞。 在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的核酸(啟動子)序列，所述核酸序列
選自下組
(1) 具有SEQ ID NO: 1中所示的核酸序列；
(2) 具有SEQ ID NO: 1中第(50±49)- (4724±49)位所示序列的核酸序列 (較佳是由SEQIDNO: 1第(50±49)-(4724±49)位所示序列組成的核酸序列); 或
(3) 與(1)或(2)限定的核酸序列有95%以上(優(yōu)選99%以上)相同性且具有 指導目的基因表達功能的核酸序列。
在另一優(yōu)選例中，(2)項中，具有SEQ ID NO: l中第(20± 19)-(4754± 19) 位所示序列的核酸序列。更優(yōu)選的，是由SEQ ID NO: 1中第(20± 19)-(4754± 19)位所示序列組成的核酸序列。
在另一優(yōu)選例中，(2)項中，具有SEQ ID NO: 1中第(10±9)-(4764±9) 位所示序列的核酸序列。較佳是由SEQ ID NO: 1中第(10±9)-(4764±9)位所 示序列組成的核酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種載體，所述的載體含有所述的核酸序列， 作為啟動子元件。
在另一優(yōu)選例中，所述的載體還含有與所述的核酸序列可操作地連接的目 的基因序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因是外源基因。
在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因序列位于所述核酸序列的下游，且是與 所述的核酸序列直接鄰近的編碼基因的序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的核酸序列與目的基因序列的間隔是0-100bp(優(yōu)選 的，為0-50bp;更優(yōu)選的，為0-20bp)。
在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因包括(但不限于)軸旁原鈣粘連蛋白基 因(尸araxia7尸r"oca必ari/ (Z^尸0)、熒光素酶基因、熒光蛋白基因。在另一優(yōu)選例中，所述的軸旁原鈣粘連蛋白基因(化raA^37尸rotoca必er^7 (尸/l尸6))是非洲爪蟾近軸原鈣粘連蛋白基因(Je/7o/ws /^」ra義/a7 ,r"oca必or//7 (X/W56))。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種細胞(優(yōu)選遺傳工程化的細胞)，所述的細 胞含有所述的載體。
在本發(fā)明的第四方面，提供所述的核酸序列的用途，所述的核酸序列用于 作為啟動子元件，指導目的基因的表達。
在另一優(yōu)選例中，所述的核酸用于指導目的基因按照軸旁原鈣粘連蛋白基 因體內(nèi)表達方式表達。
在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因包括(但不限于)軸旁原鈣粘連蛋白基 因(尸arax/a7尸r"oc3必eh/7 ("尸0)、熒光素酶基因、熒光蛋白基因。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而 易見的。


圖1顯示了 XPAPC上游DNA序列的分子克隆和轉(zhuǎn)錄活性分析。
(A) 不同XPAPC啟動子缺失構(gòu)建體的熒光素酶活性。
(B) 檢測XPAPC基因組序列是否存在內(nèi)含子。
圖2顯示了轉(zhuǎn)基因胚胎中啟動子驅(qū)動的GFP mRNA的表達在空間和時間特 異性上重演內(nèi)源性XPAPC的表達。
(A-E)內(nèi)源性XPAPC mRNA在各期(St)的表達。 (F-J)pFL GFP在同時期轉(zhuǎn)基因胚胎中的表達。 其中，(A-B和F-G)背面朝上，從植物極看； 其中，(C和H)神經(jīng)軸胚前面朝上，背面觀； 其中，(D和I)神經(jīng)軸胚前面在左側(cè)，側(cè)面觀； 其中，(E和J)蝌鈄的側(cè)面觀，前面在左側(cè)。
具體實施例方式
本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，首次從爪蟾基因組中分離到一種核酸， 該核酸位于非洲爪蟾近軸原鈣粘連蛋白基因(XPAPC基因)的上游，將其作為啟
動子元件，可指導目的基因(如報告基因)的表達。所述的核酸包含了指導XPAPC 在從原腸早期到尾芽期特異表達所需的調(diào)控元件，從而可用于研究在胚胎發(fā)育
期間特定基因(如XPAPC)的表達調(diào)控情況以及其它因素對特定基因的表達。在
此基礎上完成了本發(fā)明。
如本文所用，所述的"啟動子"或"啟動子區(qū)(域)"是指一種核酸序列， 其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5，端)，能夠引導核酸序列轉(zhuǎn)錄為 mRNA。 一般地，啟動子或啟動子區(qū)提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的 其它因子的識別位點。在本文中，所述的啟動子或啟動子區(qū)包括啟動子的變體， 其通過插入或刪除調(diào)控區(qū)域，進行隨機或定點突變等來獲得。
如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然 的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸 和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在 的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，所述的"可操作地連接"是指兩個或多個核酸區(qū)域或核酸序 列的功能性的空間排列。例如啟動子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特 定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子區(qū)域的引導，從而，啟動子區(qū)域被 "可操作地連接"到該核酸序列上。
啟動子及其指導的基因表達
本發(fā)明人在研究過程中，首次從XPAPC基因的上游克隆到一段可良好地指 導外源基因表達的核酸(啟動子)，利用該啟動子來指導報告基因的表達，可良 好地模擬XPAPC的內(nèi)源表達情況。在本發(fā)明的實施例中，本發(fā)明人證明了利用 所述啟動子指導的GFP的表達能夠完全模擬內(nèi)源XPAPC的表達，說明該片段包 含了指導XPAPC在從原腸早期到尾芽期特異表達所需的所有調(diào)控元件，從而改 變了目前現(xiàn)有技術中具體體內(nèi)對XPAPC基因有調(diào)控作用的核酸序列未知的現(xiàn)
6狀。
因此，本發(fā)明提供一種分離的核酸(啟動子)，所述的核酸具有SEQIDN0: 1所示的序列，或具有SEQ ID NO: 1中第(50±49)-(4724±49)位所示的核苷 酸序列，所述的核酸可作為指導目的基因表達的啟動子元件。
此外，本發(fā)明還包括上述核酸的一些具有相同功能的變異體。包括序列 與SEQ ID N0: 1或SEQ ID NO: 1中第(50±49) -(4724±49)位所示的序列有 95%以上(優(yōu)選99%)同源性且具有指導目的基因表達功能的核酸。
本發(fā)明的啟動子可以被可操作地連接到目的基因上，該目的基因相對于啟 動子而言可以是外源(異源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(如 一種結(jié)構(gòu)性核酸序列)；所述的目的基因優(yōu)選編碼具有特定功能的蛋白，例如 某些具有重要特性或功能的蛋白；或者所述目的基因是在轉(zhuǎn)錄或表達后可以發(fā) 揮指示作用的基因，如報告基因。
例如，所述的目的基因包括但不限于非洲爪蟾軸旁原鈣粘連蛋白基因、 熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因。
本發(fā)明的啟動子還可以被可操作地連接到被改進的目的基因序列上，該目 的基因相對于啟動子是外源(異源)的。所述的目的基因可以被改進來產(chǎn)生各種 期望的特性。例如，目的基因可以被改進來增加必需氨基酸的含量，提高氨基 酸序列的翻譯，改變翻譯后的修飾(如磷酸化位點)，將翻譯產(chǎn)物轉(zhuǎn)運到細胞外， 改善蛋白的穩(wěn)定性，插入或刪除細胞信號等。
此外，啟動子和目的基因可以設計成下調(diào)特定基因。這一般是通過將啟動 子連接到目的基因序列上來實現(xiàn)，該序列以反義反向被引導。本領域的普通技 術人員熟悉這種反義技術。任何核酸序列可以以這種方式被調(diào)節(jié)。
本發(fā)明的啟動子還可用于指導外源基因的表達，研究中胚層發(fā)育以及內(nèi)耳 發(fā)育過程中重要分子的功能、發(fā)育缺陷動物模型的建立以及發(fā)育缺陷的基因治 療等。
本發(fā)明的啟動子和目的基因序列可被包含在重組載體中。 所述的重組載體一般包括(從5'到3'方向)引導目的基因轉(zhuǎn)錄的啟動子， 和目的基因。如果需要，所述的重組載體還可以包括3'轉(zhuǎn)錄終止子，3'多聚核 苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉(zhuǎn)運和靶向核酸序列、抗性選擇標記、增強子或操作子。
用于制備重組載體的方法是本領域技術人員所熟知的。術語"表達載體" 指本領域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。 總之，只要其能夠在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都是可以被采用的。 優(yōu)選的，所述的表達載體是真核表達載體。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構(gòu)建含有本發(fā)明所述的啟動子和/或 目的基因序列的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、
體內(nèi)重組技術等。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇 轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，所述的標記基因如二氫葉酸還原酶、新霉素抗性、 潮霉素抗性等。
重組載體中除了含有本發(fā)明的啟動子，還可含有一種或多種其它啟動子。
所述的其它啟動子例如是組織特異性的、組成型的或誘導型的。
作為本發(fā)明的一種實例，所述的載體是pGL3-Basic，其本身含有編碼熒光 素酶基因的序列。通過改造，即利用pGL3-Basic上的多克隆位點，可將本發(fā) 明的啟動子區(qū)域構(gòu)建到熒光素酶編碼基因的前面，轉(zhuǎn)化宿主細胞，啟動子將激 活熒光素酶編碼基因的表達，所述啟動受到啟動子區(qū)各順式作用元件的調(diào)控， 模擬了基因在體內(nèi)被激活轉(zhuǎn)錄的狀況。
包含上述適當?shù)膯幼雍湍康幕虻妮d體，可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷?胞，或轉(zhuǎn)化入受精卵或胚胎內(nèi)，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞； 或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，酵母，動物的組 織細胞等。受精卵或胚胎可以是兩棲類動物的受精卵或胚胎，例如是非洲爪蟾 的受精卵或胚胎。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序 列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300 個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子或宿主 細胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿 主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲， 用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如 果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA 轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝 等。
重組DNA轉(zhuǎn)化受精卵或胚胎的方法也是本領域已知的，通?？刹捎蔑@微注 射技術。例如可按照Kroll KL等(1996). Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation. Development 122:3173-3183所描述的方法進行轉(zhuǎn)基因操作。 用作轉(zhuǎn)基因的質(zhì)?？深A先進行線形化。
在本發(fā)明的實例中，在所述的啟動子的指導下，可以使熒光素酶 (Luciferase)基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因良好地表達。因此可見，本發(fā)
明的啟動子在基因表達調(diào)控的研究中具有重要的應用價值。
在本發(fā)明的實例中，將全長的XPAPC啟動子熒光素酶分析質(zhì)粒中熒光素酶 的編碼序列用綠色熒光蛋白的編碼序列替換后，得到了用于制備轉(zhuǎn)基因爪蟾胚 胎的報告質(zhì)粒。本發(fā)明人制備了不同時期的轉(zhuǎn)基因爪蟾胚胎并用反應GFP表達 的探針進行了原位雜交實驗。結(jié)果表明，在不同時期的轉(zhuǎn)基因爪蟾胚胎，XPAPC 啟動子可指導的GFP的表達模式與內(nèi)源的XPAPC表達模式非常相似，這說明本 發(fā)明人得到的XPAPC啟動子中包含了知道XPAPC在爪蟾胚胎早期表達所需要的 所有重要順式作用元件。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于
揭示一種可指導目的基因表達的啟動子，利用本發(fā)明的啟動子可以研究在 胚胎發(fā)育期間特定基因(如XPAPC)的表達調(diào)控情況以及其它因素(如一些信號 通路)對特定基因的表達。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:
9Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠 商所建議的條件。
實施例1胚胎培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因方法
非洲爪蟾胚胎培養(yǎng)操作受精卵的培養(yǎng)如Fang PF等(2004) ， Multiple signaling pathways control Tbx6 expression during Xenopus myogenesis. Acta Biochim Bi叩hys Sin (Shanghai) 36:390-396中所描述的，分期依照 Niewkoop禾口 Faber (Normal Table of Xenopus Laevis， Garland Publishing, 1994)中所述。
非洲爪蟾轉(zhuǎn)基因胚胎制備按照Kroll KL等(1996). Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation. Development 122:3173-3183所描述的 方法進行轉(zhuǎn)基因操作，獲得了轉(zhuǎn)基因的胚胎。用作轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒用Smal消化 以線形化。每個質(zhì)粒都進行了 3輪獨立的轉(zhuǎn)基因操作。
實施例2 XPAPC 5'上游調(diào)控序列的克隆
由于非洲爪蟾的基因組序列還未被測序完畢，本發(fā)明人通過獨特設計克隆
了 i7M尸C的上游調(diào)控序列，具體如下
基因組DNA分離:取2g成年雄性爪蟾新鮮肝臟組織，放入研缽加入液氮 研磨充分，用酚/氯仿法抽提兩遍，取上清用乙醇沉淀，75%乙醇洗一遍，干燥， 溶解在去離子水中，分光光度計定量。
連接:取1 基因組DNA用10 U的EcoR I消化過夜，取消化后1 基 因組DNA與50 mMPCR接頭用T4 DNA連接酶16。C連接過夜，后用乙醇沉淀回 收，溶解在20 W去離子水中。
PCR采用的引物如下
APl(SEQ ID NO: 2): 5， -GTAATACGACTCACTATAGGC-3，；
AP2(SEQ ID NO: 3): 5' -ACAATAGGGCACGCGTGGT-3，；
GSPl(SEQ ID NO: 4) : 5' -CAACACTGCAATTACAGTGCCAGGGGGTTCTTCTTC-3';
GSP2(SEQ ID NO: 5) : 5' -GAGAAGCAGCATCTTGAAGAATCAAAGTTGCACC-3'。
API和AP2的引物基于基因組步行(Genome Walker)接頭系統(tǒng)。兩輪接頭PCR (Adaptor PCR)分離擴增i7M/T 5，上游序列: 第一輪，采用50 W體系，用量如下
IOX緩沖液 5W;
dNTP 250W;
GSP1 10pM;
API 10pM;
連接了接頭的消化后基因組DNA 100ng;
LA Taq聚合酶 2. 5U;
去離子水補足至 50W。
PCR程序
變性 94°C 3分鐘；
第一步10個循環(huán)變性 94" 30秒；
退火 7CTC 30秒；
延伸 72°C 5分鐘；
第二步30個循環(huán)變性 94°C 30秒
退火 60°C 1分鐘
延伸 72 °C 5分鐘
最后延伸 72°C IO分鐘。 第二輪PCR :將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍按以下比例加樣，用量如下
用第
IOX緩沖液(加Mg" dNTP GSP2 AP2
第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍 LA Taq聚合酶 去離子水 一輪相同程序進行PCR。
5Pl; 250W;
10pM; 10pM;
100ng;
2, 5U;
補足至50W。
將第二輪PCR的產(chǎn)物用1%瓊脂糖膠分離，鑒定發(fā)現(xiàn)4. 3 kb處有單一條帶, 割膠回收，裝入T-easy載體(Promega),測序。結(jié)果，長度為4914bp的DNA片段被克隆，如SEQ ID NO: 4所示。將其與 已公開的Xenopus PAPC基因的5'區(qū)域(參見Kim SH等(1998)， The role of paraxial protocadherin in selective adhesion and cell movements of the mesoderm during Xenopus gastrulation. Development 125:4681-4690)有 143bp的重疊。
實施例3含啟動子及報告基因的載體的構(gòu)建
前述獲得的PCR擴增片段常規(guī)方法純化后，通過常規(guī)PCR方法獲得SEQ ID NO: 1中第1-4773位序列且兩端攜帶Xhol/Hindlll酶切位點的片段，插入到 Xhol/Hindlll消化的PGL3-Basic(Promega，自帶熒光素酶編碼基因)中，得到 p-4773Luc構(gòu)建體。
本發(fā)明人還利用Xbal/Hindlll酶切消化p-4773Luc，將其中的熒光素酶基 因去除，回收經(jīng)加工的質(zhì)粒；同時將綠色熒光蛋白(GFP)的編碼序列(GFP編碼 序列是從pCS2-GFP質(zhì)粒(獲自Ralph R叩p實驗室)上用Xbal和HindIII切下) 裝入到經(jīng)前述經(jīng)加工的載體中，得到轉(zhuǎn)基因所用質(zhì)粒p-4773GFP。
本發(fā)明人還構(gòu)建了由SEQ ID NO: 1中第卜2920位序列構(gòu)成的片段，采用 前述相同方法將該序列分別裝入PGL3-Basic和綠色熒光蛋白(GFP)報告質(zhì)粒中 的，從而獲得測試質(zhì)粒p-2920Luc和p-2920GFP。
上述構(gòu)建的熒光素酶報告質(zhì)粒將被用于確定報告基因的活性，而綠色熒 光蛋白報告質(zhì)粒將被用于進行爪蟾轉(zhuǎn)基因胚胎實驗。
實施例4啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析
為進行熒光素酶分析，將含有25pg不同熒光素酶測試質(zhì)粒和25pg內(nèi)標報 告基因pRL-SV40(購自Promega)的2nl溶液(溶劑為DEPC水)注射進四細胞期 胚胎的動物極。
為了分析所得到的1/M尸C5'上游序列是否具有轉(zhuǎn)錄活性，將前述構(gòu)建的 p-4773Luc、 p-2920Luc載體、PGL3-Basic空載體(各25pg， 2nl)和內(nèi)參對照 pRL-SV40(25pg， 2nl)分別注射到四細胞期的爪蟾胚胎動物極中，在第8. 5期 左右分離動物極帽，然后培養(yǎng)至12.5期，檢測報告基因的熒光素酶活性。熒 光素酶分析用Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) 進行。
結(jié)果見圖1A，顯示i7M尸C5'上游序列片段有轉(zhuǎn)錄活性。在真核生物中，內(nèi)含子(intron)，特別是第一個內(nèi)含子，也有可能參與 基因表達的調(diào)控。為了檢測X/M尸C的基因組序列中是否存在內(nèi)含子，本發(fā)明人 進行了基因組PCR。
結(jié)果如圖1B所示，在加入了特異結(jié)合于i7M尸0f放閱讀框(open reading frame)起始位置和終止位置的引物(上游TTG TTT TAA ATG ACT GCA GGT CTG GAA GGA (SEQ ID NO: 6);下游CAG TTC CCA TTT TCT GGA CCCTTGTTGA(SEQ ID NO: 7))的PCR反應中，僅有一條長度為3. 6kb的片 段可以被擴增。通過將這個片段進行DNA測序表明J/M尸C基因組序列與其他的 一些原鈣粘蛋白一樣不包含內(nèi)含子。
為了檢測所得到的WM/r 5'上游調(diào)控序列是否能指導報告基因GFP在非 洲爪蟾胚胎中的表達，本發(fā)明人利用Sinai將包含上游調(diào)控序列的質(zhì)粒 p-4773GFP (pFL-GFP)線性化，轉(zhuǎn)入到爪蟾胚胎中，然后通過原位雜交檢測報 告基因GFP在胚胎發(fā)育過程中的表達情況，并檢測未轉(zhuǎn)化胚胎的內(nèi)源性XPAPC 的表達情況。XPAPC和GFP的轉(zhuǎn)錄用整體原位雜交的方法分別用XPAPC或GFP 探針檢測。
mRNA模板的準備依照文獻Fang PF等(2004) ， Multiple signaling pathways control Tbx6 expression during Xenopus myogenesis. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 36:390-396中所描述的。胚胎的原位雜交 利用地高辛(DIG)-標記的XPAPC或GFP探針(XPAPC探針參照Kim SH等，The role of paraxial protocadherin in selective adhesion and cell movements of the mesoderm during Xenopus gastrulation. Development 125:4681-4690. 中所描述的；GFP探針系將pCS2-GFP線性化后，用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄得 至U )， 依照 Harland RM. 1991. In situ hybridization: an improved whole—mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol 36:685—695 中所記載的進行。雜交胚胎用漂白液(含1%過氧化氫的0. 5 X SSC和5%甲酰胺) 熒光燈下處理。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在非洲爪蟾胚胎中，i7M尸C最早從原腸運動開始前一個半小時 的囊胚晚期開始表達(9.5期(St9.5))。在這個時期，應用整體胚胎原位雜交可 以在背方邊緣帶檢測到X,力/^的表達(圖2A)。在原腸胚的早期(10期)，i7M/r的表達擴展到整個邊緣帶并且呈現(xiàn)出背方多而腹方少的模式(圖2B)。隨著原腸 運動的進行，i7^/^在背方中線的表達隨著軸中胚層(脊索，notochord)開始發(fā) 育而下調(diào)。當中胚層皮層在13期被完全內(nèi)巻后，i7M/T mRNA在前方的表達有 一條清晰的邊界將頭部和軀干中胚層分開(圖2C)。 一旦體節(jié)形成 (somitogenesis)開始，i7^/^的表達將在成熟的體節(jié)中下調(diào)而條帶狀的表達會 向胚胎后方移動(圖2D)，這樣的循環(huán)直到體節(jié)形成結(jié)束才停止，此后i7M尸C的 表達維持在尾部的尖端上(24期)(圖2E)。除了在中胚層的表達以外，從17 期開始，i^/尸C也在頭部兩側(cè)即將形成耳蝸的位置表達(圖2D),其后隨著耳蝸 的發(fā)育和內(nèi)巻，^7M/^的表達也更加局限在耳蝸的區(qū)域，當耳杯形成以后，i7M,C 會表達在杯狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)部(圖2E)。
在進行了轉(zhuǎn)基因操作而將線性化的PFL-GFP報告質(zhì)粒整合到基因組中的爪 蟾胚胎中，GFP的表達模式不管是在原腸運動中的中胚層還是在發(fā)育的耳蝸之 中，都與內(nèi)源的i7M/)C表達非常相似(圖2F到J )。說明具有SEQ ID NO: 1 中第1-4773位序列的啟動子包含了指導J/M/^在從原腸早期到尾芽期特異表 達所需的調(diào)控元件。
此外，本發(fā)明人通過類似的方法，利用p-2920GFP質(zhì)粒，驗證發(fā)現(xiàn)SEQID N0: 1中第1-2920位序列的啟動子可以指導GFP表達，但表達與內(nèi)源的i7M/T 表達不同，這是由于該序列中缺乏某些調(diào)控元件造成的。
此外，本發(fā)明人通過類似的方法，驗證了由SEQ ID N0: l中第3-4769位 序列構(gòu)成的核酸也具有類似于第卜4773位序列的活性。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻 被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后， 本領序列表
<110〉中國科學院上海生命科學研究院
〈120〉非洲爪蟾XPAPC基因啟動子及其組織特異性增強子
<130> 080302
<160〉 7
<170> Patentln version 3.3
<210〉 1
<211〉 4914
〈212> 腿
<213> 非洲爪蟾(Xenopus laevis)
<400〉 1
t3gca^ga3gC3gttCgggga^tgagtcaiccccgaag犯cag￡iaga_ttt60
gtcgacgggcgactaatcttCCagaElttgCagcatgtgtctcagcccttac柳gtcggt120
gaccascccccgcaccccccctccccaaagctactttagagga犯cttta180
eiacttt2Latattaaaaaaac3gtcgcacateigaeiaataga33gtaattga^L2L犯gtCtt240
tatttctggtaaactatctggaaccaactgaaagtgUgg300
gcccttttaatgcatcagccataattgcatcaggcgcatcatggtgggcaaaaaaa_c3tg360
gtgcagggcgatggtggcttgtgttgtgttgaccttgcactggaaaatga420
accctagatgtattgttattagcacatgttgctgtagaattactagcaga■
a￡Lgt￡Lcagagcaagttcagaccgatagaagatggac犯gaccttactcaa540
gggagcttEicagtctagatgattaatcctcttggtgccaacagtgtgtac600
tgttaaacagttaatcagctccgccagcttgtttctaagcatttctaagtagctgccaaa660
ggttgttattcccattatgctttaaaccttaaaaatccaatgttctggtc720
taatgt犯犯gga犯gt3tctctgtcacttgttttt^gacaacactctgccctgtgggt780
ccttttcgtggca^gaaa^ctctgtgc卿t840
ggaacetaiattgccattccttcatgtgtctaggtgc隱gtttgttgcctaagtgtttut900
cta犯tagactggccttttgggtgttttctggacattatctctaagaagg960
taaatgacggELElggatttgCacc犯犯gacttggacaatgcatacaccat1020
gta^gctceic3tggatgC3aatgttgtacaacttactctcgatatttgtct1080
ctgggtcaaatgttcgta犯aaatcatctctctctacaaceiaMtctgcagaatacattg1140
ggcttgctagttctcctaccatgggcttgttgtacatttaggaaaggctttggggteittt1200
犯taccatttgttcaacaagtaggccttgtatcctagttga肌tatag3cattgtggcta1260
ataagacctgaggcactagggstataattacctattcagttctaattgatgatcttaaga1320
agggtactct犯tcaatgcagtgttttgtgtactcaagtgaatagccttgtaMggacga1380
ggacctcctcctgccttgaatggga城tgtaagtcttattcttttagtagttgtttatt1440
aggattgtctacacacacttccacccactcattctgtacatat犯gc3ca1500
3gttatatttattgccatgcctaaatgcttgtctgtttctatattacagactgtgtattg1560
卿ggaatgttgattttttttatcagggttttttttcagagcggcactgt1620
ttatgcattgtgtttgttgtgcaatccacageitgtcaggcactgggctatactatgtcgtt1680
ggteigacagcaacatttaaggcaMgccat1740
atgcttgaactgcattagtgattatcactgacctgcaacgctttccatcc1800
gatgc犯cttctagtacttgtgtgccatgcataggggtaaaacaaceigtggaagcagacc1860
ctgtgactgctgaagagcccccagagtttt3ggggtctagtggagcagtaatt犯t犯gc1920
gctttcaatatatacttttgtattctgaggttcagtgaac1980
15ttttcatgactcaataacttctagtccagtggccatgcactgttttgctgcatatggagc2040
atggactaattUgcgctgtatagctgttcttctattccatttccaattaaagtattgac2100
ctgcacgtggceitg"tgtatttggtaatactggtatgggeteicccttacccagaeicctgtta2160
tccagatagttccgeitttac3ggaaggccatgttccatagactccattttatcta^atei32220
tccagatttttatcaactatttcctttatctctgtaaggttacagacacacgctaagatt2280
caggg柳tttagtcacctcttcttcggacgactaatctccccg犯犯gccttcctgccg2340
gctagaatctgaatcgctggcaggatgat3cttgttttcag犯gtcgccc2400
aacgttgcctcacaaggagactttgggcaattttggaaa3caaatcgttccgagtgccac2460
tctgccggtgatttagattttagccggcggaaaggcttttcggggagattagtcgccgga2520
,卿ggcg3taaatctccccgaatcttagcgtgtgctcttaccctaataataaaatag2580
tagcttgtacttgatccaaaattaatccttattgeiaggceiaatccaagct2640
attgggtttattaaatgtttacatgattttctagtatactt犯ggtatga2700
t3cggaaa犯tcagttaccc3ga^犯ccccaggtcccgagcattatgtatagcattctat2760
tattgcatacctgcatatac33Ctt￡l3￡lCC2820
tgtgtatctccttgtgtatcctttcattagatggagtgtg犯ttgtaeittaaccccttaa2880
ctcttggcatgtttttctac3gga貼caaactgcaatacgatcatataiacacaggcagcc2940
tcaccacatcctaccttcaaagctcacaggatatgttaatgtccatgtcattggcaccaa3000
aggatttatgUgagcagagcagagacaccattgtctcttcttaaataaaC3Ct3tt3gC3060
tgtgg^tgaaattagcacaggataaattgctctttaattaaiaaatttca3120
atcaacatactgcagtggggacactgtaccctgcccctgaaagtcagact3180
actgacatatacatatttatatttttattattatatttatctctatcttactt犯3ttta3240
ggtgcacatttattcttgcttttttggcacaggtsacaaacatttctaaagttactaatc3300
atttttgtacattgctacccatttacccaacgacaattattgctggttcagt犯gt犯ga3360
taagwttacattcaaagcatataag3ttagttaaccagaaacccattaaccagaaagtt3420
cagaattacaggaaggccatctcccatagagtctattttagtaceittttt3480
aaa肌tgatttcctttttttctattataataacacagtagcttatacttgatccttacta3540
agacataattaatcctattggtagtgatggg卿犯ttggggcattttgcttcgccgaaa3600
aatgtgcgaatttcccgcga犯cggc犯aaattcgcaaaacggcgttggcgtccattttt3660
ggcgccagactcgcccatcactacctattgggtttatttaatgtttaaag3720
gattttttagttgaccaaatcccccttatctggaaaaccacaggttcatg3780
agcattctggeitaacaggtcccatacctgttatUcagggcatttgtcct3840
gtgcctctata3tcag3ggagacatataacgttgcttacc3900
tattgttaaatattttcaateigggatgtcagcagtttaeigctcttgcagaatcgtgtcag3960
gtgattctgggagttgtagttc&at犯caggct犯ttagaaccccctgat4020
eiccctccca^cttcattgcatteieLEiaggatcccattcttctcttcctatgcccctgttaa4080
ggtaaacatttttatccaatctagcaccattatggggttttctaccttat4140
gaatccccatawtatgacaaataggtacagatgactgtttttattttga4200
gacttatagtaaacatttttatcc犯tctagcacaattatggggttttatttaatgatct4260
tccttatgaatccccataaatatgaccagtcscaaataatgtgtatggatgtttttagtt4320
tgagactgtt犯tatt3tacatttttagttacaatgttatagactgtatg4380
tatattctatcaaatgtggtaagcataataaattacatag4440
ggtatatcagaatatttctttaatttaatgaa3ttgtttt4500
attttgtttgttgttcccacttctctgcattgcgcttgct4560
acactgatttattgtcataaaatataacagtttgUggacttccaagtga4620
gacctatttgatgacagtctcattagctctgccccagtgc"tcctttgtctctgggga犯g4680
ggattggctagaagtaagttcatttacatatcctctgggaat3t犯cctgggggcag柳4740
tggaaccaagggatcattcctacagagatg犯CtCCttgELgattgtttta4800
aatgactacaggtctggaaggeittcacattgccacactgtttctaggcagga犯a犯ctg4860
caeigt"Uc^ctttgtttttggtgcaactttgattcttcaagatgctgcttctc4914<210〉 2
<211〉 21
<212> DNA <213〉人工序列
<220〉
<221〉 misc_feature <223〉 引物
<400〉 2
gtaatacgac tcactatagg c 21
<210〉 3
<211〉 19
〈212〉 醒 <213〉人工序列
<220〉
<221〉 raise—feature
〈223〉 引物
<400〉 3
acaatagggc acgcgtggt
〈210〉 4
<211> 36
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<221〉 misc一feature <223〉 引物
〈400〉 4
caacactgca attacagtgc cagggggttc ttcttc 36
<210〉 5
〈211〉 34
〈212〉 DNA <213〉人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223〉 引物<400> 5
gagaagcagc atcttgaaga atcaaagttg cacc 34
<210> 6
<211〉 30
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<220〉
<221> misc—feature
<223〉 引物
<400〉 6
"gttttaaa tgactgcagg tctggaagga 30
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
〈220〉
<221> misc一feature
<223〉 引物
<400〉 7
cagttcccat tttctggacc cttgttga 28
18
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列選自下組(1)具有SEQ ID NO1中所示的核酸序列；(2)具有SEQ ID NO1中第(50±49)-(4724±49)位所示序列的核酸序列；或(3)與(1)或(2)限定的核酸序列有95％以上相同性且具有指導目的基因表達功能的核酸序列。
2. 如權(quán)利要求l所述的核酸序列，其特征在于，(2)項中，具有SEQIDNO: 1中第(20± 19) — (4754± 19)位所示序列的核酸序列。
3. —種載體，其特征在于，所述的載體含有權(quán)利要求l所述的核酸序列， 作為啟動子元件。
4. 如權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于，所述的載體還含有與所述的 核酸序列可操作地連接的目的基因序列。
5. 如權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于，所述的核酸序列與目的基因序 列的間隔是0-100bp。
6. 如權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于，所述的目的基因包括軸旁 原鈣粘連蛋白基因、熒光素酶基因、或熒光蛋白基因。
7. —種細胞，其特征在于，所述的細胞含有權(quán)利要求3所述的載體。
8. 權(quán)利要求1所述的核酸序列的用途，其特征在于，所述的核酸序列用 于作為啟動子元件，指導目的基因的表達。
9. 如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的核酸序列用于指導目的 基因按照軸旁原鈣粘連蛋白基因體內(nèi)表達方式表達。
10. 如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的目的基因包括軸旁原 鈣粘連蛋白基因、熒光素酶基因、或熒光蛋白基因。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學領域，公開了非洲爪蟾XPAPC基因啟動子，其具有SEQ ID NO1中所示的核酸序列或序列片段。本發(fā)明還公開了含有所述啟動子的表達載體。本發(fā)明還公開了利用所述的啟動子表達目的基因的方法。本發(fā)明的啟動子包含了指導XPAPC在從原腸早期到尾芽期特異表達所需的調(diào)控元件，從而可用于研究在胚胎發(fā)育期間特定基因(如XPAPC)的表達調(diào)控情況以及其它因素對特定基因的表達。
文檔編號C12N15/12GK101492673SQ20081003308
公開日2009年7月29日 申請日期2008年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日
發(fā)明者丁小燕, 鑫 婁, 王金虎 申請人:中國科學院上海生命科學研究院