專利名稱：用于胃癌和胃癌組織轉(zhuǎn)移的分子檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；更具體的，本發(fā)明涉及一種胃癌標(biāo)志基 因及其用途，檢測(cè)胃癌標(biāo)志基因的試劑或試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
在所有惡性腫瘤中，每年全世界胃癌死亡人數(shù)約650， 000人，致死率僅次于 肺癌，居于惡性腫瘤第二位。在中國(guó)，胃癌發(fā)病率和死亡率均居消化系統(tǒng)惡性腫瘤 的首位，每年死于胃癌者約36萬(wàn)人，占世界同期胃癌死亡人數(shù)的40%，五年生存 率僅5%-15%。
目前中國(guó)臨床診斷中多為癥狀性篩選，即出現(xiàn)腹部不適、隱痛、泛酸、噯氣 或消痩、黑便等癥狀后進(jìn)行內(nèi)鏡、胃鋇餐等檢查，最終檢出的胃癌絕大部分為進(jìn)展 期胃癌?，F(xiàn)有的診斷方法如血清學(xué)免疫檢測(cè)通常使用的標(biāo)志物如CEA、CA系列抗原， 普遍存在靈敏度低、特異性差，尤其是對(duì)早期胃癌檢出率、有效性都很低。常用的 細(xì)胞學(xué)檢測(cè)雖然低廉簡(jiǎn)便，靈敏度同樣偏低，而影像學(xué)檢測(cè)僅對(duì)有較大占位的惡變 腫瘤有很高的診斷率。中國(guó)是發(fā)展中的人口大國(guó)，經(jīng)濟(jì)條件欠發(fā)達(dá)，開展全民性的 胃癌普査篩選困難重重。
目前臨床最有效的診斷方法是胃鏡結(jié)合病理的方法，具有較高的胃癌診斷率。 但由于絕大多數(shù)胃癌患者早期并無(wú)明顯癥狀，約70%的病人就診初期往往只有胃炎 癥狀而被接受質(zhì)子泵抑制劑的抑酸療法，這種療法容易使病變邊緣正常細(xì)胞增生并 掩蓋惡變細(xì)胞，導(dǎo)致胃鏡和胃鏡取樣組織后病理的觀察存在較大的誤診/漏診率。 日本等國(guó)因此規(guī)定胃鏡下活檢病理報(bào)告為中度不典型增生及以上患者，需重復(fù)多 次胃鏡及活檢為免延誤診斷。這種方法既費(fèi)人力、財(cái)力又增加患者的痛苦，難以在 中國(guó)推廣。更重要的是，目前常規(guī)的胃鏡檢査和病理學(xué)診斷均基于形態(tài)學(xué)的判斷， 對(duì)于操作人員的經(jīng)驗(yàn)技術(shù)有較高的要求。在實(shí)際應(yīng)用中，這種非客觀、非標(biāo)準(zhǔn)化的 檢測(cè)發(fā)生漏診和誤診的現(xiàn)象不是少數(shù)，而且對(duì)有不典型增生、早期胃癌、胃癌進(jìn)展 期等組織學(xué)特征進(jìn)行的區(qū)分，目前尚難以有明確的界限。對(duì)于早期胃癌的判斷標(biāo)準(zhǔn)， 臨床上還是以手術(shù)切除后進(jìn)行病理檢查發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)，缺乏在手術(shù)前的依據(jù)，這在很大程度上依賴與胃鏡檢查的醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)，難以做到標(biāo)準(zhǔn)化?？陀^上需要有在 胃鏡下取材進(jìn)行病理學(xué)檢查時(shí)的輔助手段或指標(biāo)，能夠幫助醫(yī)生進(jìn)行胃癌尤其是早 期胃癌的判斷，提高診斷的準(zhǔn)確率，減少漏診。其次，由于多數(shù)癌癥患者臨床確診 時(shí)已屬中晚期，如何用分子診斷方法進(jìn)行手術(shù)后病人預(yù)后的監(jiān)測(cè)和有效治療方法的 選擇，是改善預(yù)后的有效方法。
發(fā)展具有高靈敏性、特異性強(qiáng)的胃癌分子診斷技術(shù)和產(chǎn)品，是提高中國(guó)胃癌 早期檢出率、改善患者預(yù)后的關(guān)鍵之一。S100A2是EF-手性鈣結(jié)合蛋白S100超家 族成員。Sl00蛋白是一組分子量10 12kD的鈣結(jié)合蛋白，氨基酸序列在脊椎動(dòng)物 中高度保守，目前共發(fā)現(xiàn)有20種結(jié)構(gòu)與功能相似、存在于不同部位的可以調(diào)節(jié)細(xì) 胞內(nèi)和細(xì)胞外Ca"的S100蛋白。S100蛋白家族成員具有廣泛的生物學(xué)活性，通過 鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、影響激素分泌和抑制微管蛋白的組裝及抑制蛋白激酶C介導(dǎo)的磷 酸化等途徑，在細(xì)胞增殖、分化、肌肉收縮、基因表達(dá)、分泌、及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮 重要作用。多個(gè)S100家族成員被發(fā)現(xiàn)和人類癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其中S100A2 在腫瘤中的作用和臨床意義仍然存在一些爭(zhēng)議。在乳腺癌S100A2通常下調(diào)表達(dá)， 以致被描述為潛在的腫瘤抑制基因。也有報(bào)道認(rèn)為肺癌中S100A2下調(diào)或檢測(cè)不到， 而其它一些研究認(rèn)為肺癌中S100A2 mRNA和蛋白水平均呈現(xiàn)過表達(dá)，且和預(yù)后相關(guān)。 多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌、黑色素瘤、淋巴瘤、膀胱癌及皮膚上皮瘤中S100A2過表 達(dá)。S100A2在胰腺癌中過表達(dá)已發(fā)現(xiàn)和腫瘤進(jìn)展、預(yù)后不良密切相關(guān)。
綜上，盡管已知然S100A2在某些腫瘤中有異常表達(dá)，然而本領(lǐng)域目前對(duì) 于S100A2在腫瘤中的作用仍然存在爭(zhēng)議，且其在不同種類腫瘤中的作用也應(yīng) 該是不同的，因此本領(lǐng)域迫切需要深入細(xì)致地研究和大規(guī)模驗(yàn)證S100A2與特 定腫瘤的相關(guān)性，并開發(fā)出可臨床應(yīng)用的檢測(cè)試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種S100A2基因的用途，其可作為胃癌和胃癌組織 轉(zhuǎn)移的標(biāo)志基因。
本發(fā)明的另一目的在于提供檢測(cè)胃癌標(biāo)志基因的試劑或試劑盒。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種S100A2基因的用途，用于制備檢測(cè)胃癌或 胃癌組織轉(zhuǎn)移的試劑或試劑盒。
一種用于檢測(cè)胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的試劑(或材料)，所述的試劑選自下組
4(1) S100A2基因或轉(zhuǎn)錄本的特異性引物；和/或
(2) S100A2基因或轉(zhuǎn)錄本的特異性識(shí)別探針或表面固定有所述探針的芯片。 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑是引物，所述的引物是針對(duì)S100A2外顯子的引物。
在另一優(yōu)選例中，所述的引物是針對(duì)S100A2基因的外顯子2(Exon2)和外 顯子3 (Exon3)的特異性引物(即擴(kuò)增產(chǎn)物跨越外顯子2和外顯子3);或
所述的引物是針對(duì)S100A2基因的外顯子l(Exonl)和外顯子2(Exon2)的特 異性引物(即擴(kuò)增產(chǎn)物跨越外顯子l和外顯子2);或
所述的引物是針對(duì)S100A2基因的外顯子l(Exonl)和外顯子3(Exon3)的特 異性引物(即擴(kuò)增產(chǎn)物跨越外顯子1和外顯子3)。
優(yōu)選的，所述的引物是針對(duì)S100A2基因的外顯子2和外顯子3的特異性 引物。
在另一優(yōu)選例中，所述的特異性引物是具有SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2 所示的序列的引物對(duì)。
在本發(fā)明的第二方面，提供前面任一所述的試劑(或材料)的用途，用于制備 檢測(cè)胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的試劑盒。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種檢測(cè)胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的試劑盒，所述的 試劑盒中含有前面任一所述的試劑。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有正常組織表達(dá)的S100A2基因或轉(zhuǎn) 錄本(優(yōu)選mRNA)的參照品。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有
核酸提取試劑；
聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)試劑；或
描述檢測(cè)胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的方法的說明書。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑裝于容器中。
在本發(fā)明的第四方面，提供一種檢測(cè)受試者(優(yōu)選體外檢測(cè))是否存在胃癌或 胃癌組織轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括檢測(cè)受試者組織樣品中S100A2基因或轉(zhuǎn)錄 本(優(yōu)選mRNA)的表達(dá)，若表達(dá)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于(如高2倍以上，優(yōu)選高5倍以上，
5更優(yōu)選高10倍以上，最優(yōu)選高30倍以上)正常水平，則該受試者存在胃癌或胃癌 組織轉(zhuǎn)移。
在另一優(yōu)選例中，所述的組織樣品選自外周血、骨髓、淋巴結(jié)、腹腔清洗 液、胃壁細(xì)胞或胃液。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而 易見的。


圖1顯示了生物標(biāo)記基因S100A2的序列，該基因包括三個(gè)外顯子(Exon)，分 別稱為Exonl、 Exon2和Exon3。
圖2顯示了 S100A2在人體正常組織中的表達(dá)情況。所述組織包括除去紅細(xì)胞 和血小板的外周血細(xì)胞、胃粘膜、心臟、肺、前列腺、脾、腎、肝、乳腺、子宮內(nèi) 膜、膀胱和骨髓。
圖3顯示了通過Real-time PCR技術(shù)評(píng)估S100A2基因在胃癌/癌旁組織中mRNA 表達(dá)比值。
圖4顯示了通過Real-time PCR技術(shù)診斷胃鏡下標(biāo)本的胃癌或胃炎/正常粘膜 mRNA表達(dá)比值。
圖5顯示了通過Real-time PCR檢測(cè)胃癌在陽(yáng)性淋巴結(jié)和陰性淋巴結(jié)中表達(dá)差異。
圖6顯示了通過Real-time PCR檢測(cè)外周血中游離胃癌細(xì)胞的準(zhǔn)確度與細(xì)胞 學(xué)檢測(cè)的對(duì)比。
圖7顯示了通過Real-time PCR方法檢測(cè)胃癌骨髓轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確度與細(xì)胞學(xué)檢 測(cè)的對(duì)比。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)S100A2基因表達(dá)水平的改變與胃癌 或胃癌組織轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。具體地，S100A2基因表達(dá)的上調(diào)與胃癌或胃癌組織 轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此可以通過檢測(cè)S100A2基因表達(dá)(特別是S100A2 mRNA表達(dá)) 來診斷胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移。S100A2基因?qū)儆贓F-手性鈣結(jié)合蛋白S100超家族成員，其含有三個(gè)外顯子 (圖l): Exonl (SEQ ID NO: 5)， Exon2 (SEQ ID NO: 6)， Exon3 (SEQ ID NO: 7)。
本發(fā)明人通過對(duì)大量的胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移患者的組織進(jìn)行研究，并與胃 炎患者的組織或正常對(duì)照等進(jìn)行比較，從而有力地證實(shí)了S100A2基因與胃癌或 胃癌組織轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。在本發(fā)明的實(shí)施例中，首先，本發(fā)明人比較了人體不 同組織中S100A2 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)除腎組織以外的人體正常組織中S100A2均 低度表達(dá)，因此對(duì)于S100A2用于病理?xiàng)l件下檢測(cè)極為有利。然后，本發(fā)明分別 比較了胃癌與癌旁組織、胃癌與胃炎、胃癌轉(zhuǎn)移陽(yáng)性淋巴結(jié)與陰性淋巴結(jié)中 S100A2 mRNA的差異表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌中S100A2的表達(dá)比癌旁組織、胃炎顯 著增高，轉(zhuǎn)移陽(yáng)性淋巴結(jié)也比陰性淋巴結(jié)顯著增高。因此，S100A2在惡性胃組 織中異常高表達(dá)而在正常組織和胃炎組織不表達(dá)或很低表達(dá)。以S100A2作為診 斷標(biāo)志物，靈敏度高(可高于95%)且特異性良好(可達(dá)到100%)。
因此，基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，可以利用S100A2基因(i)進(jìn)行胃癌或胃 癌組織轉(zhuǎn)移的鑒別診斷、禾P/或易感性分析；(ii)評(píng)估相關(guān)人群的胃癌或胃癌 組織轉(zhuǎn)移治療藥物、藥物療效、預(yù)后，以及選擇合適的治療方法；(iii)早期 評(píng)估相關(guān)人群胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移患病風(fēng)險(xiǎn)，早期監(jiān)測(cè)早期預(yù)防。
本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的試劑。所述的試劑可以 是S100A2基因或轉(zhuǎn)錄本的特異性(與人體其它基因沒有序列重復(fù)或互補(bǔ))引物； 或S100A2基因或轉(zhuǎn)錄本的特異性(不識(shí)別人體其它基因)識(shí)別探針；或表面固定有 所述探針的芯片。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑是引物，所述的引物是針對(duì)S100A2 基因外顯子的引物，更佳的是針對(duì)S100A2的外顯子2(Exon2)和外顯子3(Exon3) 的特異性引物(即擴(kuò)增產(chǎn)物跨越外顯子2和外顯子3);或是針對(duì)S100A2基因的 外顯子l(Exonl)和外顯子2(Exon2)的特異性引物(即擴(kuò)增產(chǎn)物跨越外顯子1和 外顯子2);或是針對(duì)S100A2基因的外顯子l(Exonl)和外顯子3(Exon3)的特異
性引物(即擴(kuò)增產(chǎn)物跨越外顯子l和外顯子3)。
作為本發(fā)明的更優(yōu)選的方式，所述的引物是針對(duì)S100A2基因的外顯子2 和外顯子3的特異性引物，跨越外顯子2和外顯子3的引物對(duì)于PCR擴(kuò)增是有
7利的。更優(yōu)選的，所述的特異性引物是具有SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示 的序列的引物對(duì)，所述引物特異性好，擴(kuò)增效果良好。
本發(fā)明還提供一種檢測(cè)胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的試劑盒，所述的試劑盒比巳有 胃癌檢測(cè)試劑盒具有更好的特異性和選擇性。所述的試劑盒中含有用于檢測(cè) 胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的試劑。所述的試劑可以是S100A2基因或轉(zhuǎn)錄本的特異 性引物；或S100A2基因或轉(zhuǎn)錄本的特異性識(shí)別探針；或同時(shí)包括引物和探針。通 常，所述的試劑存在于適當(dāng)?shù)娜萜髦??？墒褂孟♂寗┤缛ルx子水將每種所述引物 或探針調(diào)整到至少一種需要量的濃度，分裝于容器中。
為了便于進(jìn)行分析和比對(duì)，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑盒中還含有 正常組織表達(dá)的S100A2基因或轉(zhuǎn)錄本(優(yōu)選mRNA)的參照品。
此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取核酸的試劑，用于PCR的試劑，用 于染色或顯色的試劑等。例如，這些試劑包括但不限于抽提液、擴(kuò)增液、雜交 液、顯色液、洗液等。
此外，所述的試劑盒中還可包括描述檢測(cè)胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的方法的說明 書和/或芯片圖像分析軟件等。
本發(fā)明所述的試劑盒可包含適于實(shí)用(如針對(duì)于不同的檢測(cè)方法)的多種不 同的試劑，并不限于目前所列舉的試劑，只要是基于S100A2基因或轉(zhuǎn)錄本的檢 測(cè)來判斷胃癌及轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品均包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
所述的檢測(cè)試劑也可以是S100A2基因或轉(zhuǎn)錄本的特異性識(shí)別探針或表面固 定有所述探針的芯片。探針或芯片的制備方法是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，制備方法例 如可參照王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊(cè)》；J. L. erisi, V. R. Iyer, P,O.BROWN. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science, 1997; 278:680和馬立人、蔣中華主編，《生物芯片》， 北京化學(xué)工業(yè)出版社，2000， 1-130。
本發(fā)明還提供一種檢測(cè)受試者是否存在胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的方法，所述方
法準(zhǔn)確性良好，對(duì)于早期胃癌也可準(zhǔn)確地診斷。所述方法包括利用所述的檢測(cè)
胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的試劑檢測(cè)受試者組織樣品中S100A2基因或轉(zhuǎn)錄本(優(yōu)選 mRNA)的表達(dá)，若表達(dá)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于正常水平，則該受試者存在胃癌或胃癌組 織轉(zhuǎn)移。優(yōu)選的，還設(shè)置檢測(cè)對(duì)照，所述的對(duì)照可以是人正常胃粘膜組織的總mRNA, 優(yōu)選多人份正常胃粘膜組織混合的mRNA樣品。
檢測(cè)受試者組織樣品中S100A2基因或轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)的方法優(yōu)選Real time PCR方法。
一種檢測(cè)方法是獲得組織樣品，從所述樣品分離RNA;使用S100A2的特 異性引物從RNA樣品中擴(kuò)增cDNA拷貝，量化擴(kuò)增的cDNA拷貝，使用量化的擴(kuò) 增的cDNA拷貝來評(píng)估胃癌疾病進(jìn)展或治療效果。
檢測(cè)S100A2mRNA表達(dá)的方法還有很多種，包括可以用名為基于核酸序列擴(kuò) 增法(Nucleic Acid based Amplification, NASBA)的體外RNA擴(kuò)增技術(shù)。當(dāng)然， RNA體外擴(kuò)增技術(shù)不限于NASBA，其它已知的RNA擴(kuò)增方法和即刻的方法和試劑 盒也是可用的。非限制性例子有多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR),轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的擴(kuò)增(transcriptase mediated amplification, TMA)，連 接酶鏈反應(yīng)(ligase chain reaction, LCR)。擴(kuò)增產(chǎn)物通過Beacon方法用熒光 探針在均勻相中被檢測(cè)，或產(chǎn)物可通過熒光或測(cè)熱法(fluorescent or calorimetric method)在固相中檢測(cè)。根據(jù)當(dāng)前發(fā)明檢測(cè)和/或定量靶基因RNA， 多種熒光、測(cè)熱或酶法可以被應(yīng)用。最佳的是，基于特殊熒光探針的實(shí)時(shí)PCR 技術(shù)，其中熒光探針可以是標(biāo)記了熒光的特異互補(bǔ)于S100A2的序列，也可以是 非特異性的雙核苷酸染料如SYBR Green。
組織樣品的獲得是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選可選擇非侵入性或具有最低程 度侵入性的方法獲得。所述的組織樣品可以是(但不限于)外周血、骨髓、淋巴 結(jié)、腹腔清洗液、胃壁細(xì)胞或胃液。
此外，還可應(yīng)用多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將待測(cè)樣品的數(shù)據(jù)與多種儲(chǔ)液的對(duì)照 數(shù)據(jù)比較，作出關(guān)于胃癌的診斷、進(jìn)展或治療效果的判斷。
本發(fā)明的方法準(zhǔn)確性高，可以在胃鏡下或擦拭獲取的看似正常的胃粘膜組 織樣品中檢測(cè)編碼S100A2的mRNA以診斷胃癌；可以確診胃癌病人非胃組織中胃 癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移尤其是微轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
(1)首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)S100A2基因與胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的密切相關(guān)性，驗(yàn) 證的樣本量多，結(jié)果準(zhǔn)確。該相關(guān)性的提出為胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的診斷與治
9療提供了新的途徑。
(2)開發(fā)出了適合于進(jìn)行胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移檢測(cè)的試劑或試劑盒，檢測(cè)靈敏度良好。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說
明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
實(shí)施例l.胃癌及轉(zhuǎn)移組織的準(zhǔn)備
實(shí)施例中所用標(biāo)本均與病人簽署知情同意書后按醫(yī)院規(guī)定途徑獲取。胃鏡下獲取的病理部位標(biāo)本和非病理部位樣本作為對(duì)比，也可是非胃鏡方式
如手術(shù)或胃壁擦拭法獲取的細(xì)胞、手術(shù)中獲取的淋巴結(jié)等樣本應(yīng)立即存放于含液氮
或RANlater(ambion公司產(chǎn)品)中儲(chǔ)存。
外周血、骨髓或腹腔灌洗液的樣本首先通過離心機(jī)1000-2000 rpm/分鐘進(jìn)行
10分鐘離心，收取離心后的細(xì)胞沉淀物，置于液氮或RNAlater中儲(chǔ)存。
實(shí)施例2.樣本中RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增
上述樣本用商業(yè)化的核酸抽提方法進(jìn)行， 一個(gè)常用的非限制性例子是酚/氯仿抽提方法，如用Invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol方法抽提總RNA，并進(jìn)行RNA質(zhì)量鑒定，相關(guān)方法可參照《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》等參考書描述。mRNA的逆轉(zhuǎn)錄過程采用商業(yè)化逆轉(zhuǎn)錄試劑盒并按操作說明書進(jìn)行，所得cDNA按比例稀釋成需要的工作濃度。所用特異性引物經(jīng)優(yōu)化設(shè)計(jì)，上下游引物分別設(shè)計(jì)為可擴(kuò)增跨越S100A2基因Exon2和Exon3部分序列的引物，見圖1。采用基于SYBR Green的熒光染料的Real-time PCR法進(jìn)行耙基因S100A2的mRNA擴(kuò)增。
針對(duì)S100A2基因的引物如下
上游引物GGAACTTCTGCACAAGGAGCTG(SEQ ID NO: 1);
下游引物CACCTGCTGGTCACTGTTCTCA(SEQ ID NO: 2);擴(kuò)增長(zhǎng)度為106bp。
以P-actin為對(duì)照基因，引物如下上游引物CCATCATGAAGTGTGTGACGTGG(SEQ ID NO: 3);
下游引物TCTGCATCCTGTCGGCAAT(SEQ ID NO: 4);擴(kuò)增長(zhǎng)度為魁p。
相對(duì)基因豐度用公式2^E72(Rn—w計(jì)算，其中，Rt是胃癌組織或轉(zhuǎn)移組織中f3-actin的Ct(threshold cycle number), Et是胃癌組織或轉(zhuǎn)移組織中S100A2的Ct; Rn是正常對(duì)照組織中P -actin的Ct， En是正常對(duì)照組織中S100A2的Ct。
實(shí)施例3.人體不同組織中S100A2 mRNA表達(dá)差異
所用人體組織標(biāo)本除正常胃粘膜組織為發(fā)明人從合作醫(yī)院收集外，其它各組織均從商業(yè)化機(jī)構(gòu)購(gòu)買。采用Affymetrix的核苷酸芯片HG-U95Av進(jìn)行各正常組織S100A2mRNA表達(dá)比較，操作過程參照產(chǎn)品說明書。本試驗(yàn)的信號(hào)值是通過管家基因3 -actin熒光值進(jìn)行歸一化處理后的標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)值，信號(hào)值10上下表示信號(hào)很弱，mRNA含量極低。100左右信號(hào)值表示信號(hào)中等，m脂A表達(dá)量中等。如〉1000表示信號(hào)相對(duì)比較強(qiáng)，mRNA表達(dá)豐度較高。
結(jié)果如圖2所示，除腎組織低度表達(dá)S100A2夕卜，其它組織S100A2表達(dá)量極低，說明S100A2 mRNA表達(dá)在正常背景值相當(dāng)?shù)?，這對(duì)S100A2用于病理?xiàng)l件下檢測(cè)極為有利。
實(shí)施例4.手術(shù)胃癌及癌旁組織樣本20對(duì)S100A2的表達(dá)差異
通過手術(shù)取樣的樣本均經(jīng)病理驗(yàn)證后才進(jìn)行RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄cDNA，Real-time PCR法鑒定S100A10在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)差異，所用材料和方法同上，測(cè)試樣本數(shù)為20個(gè)(G1-G20)。
圖3的結(jié)果表明，胃惡性病理?xiàng)l件下特異性高表達(dá)S100A2rnRNA，而癌旁的正常組織低表達(dá)，差異倍數(shù)的中間值(media)達(dá)30-50倍，提示S100A2 mRNA可作為良好的胃癌分子標(biāo)記物。
實(shí)施例5.胃鏡下取樣的胃癌、胃炎中S100A2表達(dá)差異
胃鏡下取樣與手術(shù)獲取的樣本具有較大的差別，主要表現(xiàn)在取樣組織中胃癌細(xì)胞的比例變動(dòng)很大，有時(shí)可能只占取到整塊組織的很小一部分，為此本發(fā)明人專門評(píng)估了 S100A2是否具有足夠的靈敏度用于胃鏡樣本的輔助診斷。上述標(biāo)本均通過病理證明。先取了胃癌細(xì)胞從約1%到50%比例胃癌24例、胃炎10例組織用于本次評(píng)估實(shí)驗(yàn)，方法同樣釆用Real-time PCR相對(duì)定量方法，對(duì)照基因?yàn)镻-actin，以本病人的非病變部位中S100A2 m脂A表達(dá)作為參照計(jì)算熒光相對(duì)強(qiáng)度。
圖4的結(jié)果表明，S100A2具有很高的靈敏度(95.8%)和100%的特異性用于在胃鏡取樣下胃癌的輔助診斷，可提高胃癌病理診斷的客觀性和準(zhǔn)確率。
實(shí)施例6. S100A2 mRNA在胃癌轉(zhuǎn)移陽(yáng)性淋巴結(jié)和陰性淋巴結(jié)中的表達(dá)差異
手術(shù)中獲得的經(jīng)病理證明為胃癌轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的淋巴結(jié)9枚，且轉(zhuǎn)移灶大小不等。病理陰性淋巴結(jié)8枚主要取自早期胃癌病人，原因是盡可能減少病理診斷陰性但實(shí)際有微轉(zhuǎn)移存在的淋巴結(jié)，以避免實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)采取Real-time PCR檢測(cè)方法，具體材料和過程同實(shí)施例2。
圖5的結(jié)果表明，S100A2mRNA在轉(zhuǎn)移陽(yáng)性淋巴結(jié)中高表達(dá)，而在陰性淋巴結(jié)中只有很低表達(dá)。病理陰性淋巴結(jié)中有兩例檢測(cè)出S100A2陽(yáng)性的淋巴結(jié)，經(jīng)病理醫(yī)師連續(xù)切片細(xì)致觀察，鑒定有微轉(zhuǎn)移的存在。因此，從S100A2mRNA表達(dá)程度劃分不僅100%區(qū)分了細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果，而且能檢測(cè)細(xì)胞學(xué)不能檢出的有微轉(zhuǎn)移存在的淋巴結(jié)，相比細(xì)胞學(xué)檢測(cè)該檢測(cè)方法具有更高的靈敏度。
實(shí)施例7.定量PCR檢測(cè)外周血中游離胃癌細(xì)胞的準(zhǔn)確度與細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的對(duì)比
除去紅細(xì)胞和血小板的外周血細(xì)胞抽取RNA，經(jīng)Real-time PCR方法定量檢測(cè)S100A2mRNA表達(dá)水平，通過和胃炎病人和正常人表達(dá)量的對(duì)比，判斷胃癌患者的外周血細(xì)胞中是否有游離胃癌細(xì)胞的存在，并和細(xì)胞學(xué)檢測(cè)比對(duì)。
圖6的結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測(cè)方法100%確認(rèn)細(xì)胞學(xué)鑒定的陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)可檢測(cè)出細(xì)胞學(xué)鑒定為陰性的病例中有部分轉(zhuǎn)移病例，說明該方法比細(xì)胞學(xué)檢測(cè)具有更高的靈敏度，能檢測(cè)到細(xì)胞學(xué)無(wú)法檢測(cè)的微轉(zhuǎn)移存在。
實(shí)施例8.定量PCR方法檢測(cè)胃癌骨髓轉(zhuǎn)移與細(xì)胞學(xué)檢査結(jié)果的對(duì)比
穿刺等方法獲得的胃癌患者骨髓經(jīng)Real-time PCR方法定量檢測(cè)S100A2 mRNA表達(dá)水平，通過和正常骨髓的比較判斷S100A2m脂A是否高表達(dá)，確認(rèn)骨髓是否存在轉(zhuǎn)移和微轉(zhuǎn)移，并與細(xì)胞學(xué)結(jié)果進(jìn)行比較。
圖7的結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測(cè)方法能95%確認(rèn)細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的結(jié)果，同時(shí)陽(yáng)性率高于細(xì)胞學(xué)結(jié)果，表明敏感性比細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法高。實(shí)施例9.檢測(cè)試劑盒
制備一試劑盒，所述的試劑盒中含有
(1) 引物對(duì)，包括
上游引物GGAACTTCTGCACAAGGAGCTG(SEQ ID NO: 1);下游引物CACCTGCTGGTCACTGTTCTCA(SEQ ID NO: 2)。
(2) 常規(guī)的核酸抽提液、dNTPs、 Taq酶、無(wú)RNA酶的H20(RNAase-free H20)、對(duì)照mRNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBR Green。
(3) 使用說明書。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
13序列表
<110> 陳，菲
<120〉用于胃癌和胃癌組織轉(zhuǎn)移的分子檢測(cè)方法和試劑盒
<130〉 081275
<160〉 7
<170〉 Patentln version 3. 3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA <213〉人工序列
<220>
〈221〉 misc—feature
<223〉 引物
<400〉 1
ggaacttctg cacaaggagc tg 22
<210> 2
<211〉 22
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<221〉 misc_feature <223〉 引物
<400〉 2
cacctgctgg tcactgttct ca 22
<210〉 3
<211〉 23
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<220〉
<221〉 misc_feature
<223> 引物
<400> 3ccatcatgaa gtgtgtgacg tgg 23
<210〉 4
〈211〉 19
<212> DNA <213〉人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature <223〉 引物
〈400〉 4
tctgcatcct gtcggcaat 19
<210〉 5 <211〉 47 <212〉 DNA
<213〉 智人(Homo Sapiens) 〈400〉 5
gtgagctcac catgtggggg tgaggctgag agaaaacaag tacacag 47
<210> 6 <211〉 154 <212〉 DNA
〈213> 智人(Homo Sapiens) <400〉 6
ccacagatcc atgatgtgca gttctctgga gcaggcgctg gctgtgctgg tcactacctt 60 ccacaagtac tcctgccaag agggcgacaa gttcaagctg agtaaggggg aaatgaagga 120 acttctgcac aaggagctgc ccagctttgt gggg 154
<210> 7 <211〉 252 <212〉 DNA
〈213〉 智人(Homo Sapiens) <400〉 7
60 120 180 240 252
gagaaagtgg atgaggaggg gctgaagaag cagcaggtgg acttccagga gtatgctgtt gacttcttcc agggctgccc agaccgaccc atctcttggg cccaggactg ttgatgcctt
ctgatgggca gcctggatga gaacagtgac ttcctggcac tcatcactgt catgtgcaat tgaagcagaa ctcttgactt cctgccatgg tgagttttgt attcaataaa ctttttttgt
權(quán)利要求
1. 一種S100A2基因的用途，其特征在于，用于制備檢測(cè)胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的試劑或試劑盒。
2. —種用于檢測(cè)胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的試劑，其特征在于，所述的試劑選自 下組(1) S100A2基因或轉(zhuǎn)錄本的特異性引物；和/或(2) S100A2基因或轉(zhuǎn)錄本的特異性識(shí)別探針或表面固定有所述探針的芯片。
3. 如權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于，所述的試劑是引物，所述的 引物是針對(duì)S100A2外顯子的引物。
4. 如權(quán)利要求3所述的試劑，其特征在于，所述的引物是針對(duì)S100A2基 因的外顯子2和外顯子3的特異性引物；或所述的引物是針對(duì)S100A2基因的外顯子1和外顯子2的特異性引物；或 所述的引物是針對(duì)S100A2基因的外顯子1和外顯子3的特異性引物。
5. 如權(quán)利要求4所述的試劑，其特征在于，所述的特異性引物是具有SEQID N0: 1和SEQ ID NO: 2所示的序列的引物對(duì)。
6. 權(quán)利要求2-5任一所述的試劑的用途，其特征在于，用于制備檢測(cè)胃癌或 胃癌組織轉(zhuǎn)移的試劑盒。
7. —種檢測(cè)胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含 有權(quán)利要求2-5任一所述的試劑。
8. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還含有 核酸提取試劑；聚合酶聯(lián)反應(yīng)試劑；正常組織表達(dá)的S100A2基因或轉(zhuǎn)錄本的參照品；或 描述檢測(cè)胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的方法的說明書。
9. 一種檢測(cè)受試者是否存在胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于，所述 方法包括利用權(quán)利要求2-5任一所述的試劑檢測(cè)受試者組織樣品中S100A2基因 或轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，若表達(dá)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于正常水平，則該受試者存在胃癌或胃癌 組織轉(zhuǎn)移。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的組織樣品選自外周血、 骨髓、淋巴結(jié)、腹腔清洗液、胃壁細(xì)胞或胃液。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種胃癌標(biāo)志基因S100A2及其用途，其可作為檢測(cè)胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。本發(fā)明還公開了檢測(cè)胃癌標(biāo)志基因的試劑或試劑盒及其用途。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)S100A2基因與胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的密切相關(guān)性，并開發(fā)了可用于臨床的試劑和試劑盒，從而為胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移的診斷或治療提供了新的途徑。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101519686SQ20081003406
公開日2009年9月2日 申請(qǐng)日期2008年2月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日
發(fā)明者菲 陳 申請(qǐng)人:蘇州工業(yè)園區(qū)為真生物醫(yī)藥科技有限公司