專利名稱：一種從深度加工型中藥或中藥材中提取dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及中藥中的DNA提取技術(shù)領(lǐng)域，特別是 指 一種從深度加工型中藥或中藥材中提取DNA的方法，非常適合于深度加工型產(chǎn)品， 尤其是因深度加工而導(dǎo)致DNA含量極少，片段極短的中草藥或中草藥材，更尤其是由 動(dòng)物皮、骨熬煉，精制而成的膠類中藥或中藥材。
背景技術(shù)：
我國傳統(tǒng)中藥博大精深，可用作中藥的物質(zhì)種類繁多，其中有一類是利用動(dòng)物皮、 骨熬制而成的膠類中藥，包括阿膠、黃明膠、龜曱膠、鹿角膠等。這些膠類中藥往往 十分名貴，是滋陰潛陽、增強(qiáng)體質(zhì)的上乘佳品。阿膠作為一種傳統(tǒng)名貴中藥，有著2000多年的歷史。早在東漢時(shí)期的著名醫(yī)藥著 作《神農(nóng)本草經(jīng)》中就被列為"上品"，并記載"久服益氣輕身"。魏晉時(shí)期的藥物學(xué)集 成《名醫(yī)別錄》中記載阿膠"出東平郡，東阿縣"。南北朝梁武帝時(shí)期陶弘景在《本草 經(jīng)集注》中記載，"阿膠出東阿，故名阿膠"。阿膠性甘，平，其功能主要補(bǔ)血滋陰， 潤(rùn)燥、止血。用于血虛萎黃，眩暈心悸，肌痿無力，心煩不眠，虛風(fēng)內(nèi)動(dòng)，肺燥咳嗽， 勞嗽嘮血，吐血尿血，便血崩漏，妊娠胎漏，這些功能在《本草綱目》中有詳細(xì)記載。 據(jù)2005年版的中國藥典記載，阿膠本品為馬科動(dòng)物驢的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制 成的固體膠。無論是古代還是現(xiàn)代，阿膠都享有很高的聲譽(yù)。黃明膠又稱牛皮膠，為黃牛皮熬制而成。歷史上也曾經(jīng)使用牛皮熬制阿膠，發(fā)展 到現(xiàn)在，阿膠則以驢皮熬制為貴。黃明膠與阿膠一樣，同樣具有養(yǎng)血止血的功效，治 療諸血癥尤有特效。據(jù)2005年版中國藥典記栽，龜曱膠及鹿角膠等名貴中藥分別是用龜甲及鹿角經(jīng)水 煎煮濃縮制成的固體膠。其中龜甲膠性咸、甘、涼，能夠滋陰，養(yǎng)血，止血，用于陰 虛潮熱，骨蒸盜汗，腰膝酸軟，血虛萎黃，崩漏帶下；而鹿角膠性甘、咸、溫，能夠 溫補(bǔ)肝腎，益精養(yǎng)血。用于肝腎不足所致的腰膝酸冷，陽痿遺精，虛勞羸瘦，崩漏下 血，便血尿血，陰疽腫痛。由此可見，膠類中藥主要用于調(diào)節(jié)身體機(jī)能，滋陰潛陽，增強(qiáng)體質(zhì)，并且對(duì)腎虛， 貧血病人具有很好的療效。因此，該類中藥在整個(gè)中藥市場(chǎng)上占有重要的位置，深受消費(fèi)者的青睞。然而，隨著膠類中藥市場(chǎng)的不斷發(fā)展，隨著熬膠原料供應(yīng)的緊張和原料價(jià)格的上 漲， 一些不法分子趁虛而入，制造假冒偽劣產(chǎn)品來迷惑消費(fèi)者，擾亂市場(chǎng)的正常秩序。 以阿膠為例，國家藥典規(guī)定正品阿膠應(yīng)該由驢皮熬制而成，然而不法分子則變相壓低 成本，在制備阿膠過程中，部分或全部摻入其他的動(dòng)物皮，例如馬皮、牛皮、豬皮或 其它動(dòng)物雜皮進(jìn)行熬制。通過這種方式熬制而成的'偽品阿膠'在外觀及質(zhì)地上都與正 品阿膠極其相似，并且價(jià)格低廉，因此，這類'偽品，對(duì)消費(fèi)者而言很具有迷惑性。但 是，從功用上來看，它們則沒有顯著的療效，并且還很可能對(duì)人體有害。因此，這些 偽品的存在對(duì)整個(gè)阿膠中藥市場(chǎng)的危害是相當(dāng)大的，不僅損害了消費(fèi)者的利益，還敗 壞了傳統(tǒng)中藥的名聲。再例如黃明膠、龜曱膠等，也存在這種類似的情況?？偠灾?， 這些偽劣產(chǎn)品嚴(yán)重破壞了我國傳統(tǒng)中藥的形象損害了消費(fèi)者的健康，不利于我國中藥 事業(yè)的健康發(fā)展。因此，為了保護(hù)我國的傳統(tǒng)膠類中藥以至于整個(gè)中藥產(chǎn)業(yè)，我們急 需建立一種高效、可靠的針對(duì)這種深度加工型膠類中藥的鑒定方法，將市場(chǎng)上的假冒 偽劣產(chǎn)品與正品進(jìn)行區(qū)分。傳統(tǒng)的鑒別膠類物質(zhì)真?zhèn)蔚姆椒ㄖ饕峭ㄟ^對(duì)產(chǎn)品的外觀，顏色，氣味等的考察 來實(shí)現(xiàn)的。 一方面，這些方法的應(yīng)用很多都是憑經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷，不僅掌握困難，誤判 率高，并且在判斷過程中存在大量的人為主觀因素；另一方面，'偽品膠類物質(zhì)，相對(duì) 正品而言，只是在制作原料上存在差異，成品之間則無論是外觀或是質(zhì)地方面的差異 都并不顯著。因此，傳統(tǒng)的鑒別膠類物質(zhì)真?zhèn)蔚姆椒ê茈y有效的打擊膠類中藥市場(chǎng)上 的偽品。然而，隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展， 一些基于DNA的生物學(xué)鑒定手段逐漸豐富起 來，包括各種分子標(biāo)記的使用等，這種基于DNA的生物學(xué)鑒定方法往往準(zhǔn)確性高，重 復(fù)性好，相對(duì)于傳統(tǒng)方法而言更具科學(xué)性，更能適應(yīng)實(shí)際應(yīng)用的需要。目前這一技術(shù) 已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于司法鑒定、食品飼料檢測(cè)、進(jìn)出口檢驗(yàn)等領(lǐng)域，已經(jīng)為人們所廣泛 接受。與此同時(shí)，基于DNA的生物學(xué)鑒定方法也被成功應(yīng)用于中藥鑒定領(lǐng)域，例如對(duì) 蛇類藥材的PCR鑒定等。因此，針對(duì)傳統(tǒng)膠類中藥鑒別手段相對(duì)落后的現(xiàn)狀， 一種基 于DNA的高效，便捷的生物學(xué)鑒別方法的建立將極大的促進(jìn)整個(gè)膠類中藥市場(chǎng)的防偽 打假工作。利用基于DNA的生物學(xué)鑒定技術(shù)來進(jìn)行膠類中藥的鑒定，所面臨的最大問題在于 如何從這種深度加工型中藥中提取得到DNA。 一方面，由于膠類中藥在整個(gè)制備過程 中，往往經(jīng)過泡堿水、高溫高壓蒸煮等操作，其DNA被嚴(yán)重破壞，并且大量損失，因 此成品中所含有的DNA含量極少，片段極短，如何富集這些僅有的少量DNA片段是提取膠類物質(zhì)DNA過程中所必須面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)；另一方面，膠類中藥中最主要的成 分是各種膠原蛋白等肽段，這些蛋白的存在必然對(duì)DNA提取和純化工作造成嚴(yán)重的干 擾，如何克服這些大量存在的蛋白質(zhì)對(duì)DNA提取的影響是整個(gè)膠類物質(zhì)DNA提取過 程中所必須面臨的另 一個(gè)挑戰(zhàn)。此外，我們提取所得到的膠類物質(zhì)DNA還應(yīng)該能夠達(dá) 到 一 些包括PCR在內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)操作的要求，以便于后續(xù)鑒定。由于膠類物質(zhì)的特殊性，它的少量的短片段DNA混雜于在大量的膠原蛋白肽段 中，因此，從膠類物質(zhì)中成功提取得到能進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)操作的DNA的難度是相 當(dāng)大的。事實(shí)上目前國內(nèi)外還沒有任何成功從膠類物質(zhì)中提取出DNA的相關(guān)報(bào)道。一傳統(tǒng)的酚/氯仿抽提方法，這種方法利用酚使得蛋白及各種肽段變性，經(jīng)過萃取操作 以后，蛋白聚集在水相和有機(jī)相的中間層，然后將水相取出，從而達(dá)到將核酸與蛋白 分離的目的。對(duì)普通的生物制品而言，它們的蛋白含量是有限的，經(jīng)過幾次簡(jiǎn)單的酚 抽提，人們可以方便的除去這些制品中的蛋白，因此利用這種方法，人們能夠快速高 效提取得到普通生物制品中的DNA。然而，膠類中藥是一種深度加工的產(chǎn)品，其中含 有大量的膠原蛋白( 一般超過總重量的80% )和極少量的破壞嚴(yán)重的DNA ，在提取DNA 過程中，這種特殊生物制品僅僅依靠幾次常規(guī)酚/氯仿抽提操作是無法除盡其中含有 的大量蛋白的。為了除去大量蛋白，人們往往會(huì)增加酚抽提次數(shù)，然而這種簡(jiǎn)單的做 法勢(shì)必造成樣品中DNA的大量損失，因此常規(guī)酚/氯仿抽提方法并不適用膠類物質(zhì) DNA的提取。再例如堿裂解法，這種方法是利用堿性條件對(duì)蛋白的破壞作用來除去樣 品中的蛋白，當(dāng)樣品中僅僅含有少量蛋白時(shí)，這種方法是便捷、有效的，但是當(dāng)樣品 例如膠類中藥中含有大量蛋白時(shí)，利用該法就很難達(dá)到除盡蛋白的目的，所得到的 DNA提取液也勢(shì)必蛋白含量高，影響后續(xù)的分子生物學(xué)操作。再例如CTAB法，這種 方法主要應(yīng)用于植物細(xì)胞DNA的提取，因?yàn)镃TAB能夠與DNA形成復(fù)合物，而這種復(fù) 合物在高鹽濃度環(huán)境下是溶解的，轉(zhuǎn)到低鹽濃度環(huán)境下，這種復(fù)合物析出，通過這種 轉(zhuǎn)換，就能夠?qū)崿F(xiàn)樣品DNA與蛋白類及多糖類物質(zhì)的分離。這種方法如果用在膠類物 質(zhì)DNA提取上，其局限性與之前的2種方法是類似的，膠類物質(zhì)所含有的大量蛋白會(huì) 嚴(yán)重干擾CTAB與DNA復(fù)合物的形成，并且在通過離心操作分離復(fù)合物的過程也會(huì)混 雜大量的蛋白，試驗(yàn)證明，利用這種方法我們同樣很難提取出膠類中藥的DNA。再例 如硅材料吸附法，包括硅材料膜，硅材料樹脂等，這種材料的表面電荷在高離子序溶 液中會(huì)發(fā)生重組，從而能夠吸附DNA分子。這種吸附作用與溶液pH密切相關(guān)， 一般 而言，中性偏酸性環(huán)境有利于DNA的吸附，而中性偏^喊性環(huán)境則有利于DNA的解吸。 目前，常用的高離子序溶液有鹽酸胍、異硫氰酸胍、高氯酸鈉等，在這種溶液環(huán)境下，肽段將大量變性，人們就可以通過硅材料對(duì)DNA的吸附、解吸作用來實(shí)現(xiàn)DNA的富 集。但是同樣的，膠類中藥蛋白含量極高，大量的蛋白會(huì)對(duì)整個(gè)硅材料對(duì)DNA的吸附 造成嚴(yán)重的干擾，如果在提取過程中不對(duì)膠類物質(zhì)做一些預(yù)處理，首先除去部分蛋白 的話，直接利用這種方法同樣很難順利提取出膠類中藥的DNA。此外，利用這種方法 所采用的高離子序溶液也十分關(guān)鍵，有研究表明，不同的溶液環(huán)境下，硅材料吸附 DNA的性質(zhì)是不同的，在某些溶液環(huán)境下，硅材料可能比較適合于吸附大片段核酸分 子，但在另一些溶液環(huán)境中，硅材料可能就比較適合于吸附小片段的核酸分子。對(duì)于 膠類中藥這種深度加工的產(chǎn)品，其DNA含量極少，并且破壞極其嚴(yán)重，它所包含的顯 然都是 一 些小分子的DNA片段，因此選用 一 種有利于小分子DNA吸附的溶液環(huán)境是 非常重要的。 '可以發(fā)現(xiàn)，單純使用目前存在的任何一種常用的DNA提取方法來提取膠類中藥 中的核酸，我們也許能夠得到少量的DNA樣品，但是想繼續(xù)應(yīng)用于后續(xù)的分子生物學(xué) 檢測(cè)是非常困難的，事實(shí)上，如果直接采用目前市面上的各種國內(nèi)外DNA提取商業(yè)化 試劑盒進(jìn)行阿膠DNA提取，我們同樣也很難得到能夠滿足后續(xù)檢測(cè)要求的DNA樣品。 因?yàn)椴豢杀苊獾模@些方法本身都沒能有效的針對(duì)膠類中藥中蛋白含量極高，DNA 含量低，片段短的特點(diǎn)。因此，要建立一種能夠應(yīng)用于后續(xù)分子生物學(xué)操作的膠類中 藥DNA提取方法就必須在現(xiàn)有基礎(chǔ)上，對(duì)這些常規(guī)方法包括商業(yè)化試劑盒的方法進(jìn)行 一些必要的，有針對(duì)性的調(diào)整和改進(jìn)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的就是針對(duì)以上存在的問題與不足，提供一種從深度加工型中藥 或中藥材中提取DNA的方法，該方法快速、簡(jiǎn)便、可靠、效率高，特別適合因深度加 工而導(dǎo)致核酸含量極少、片段極短的膠類中藥，獲得的DNA能夠用于后續(xù)常規(guī)分子生 物學(xué)搡作，為利用DNA生物學(xué)鑒定技術(shù)實(shí)現(xiàn)膠類中藥的鑒別提供基礎(chǔ)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案一種從深度加工型中藥或中藥材中提取DNA的方法，其特點(diǎn)是，包括下列步驟a) 用消化液對(duì)所述深度加工型中藥或中藥材進(jìn)行預(yù)處理，使所述深度加工型中 藥或中藥材中的大量膠原蛋白降解，少量DNA則被完全釋放溶解于所述消化液中，獲 得預(yù)處理液；b) 采用針對(duì)短片段DNA的抽提方法提取所述預(yù)處理液中的DNA。 所述預(yù)處理包括粉碎所述深度加工型中藥或中藥材成顆粒，加入所述消化液，所述消化液弱堿性且含有SDS，攪拌加熱溶解所述顆粒，加入蛋白酶進(jìn)行消化，所述抽提方法是硅材料吸附法。所述消化液是Tris'EDTA溶液，pH為6 9,所述硅材料吸附法中采用了針對(duì)短片 段核酸吸附的高離子型溶液。所述消化液的pH為8.0，含有10mmol/L Tris-HCl、 25mmol/L EDTA、 100mmol/L NaCl和0.5。/。 SDS,所述高離子型溶液是PN緩沖液，所述蛋白酶是蛋白酶K。在所述步驟a)和所述步驟b)之間，還包括步驟加入除油脂試劑進(jìn)行萃取，除 去所述處理液中含有的大量油脂。所述除油脂試劑是正己烷。上方法在提取所述深度加工型中藥或中藥材的DNA中的應(yīng)用。 所述深度加工型中藥或中藥材是因深度加工而導(dǎo)致DNA含量極少，片段極短的中 草藥或中草藥材。所述深度加工型中藥或中藥材是由動(dòng)物皮、骨熬煉、精制而成的膠類中藥或中藥材。采用本發(fā)明的方法，通過預(yù)處理，在盡量不損傷DNA的前提下，使用了含有SDS 的Tris'EDTA溶液溶解，并用蛋白酶消化，降解膠類中藥中所存在的大量膠原蛋白， 若其中含有較多油脂，可加入除油脂試劑萃取其中的大量油脂，將其中的DNA完全釋 放出來，然后再根據(jù)膠類中藥中DNA分子在經(jīng)過各種處理之后含量極少，并被大量降 解成小片段的特點(diǎn)，以及為了減少過多提取步驟對(duì)DNA造成的損失，采用硅材料吸附 法對(duì)該DNA進(jìn)行富集，并且在吸附過程中采用主要針對(duì)短片段核酸吸附的高離子型溶 液，在這種溶液環(huán)境下，硅材料對(duì)小分子DNA吸附效率較高。最終，通過硅材料對(duì) DNA的吸附與解吸，成功提取得到了膠類中藥的DNA。所得到的DNA能夠適用于一 些常規(guī)的分子生物學(xué)操作包括PCR、酶切等，以便于利用DNA生物學(xué)鑒定技術(shù)來鑒定 這些深度加工的膠類中藥產(chǎn)品。該方法快速、簡(jiǎn)便、可靠、高效率地從深度加工而導(dǎo) 致核酸含量極少、片段極短的膠類中藥中提取DNA,尤其是從由各種動(dòng)物皮、骨熬制 而成的各種膠類中藥包括阿膠、黃明膠、龜曱膠、鹿角膠等中提取DNA。


圖1是采用本發(fā)明的方法從阿膠中提取的DN A的馬科動(dòng)物基因組特異性S IN E序 列ERE-1的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中1.DNA Marker; 2.驢肉基因組DNA陽性對(duì)照；3.阿膠 提取DNA; 4.空白對(duì)照。圖2是采用本發(fā)明的方法從黃明膠提取的DNA的反芻動(dòng)物基因組特異性SINE序 列Bov-A2的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中1.DNA Marker; 2.牛肉基因組DNA陽性對(duì)照；3.黃明膠提取DNA; 4.空白對(duì)照。圖3是采用本發(fā)明的方法從豬皮膠提取的DNA的豬科動(dòng)物基因組特異性SINE序 列PRE-1的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中l(wèi).DNA Marker; 2.豬肉基因組DNA陽性對(duì)照；3.豬皮 膠提取DNA; 4.空白對(duì)照。圖4是采用本發(fā)明的方法從龜曱膠提取的DNA的陸龜超科基因組特異性SINE序 列polIII/SINE的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中l(wèi).DNA Marker; 2.龜基因組DNA陽性對(duì)照；3.龜 曱膠提取DNA; 4.空白對(duì)照。圖5是采用本發(fā)明的方法從鹿角膠提取的DNA的反芻動(dòng)物基因組特異性SINE序 列Bov-A2的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中1.DNA Marker; 2.牛肉基因組DNA陽性對(duì)照；3.鹿 角月交4是取DNA; 4.空白對(duì)照。圖6是用乙醇沉淀法從阿膠提取DNA的馬科動(dòng)物基因組特異性SINE序列ERE-1的 PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中l(wèi).驢肉基因組DNA陽性對(duì)照；2.阿膠提取DNA; 3.空白對(duì)照； 4.DNA Marker; 5.驢肉基因組DNA陽性對(duì)照；6.阿膠提取DNA; 7.空白對(duì)照。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的方法的具體步驟如下1、 膠類中藥的預(yù)處理將膠塊錘擊成顆粒狀，取出若干加入一只50ml無菌離心 管中，并向其中加入消化緩沖液，該緩沖液pH8.0,由10mmol/L Tris-HCl, 25mmol/L EDTA, 100mmol/L NaCl, 0.5% SDS構(gòu)成，然后將離心管置于50。C-60。C水浴中保溫， 其間不時(shí)輕微攪拌混勻，直到顆粒狀物質(zhì)全部溶解。待溶液冷卻至室溫后，加入蛋白 酶K溶液，混勻，56。C保溫l小時(shí)，其間不時(shí)輕微搖勻。對(duì)于含脂肪較多的樣品，如 豬皮膠，可在混和液上柱吸附操作之前于混和液中加入除油脂試劑進(jìn)行萃取，除去樣 品中含有的大量油脂。2、 膠類中藥DNA的提取向上述阿膠預(yù)處理液中加入PN緩沖液，混勻，分若干 次加入硅吸附柱中，離心，將溶液中DNA小心的吸附于吸附柱的硅膜上，再于吸附柱 中加入PE緩沖液洗滌吸附柱膜，除去附著在膜上的少量蛋白及脂類物質(zhì)，完畢之后用 熱的pH 8.0的TE緩沖液將吸附柱膜上的DNA洗脫收集下來并置于-2(TC保存。提取得 到的DNA可用紫外分光光度法定量，并進(jìn)行后續(xù)的PCR操作。上述提取操作過程中所用試劑、耗材皆來自商業(yè)化試劑(德國QIAGEN公司)， 包括PN緩沖液(Cat. No. 1卯71 ) 、 PE緩沖液(Cat. No. 19065 )、硅吸附柱(Cat. No. 28304)。本方法簡(jiǎn)便，快捷，有效，能夠從各種深度加工的膠類中藥中順利提取出DNA,并且能夠進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)常規(guī)操作，能夠滿足實(shí)際中藥生物學(xué)鑒定的要求。 為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn) 一 步說明。 下述實(shí)施例涉及到的材料和試劑、DNA提取、定量、擴(kuò)增及電泳條件如下1. 材料和試劑材料各種市場(chǎng)所售各類動(dòng)物皮、骨等熬制而成的膠類中藥，用作陽性對(duì)照的 各種動(dòng)物的基因組DNA溶液(lng/VL)。 提取試劑消化緩沖液10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 25mmol/L EDTA, 100mmol/L NaCl, 0.5%SDS,高壓滅菌；TE緩沖液10mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 1 mmol/L EDTA，高壓滅菌；PN緩沖液(產(chǎn)于德國QIAGEN, Cat. No. 19071 );PE緩沖液(產(chǎn)于德國QIAGEN, Cat. No. 19065 );吸附柱(產(chǎn)于德國QIAGEN, Cat. No. 28304 );蛋白酶K溶液20mg/ml (產(chǎn)于日本TAKARA， Cat. No. D卯33 );Premix Taq (Premix Ex T叫，Hot Start Version):(產(chǎn)于日本TAKARA， Cat. No. DRR030A);DNA熒光染料10000xGelRedTM: DNA熒光染料(產(chǎn)于Biotium, Cat. No. 41000 )。2. DNA^是耳又的流程1) 將待檢測(cè)的固體膠樣錘擊粉碎成顆粒狀。2) 取lg粉碎膠樣，加入lml的消化緩沖液，在60ml離心管中，封口 50-60。C水浴 中保溫若干分鐘，其間不時(shí)輕微攪拌混勻，直到顆粒狀物質(zhì)全部溶解。3) 待冷卻至室溫后加入50pl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混勻，56。CM呆溫lh,其間 不時(shí)輕微搖勻。4) 加入10mlPN緩沖液，混和均勻。5) *取混和液700i^l至吸附柱中，13000g常溫離心l min,棄收集液。6) 重復(fù)操作5上柱、離心操作，直至混和液全部過柱。(舍棄不溶固體殘留)7) 加入500nl PE緩沖液于吸附柱中，13000g常溫離心l min，棄收集液。8) 重復(fù)7操作2次。9) 將空吸附柱重新置于收集管中，13000g常溫離心2 min。10) 將吸附柱取出，轉(zhuǎn)移至新的1.5ml EP管中，打開吸附柱蓋，常溫放置5 min 干燥。11) 加入lO(Hil預(yù)熱(70°C) TE緩沖液(pH8.0)于吸附柱柱膜中央，常溫放置3 min。12) 13000g常溫離心l min,取收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常溫放置l min。13) 13000g常溫離心2 min，取收集液分裝，即為提取得到的DNA液，-20。C保 存?zhèn)溆谩?對(duì)于含脂肪較多的樣品，如豬皮膠，可在混和液上柱吸附操作之前于混和液 中加入除油脂試劑進(jìn)行萃取，除去樣品中含有的大量油脂。3. 制備DNA的核酸定量將所提取膠類中藥DNA進(jìn)行核酸定量，利用紫外分光光度法檢測(cè)其OD26o確定濃 度，并且根據(jù)OD26o/OD，值來考察所提取DNA樣品純度。將所提取的膠類中藥DNA 稀釋至10ng/)al備用。4. 制備DNA的PCR檢測(cè)，確定其來源并且考察其是否可用于PCR反應(yīng)，下面的 試驗(yàn)方法以阿膠、黃明膠、豬皮膠以及龜曱膠為例，試驗(yàn)方法和條件具體如下A) 引物設(shè)計(jì)根據(jù)馬科動(dòng)物(Equidae) SINE序列ERE-1設(shè)計(jì)，理論目標(biāo)條帶大小81bp,用于 檢測(cè)阿膠中DN A 。其序列如下上游引物Assup : 5'-CGGACATGGCACTGCTCAT-3， 下游引物Assdown: 5'-TATATTCTTCGTTGTGGGTCCTTCT-3， 根據(jù)反芻亞目動(dòng)物(Ruminantia) SINE序列Bov-A2設(shè)計(jì)引物，理論目標(biāo)條帶大小 70bp,用于檢測(cè)黃明膠中DNA。其序列如下上游引物Rum up: 5'-AGAAGGCAATGGCAACCCAC-3' 下游引物Rum down: 5，-AACCCACCAGGCTCCTCTGT-3， 根據(jù)豬科動(dòng)物(Suidae) SINE序列PRE-1設(shè)計(jì)引物，理論目標(biāo)條帶大小88bp,用 于檢測(cè)豬皮膠中DNA。其序列如下上游引物Pig up: 5，-CGAATCCGACTAGGAACCA-3， 下游引物Pig down: 5，-ACCACATCTCACGGCTACG-3， 根據(jù)陸龜超科動(dòng)物(Testudinoidea) SINE序列polIII/SINE設(shè)計(jì)引物，理論目標(biāo)條 帶大小72bp，用于檢測(cè)龜曱月交中DNA。其序列如下上游引物 Turtle up: 5'-GAGCATTGGCCTGCTAAACC-3， 下游引物 Turtle down: 5，-TTTTGCCCCAGATCCCTAAA-3，B) PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系中各試劑用量根據(jù)反應(yīng)體系的總體積進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。以檢測(cè)阿膠、黃明膠、豬皮膠以及龜曱膠中DNA為例，PCR檢測(cè)參考反應(yīng)體系如下 檢測(cè)阿膠提取DNA:25plPCR反應(yīng)體系:P腿ix Taq 12，、 Ass up ( 10,ol/l) 0.5^1， Ass down UOpmol/1) 0.5^1, ^模板DNA ( 10ng/nL) 5-l(Hil、無菌超純水補(bǔ)足反應(yīng)體系，使總 體積為25^1。*:陽性對(duì)照樣品中的DNA模板(IngVL)用量0.5-lpl。 檢測(cè)黃明膠提取DNA:25^1 PCR反應(yīng)體系:Premix Taq 12.5^1、 Rum up ( 10pmol/l) 0，, Rum down (lO^mol/1) 4莫板DNA 5-10(^1、無菌超純水補(bǔ)足反應(yīng)體系，使總體積為25pl。*:陽性對(duì)照樣品中的DNA模板量(lng L)用0.5-lpl。 檢測(cè)豬皮膠提取DNA:25)^1 PCR反應(yīng)體系:Premix Taq 12.5^1、 Pig up ( lO^imol/l) 0.5^il, Pig down (lO^imol/1) 0.5pl， ^莫板DNA 5-10W、無菌超純水補(bǔ)足反應(yīng)體系，使總體積為25pl。 *:陽性對(duì)照樣品中的DNA模板量(lng/^L)用0.5-lpl。 檢測(cè)龜甲膠提取DNA:25|al PCR反應(yīng)體系Premix Taq 12.5|il、 Turtle up( lOpmol/1) 0.5^1， Turtle down (lO^mol/1) 0.5^1， ^莫板DNA ( 10ng/pl) 5-10pl、無菌超純水補(bǔ)足反應(yīng)體系，使總體 積為25pl。*:陽性對(duì)照樣品中的DNA模板量(lng小L)用0.5-lpl。 C. PCR反應(yīng)條件以分別檢測(cè)阿膠、黃明膠、豬皮膠、龜甲膠DNA的PCR反應(yīng)為例，它們的反應(yīng)條 件是類似的阿膠DNA檢測(cè)變性94°C 6min;擴(kuò)增94°C 30s, 60°C 30s, 72。C30s(40循 環(huán))；最后延伸72 °C 7min黃明膠DNA檢測(cè)變性94°C 6min;擴(kuò)增94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s ( 40-50 循環(huán))；最后延伸72°C 7min豬皮膠DNA檢測(cè)變性94°C 6min;擴(kuò)增94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s ( 30 循環(huán))；最后延伸72°C 7min龜曱膠DNA檢測(cè)變性94°C 6min;擴(kuò)增94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s ( 40-50 循環(huán))；最后延伸72°C 7minD.電泳條件用1 xTAE電泳緩沖液制備2.5 %瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料GelRedTM。按照比例將10pl的PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液均勻混合,加入凝膠孔中，所用的 DNA marker為20bp DNA Ladder Marker (日本TAKARA， Cat. No. D521A ),點(diǎn)樣5jal 于凝膠孔中電泳。選擇合適的電壓(4V/cm-1 OV/cm )進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為40-60分 鐘，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于凝膠成像儀上觀察并拍照。實(shí)施例l 提取阿膠中所含有的DNA并對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)以市售阿膠(山東東阿阿膠股份有限公司)為材料，采用下述方法提取其中的 DNA。1) 將待檢測(cè)的固體膠樣錘擊粉碎成顆粒狀。2) 取lg粉碎膠樣，加入lml的消化緩沖液，在60ml離心管中，封口 50-60。C水浴 中保溫若干分鐘，其間不時(shí)輕微攪拌混勻，直到顆粒狀物質(zhì)全部溶解。3) 待冷卻至室溫后加入50pl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混勻，56。C保溫lh,其間 不時(shí)輕微搖勻。4) 加入10mlPN緩沖液，混和均勻。5) 取混和液700(al至吸附柱中，13000g常溫離心l min,棄收集液。6) 重復(fù)操作5上柱、離心操作，直至混和液全部過柱。(舍棄不溶固體殘留)7) 加入500pl PE緩沖液于吸附柱中，13000g常溫離心l min,棄收集液。8) 重復(fù)7操作2次。9) 將空吸附柱重新置于收集管中，13000g常溫離心2 min。10) 將吸附柱取出，轉(zhuǎn)移至新的1.5ml EP管中，打開吸附柱蓋，常溫放置5 min 干燥。11) 加入100pl預(yù)熱(70°C) TE緩沖液(pH8.0)于吸附柱柱膜中央，常溫放置 5 min。12) 13000g常溫離心l min,取收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常溫放置l min。13) 13000g常溫離心2 min,取收集液分裝，即為提取得到的DNA液，-20°〇保 存?zhèn)溆?。利用核酸定量?jī)x對(duì)所提取的阿膠DNA進(jìn)行核酸定量，分別確定其核酸濃度以及純 度。濃度為21.0ng 1, OD26o/OD28o為1.26。由此可見，從lg阿膠樣品中成功提取得到 DNA。用傳統(tǒng)方法提取的驢肉組織基因組DNA作為陽性對(duì)照，利用擴(kuò)增馬科動(dòng)物特異性 SINE序列ERE-1的引物，以本方法提取的阿膠DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增鑒定本方法所提取的DNA是否能滿足后續(xù)PCR檢測(cè)的要求。結(jié)果見圖1。由圖l,從阿膠中提取的DNA，利用擴(kuò)增馬科動(dòng)物特異性DNA序列ERE-1的引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得擴(kuò)增片段與對(duì)照驢肉基因組的擴(kuò)增片段大小完全一致?？梢姡?用本方法確實(shí)能夠正確提取得到阿膠中的DNA,包括其中因深度加工而含量極少、片 段極短的驢源性成分DNA,并且能完全滿足后續(xù)PCR檢測(cè)的要求。實(shí)施例2 提取黃明膠中所含有的DNA并對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)以市售黃明膠(山東東阿阿膠股份有限公司)為原料采用下述方法提取其中的 DNA。1) 將待檢測(cè)的固體膠樣錘擊粉碎成顆粒狀。2) 取1 g粉碎膠樣，加入1 ml的消化緩沖液，在60ml離心管中，封口 50-60 °C水浴 中保溫若干分鐘，其間不時(shí)輕微攪拌混勻，直到顆粒狀物質(zhì)全部溶解。3) 待冷卻至室溫后加入50pl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混勻，56。C保溫lh，其間 不時(shí)輕微搖勻。4) 加入10mlPN緩沖液，混和均勻。5) 耳又混和液700nl至吸附柱中，13000g常溫離心lmin,棄收集液。6) 重復(fù)操作5上柱、離心操作，直至混和液全部過柱。(舍棄不溶固體殘留)7) 加入500pl PE緩沖液于吸附柱中，13000g常溫離心l min，棄收集液。8) 重復(fù)7操作2次。9) 將空吸附柱重新置于收集管中，13000g常溫離心2min。10) 將吸附柱取出，轉(zhuǎn)移至新的1.5ml EP管中，打開吸附柱蓋，常溫放置5 min 干燥。11) 加入100nl預(yù)熱(70°C) TE緩沖液(pH8.0)于吸附柱柱膜中央，常溫放置 5 min。12) 13000g常溫離心l min,取收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常溫》文置1 min。13) 13000g常溫離心2 min，取收集液分裝，即為換_取得到的DNA液，-20°。保 存?zhèn)溆?。利用核酸定量?jī)x對(duì)所提取的黃明膠DNA進(jìn)行核酸定量，分別確定其核酸濃度以及 純度。濃度為26.6ng/^1, OD26o/OD28()為1.35。由此可見，從lg黃明膠樣品中成功提取 得到DNA。用傳統(tǒng)方法提取的牛肉組織基因組DNA作為陽性對(duì)照，利用擴(kuò)增反芻亞目動(dòng)物特異性SINE序列Bov-A2的引物，以本方法提取的黃明膠DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增鑒 定本方法所提取的DNA是否能滿足后續(xù)PCR檢測(cè)的要求。結(jié)果見圖2 。由圖2,從黃明膠中提取的DNA,在利用擴(kuò)增反芻亞目動(dòng)物特異性SINE序列 Bov-A2的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以后，得到的擴(kuò)增片段與對(duì)照牛肉基因組的擴(kuò)增片段大小 完全一致?？梢姡帽痉椒ù_實(shí)能夠正確提取得到黃明膠中的DNA,包括其中因深 度加工而含量極少、片段極短的牛源性成分DNA并且能完全滿足后續(xù)PCR檢測(cè)的要 求。實(shí)施例3 提取豬皮膠中所含有的DNA并對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)以山東東阿阿膠股份有限公司研究所利用豬皮熬制的豬皮膠為原料采用下述方 法提取其中的DNA。1) 將待檢測(cè)的固體膠樣錘擊粉碎成顆粒狀。2) 取lg粉碎膠樣，加入lml的消化緩沖液，在60ml離心管中，封口 50-60。C水浴 中保溫若干分鐘，其間不時(shí)輕微攪拌混勻，直到顆粒狀物質(zhì)全部溶解。3) 待冷卻至室溫后加入50pl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混勻，56。C保溫lh，其間 不時(shí)輕微搖勻。4) 加入10mlPN緩沖液，混和均勻，加入2ml正己烷，輕微顛倒混勻，3000g, 4。C離心5min,棄上清，將下層溶液轉(zhuǎn)移到干凈的50 ml離心管中。5) ^^混和液70(^1至吸附柱中，13000g常溫離心lmin,棄收集液。6) 重復(fù)操作5上柱、離心操作，直至混和液全部過柱。7) 加入500)ilPE緩沖液于吸附柱中，13000g常溫離心lmin,棄收集液。8) 重復(fù)7操作2次。9) 將空吸附柱重新置于收集管中，13000g常溫離心2min。10) 將吸附柱取出，轉(zhuǎn)移至新的1.5ml EP管中，打開吸附柱蓋，常溫放置5 min 干燥。11) 加入100nl預(yù)熱(70°C) TE緩沖液(pH8.0)于吸附柱柱膜中央，常溫放置 5 min。12) 13000g常溫離心l min，取收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常溫放置l min。13) 13000g常溫離心2 min,取收集液分裝，即為提取得到的DNA液，-20°。保 存?zhèn)溆谩＠煤怂岫績(jī)x對(duì)所提取的豬皮膠DNA進(jìn)行核酸定量，分別確定其核酸濃度以及純度。濃度為177.6ng/nl， OD26o/OD28o為1.8。由此可見，從lg豬皮膠樣品中成功提取 得到DNA。用傳統(tǒng)方法提取的豬肉組織基因組DNA作為陽性對(duì)照，利用擴(kuò)增豬科動(dòng)物特異性 SINE序列PRE-1的引物，以本方法提取的豬皮膠DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增鑒定本方 法所提取的DNA是否能滿足后續(xù)PCR檢測(cè)的要求。結(jié)果見圖3 。由圖3,從豬皮膠中提取的DNA，在利用擴(kuò)增豬科動(dòng)物特異性SINE序列PRE-1的 51物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以后，得到的擴(kuò)增片段與對(duì)照豬肉基因組的擴(kuò)增片段大小完全一 致?？梢姡帽痉椒ù_實(shí)能夠正確提取得到豬皮膠中的DNA，包括其中因深度加工 而含量極少、片段極短的豬源性成分DNA，并且能完全滿足后續(xù)PCR檢測(cè)的要求。實(shí)施例4 提取龜曱膠中所含有的DNA并對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)以市售龜甲膠(山東東阿阿膠股份有限公司生產(chǎn))為原料，采用下述方法提取其 中的DNA。1) 將待檢測(cè)的固體膠樣錘擊粉碎成顆粒狀。2) 取lg粉碎膠樣，加入lml的消化緩沖液，在60ml離心管中，封口50-60。C水浴 中保溫若干分鐘，其間不時(shí)輕微攪拌混勻，直到顆粒狀物質(zhì)全部溶解。3) 待冷卻至室溫后加入50pl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混勻，56。C保溫lh,其間不 時(shí)輕微搖勻。4) 加入10mlPN緩沖液，混和均勻。5) 取混和液700pl至吸附柱中，13000g常溫離心lmin，棄收集液。6) 重復(fù)操作5上柱、離心操作，直至混和液全部過柱。(舍棄不溶固體殘留)7) 加入500(ilPE緩沖液于吸附柱中，13000g常溫離心lmin,棄收集液。8) 重復(fù)7操作2次。9) 將空吸附柱重新置于收集管中，13000g常溫離心2min。10) 將吸附柱取出，轉(zhuǎn)移至新的1.5mlEP管中，打開吸附柱蓋，常溫放置5min干燥。11) 加入100pl預(yù)熱(70°C) TE緩沖液(pH8.0)于吸附柱柱膜中央，常溫;故置5 min。12) 13000g常溫離心l min,取收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常溫放置l min。13) 13000g常溫離心2min,取收集液分裝，即為提取得到的DNA液，-2(TC保存 備用。利用核酸定量?jī)x對(duì)所提取的龜曱膠DNA進(jìn)行核酸定量，分別確定其核酸濃度以及 純度。濃度為20.8ng OD雄/OD28o為1.45。由此可見，從lg龜曱膠樣品中成功提取 得到DNA。用傳統(tǒng)方法提取的龜肉組織基因組DNA作為陽性對(duì)照，利用擴(kuò)增陸龜超科動(dòng)物特 異性SINE序列pol III/SINE的引物，以本方法提取的龜曱膠DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增 鑒定本方法所提取的DNA是否能滿足后續(xù)PCR檢測(cè)的要求。結(jié)果見圖4 。由圖4，從龜曱膠中提取的DNA,利用擴(kuò)增陸龜超科動(dòng)物特異性DNA序列polIII /SINE的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得擴(kuò)增片段與對(duì)照龜肉基因組的擴(kuò)增片段大小完全一 致?？梢?，利用本方法確實(shí)能夠正確提取得到龜曱膠中的DNA,包括其中因深度加工 而含量極少、片段極短的龜源性成分DNA,并且能完全滿足后續(xù)PCR檢測(cè)的要求。實(shí)施例5 提取鹿角膠中所含有的DNA并對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)以市售鹿角膠(山東東阿阿膠股份有限公司生產(chǎn))為原料，采用下述方法提取其 中的DNA。1) 將待檢測(cè)的固體膠樣錘擊粉碎成顆粒狀。2) 取1 g粉碎膠樣，加入1 ml的消化緩沖液，在60ml離心管中，封口 50-60°C水浴 中保溫若干分鐘，其間不時(shí)輕微攪拌混勻，直到顆粒狀物質(zhì)全部溶解。3) 待冷卻至室溫后加入50pl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混勻，56。C保溫lh，其間不 時(shí)輕微搖勻。4) 加入10mlPN緩沖液，混和均勻。5) 取混和液700^d至吸附柱中，13000g常溫離心lmin，棄收集液。6) 重復(fù)操作5上柱、離心操作，直至混和液全部過柱。(舍棄不溶固體殘留)7) 加入500nlPE緩沖液于吸附柱中，13000g常溫離心l min,棄收集液。8) 重復(fù)7操作2次。9) 將空吸附柱重新置于收集管中，13000g常溫離心2min。10) 將吸附柱取出，轉(zhuǎn)移至新的1.5mlEP管中，打開吸附柱蓋，常溫放置5min干燥。11) 加入100nl預(yù)熱(70°C) TE緩沖液(pH8.0)于吸附柱柱膜中央，常溫放置5 min。12) 13000g常溫離心l min,耳又收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常溫;故置l min。13) 13000g常溫離心2min,取收集液分裝，即為提取得到的DNA液，-20匸保存?zhèn)溆谩＠煤怂岫績(jī)x對(duì)所提取的鹿角膠DNA進(jìn)行核酸定量，分別確定其核酸濃度以及 純度。濃度為16.2ng/nl， OD26o/OD28o為1.28。由此可見，從lg鹿角膠樣品中成功提取 得到DNA。方法以及試劑和實(shí)施例2中檢測(cè)黃明膠時(shí)所用條件都是一致的，因?yàn)槁挂彩菍儆?反芻動(dòng)物亞目的，因此也可以利用該反芻亞目SINE序列來檢測(cè)其中的鹿源性成分。 即，用傳統(tǒng)方法提取的牛肉組織基因組DNA作為陽性對(duì)照，利用擴(kuò)增反芻亞目動(dòng)物特 異性SINE序列Bov-A2的引物，以本方法提取的鹿角膠DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增鑒 定本方法所提取的DNA是否能滿足后續(xù)PCR檢測(cè)的要求。結(jié)果見圖5 。由圖5,從鹿角膠中提取的DNA，在利用擴(kuò)增反芻亞目動(dòng)物特異性SINE序列 Bov-A2的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以后，得到的擴(kuò)增片段與對(duì)照牛肉基因組的擴(kuò)增片段大小 完全一致?？梢姡帽痉椒ù_實(shí)能夠正確提取得到鹿角膠中的DNA,包括其中因深 度加工而含量極少、片段極短的鹿源性成分DNA并且能完全滿足后續(xù)PCR檢測(cè)的要 求。對(duì)比實(shí)施例利用酚/氯仿、乙醇沉淀法提取阿膠DNA及PCR檢測(cè)此方法所用試劑 乙酸鈉溶液3MPH5.2消化緩沖液50mMTris-HCl, 50mM EDTA， 0.5% SDS， PH 8.01. 將待檢測(cè)的固體膠樣錘擊粉碎成顆粒狀。2. 取lg粉碎膠樣，加入20-25 ml的消化緩沖液，在60ml離心管中，封口 50-60。C 水浴中保溫若干分鐘，其間不時(shí)輕微攪拌混勻，直到顆粒狀物質(zhì)全部溶解。3. 待冷卻至室溫后加入100-150(il 20mg/ml蛋白酶K溶液，混勻，56。C保溫lh， 其間不時(shí)輕微搖勻。4. 于離心管中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25/24/l體積比)PH 8.0抽提液，漩 渦振蕩器上強(qiáng)烈振蕩10s,使2相充分混合形成乳濁液。室溫下5000g離心 10-15min。靜置分層，收集水相于另一60ml離心管中。5. 重復(fù)4操作2次。6. 加入0.1倍體積的乙酸鈉溶液以及2倍體積的冰冷乙醇，充分混勻，于-2(TC冰 箱中放置過夜。7. 取出離心管，于0。C, 10000rpm離心30min，用移液管小心吸出上清液8. 加入lml的70。/o冰乙醇，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，洗滌沉淀，4。C下10000rpm離心10min,用移液管小心吸出上清液。9. 重復(fù)8操作。10. 將離心管于室溫下敞口放置在試驗(yàn)臺(tái)上，直至殘留的液體揮發(fā)干。11. 將沉淀下來的DNA充分溶解于100jxl的TE緩沖液中-2(TC保存?zhèn)溆?。利用核酸定量?jī)x對(duì)利用常規(guī)酚/氯仿，乙醇沉淀法提取的阿膠DNA進(jìn)行核酸定量， 分別確定其核酸濃度以及純度。濃度為18.6ng/nl， OD雄/OD28o為2。由此可見，從lg 阿膠樣品中我們也能夠成功提取得到DNA 。用傳統(tǒng)方法提取的驢肉組織基因組DNA作為陽性對(duì)照，利用擴(kuò)增馬科動(dòng)物特異性 SINE序列ERE-1的引物，以本方法提取的阿膠DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增鑒定本方法 所提取的DNA是否能滿足后續(xù)PCR檢測(cè)的要求。結(jié)果見圖6，其中，1 3為30個(gè)循環(huán)的 結(jié)果，5 7為40個(gè)循環(huán)的結(jié)果。由圖6，利用傳統(tǒng)方法從阿膠中提取的DNA,在利用擴(kuò)增馬科動(dòng)物特異性SINE序 列ERE-1的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以后，無法得到任何擴(kuò)增條帶?？梢娢覀兝贸Ｒ?guī)方法 得到的DNA中并不包含驢源性成分，所得到的DNA很可能來自阿膠制備后期所添加 的輔料包括黃酒、豆油等，而極少量的破壞嚴(yán)重的驢源性DNA利用這種常規(guī)方法是無 法得到富集的?？梢?，利用本方法并沒能富集得到阿膠中含量極少、片段極短的驢源 性成分DNA,并不能夠滿足后續(xù)PCR4全測(cè)的要求。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的DNA提取方法可以有效提取膠類中藥中含量極少的 DNA分子，獲得的DNA完全能夠滿足后續(xù)的分子生物學(xué)檢測(cè)的需要。在本發(fā)明中，為了防止膠類物質(zhì)中本來就含量極少的DNA分子在提取過程中再次 損失，我們盡量減少萃取操作步驟，并且選擇了硅材料吸附法進(jìn)行DNA的富集。同樣 的，為了能夠順利富集膠類物質(zhì)中存在的短片段DNA分子，我們所用的高離子型吸附 緩沖液也是精心選擇的。又例如，在提取過程初始階段，我們?cè)黾恿说鞍酌赶念A(yù) 處理步驟，使得樣品通過預(yù)處理之后， 一方面DNA分子能夠完全釋放到緩沖液中，另 一方面，樣品中包含的大量蛋白也能夠被初步消化分解。再例如，為了排除動(dòng)物膠類 物質(zhì)中可能存在的大量脂質(zhì)對(duì)整個(gè)DNA提取過程的干擾，我們?cè)谔崛∵^程中還添加除 油脂試劑，通過萃取以消除這些物質(zhì)的影響。綜上所述，為了克服了膠類物質(zhì)中蛋白含量極高，DNA含量極少，片段極短的困 難，順利制備得到膠類物質(zhì)中的DNA,建立了 一種在現(xiàn)有的各種DNA提取方法基礎(chǔ) 上進(jìn)行改進(jìn)的、新的適合于深度加工的膠類物質(zhì)DNA提取的技術(shù)，并且所提取得到的 DNA能夠滿足后續(xù)的分子生物學(xué)檢測(cè)的需要。因此，本發(fā)明的從深度加工型中藥或中藥材中提取DNA的方法快速、簡(jiǎn)便、可靠、 效率高，特別適合因深度加工而導(dǎo)致核酸含量極少、片段極短的膠類中藥，獲得的 DNA能夠用于后續(xù)常規(guī)分子生物學(xué)操作，為利用DNA生物學(xué)鑒定技術(shù)實(shí)現(xiàn)膠類中藥 的鑒別提供基礎(chǔ)。需要說明的是，在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每 一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，以上所述的是本發(fā)明的具體實(shí)施例 及所運(yùn)用的技術(shù)原理，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì) 本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改而不背離本發(fā)明的精神與范圍，這些等價(jià)形式同樣落在本發(fā) 明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種從深度加工型中藥或中藥材中提取DNA的方法，其特征在于，包括下列步驟a)用消化液對(duì)所述深度加工型中藥或中藥材進(jìn)行預(yù)處理，使所述深度加工型中藥或中藥材中的大量膠原蛋白降解，少量DNA則被完全釋放溶解于所述消化液中，獲得預(yù)處理液；b)采用針對(duì)短片段DNA的抽提方法提取所述預(yù)處理液中的DNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述預(yù)處理包括粉碎所述深度加工型中 藥或中藥材成顆粒，加入所述消化液，所述消化液弱堿性且含有SDS,攪拌加熱 溶解所述顆粒，加入蛋白酶進(jìn)行消化，所述抽提方法是硅材料吸附法。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述消化液是Tris.EDTA溶液，pH為6-9， 所述硅材料吸附法中采用了針對(duì)短片段核酸吸附的高離子型溶液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述消化液的pH為8.0,含有10mmol/L Tris-HCl、 25mmol/L EDTA、 100mmol/L NaCl和0.50/。 SDS,所述高離子型溶液是 PN緩沖液，所述蛋白酶是蛋白酶K。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，在所述步驟a)和所述步驟b)之間，還 包括步驟加入除油脂試劑進(jìn)行萃取，除去所述處理液中含有的大量油脂。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述除油脂試劑是正己烷。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法在提取所述深度加工型中藥或中藥材的DNA中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述深度加工型中藥或中藥材是因深度 加工而導(dǎo)致DNA含量極少，片段極短的中草藥或中草藥材。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述深度加工型中藥或中藥材是由動(dòng)物 皮、骨熬煉、精制而成的膠類中藥或中藥材。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從深度加工型中藥或中藥材中提取DNA的方法，包括步驟a)用消化液對(duì)所述深度加工型中藥或中藥材進(jìn)行預(yù)處理，利用0.5％SDS及蛋白酶K消化，使所述深度加工型中藥或中藥材中的大量膠原蛋白降解，少量DNA則被完全釋放溶解于所述消化液中，獲得預(yù)處理液；b)采用針對(duì)短片段DNA的抽提方法提取所述預(yù)處理液中的DNA，該方法快速、簡(jiǎn)便、可靠、效率高，特別適合因深度加工而導(dǎo)致核酸含量極少、片段極短的膠類中藥，獲得的DNA能夠用于后續(xù)常規(guī)分子生物學(xué)操作，為利用DNA生物學(xué)鑒定技術(shù)實(shí)現(xiàn)膠類中藥的鑒別提供基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101270357SQ20081003444
公開日2008年9月24日 申請(qǐng)日期2008年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月11日
發(fā)明者品 呂, 周祥山, 尤金花, 張?jiān)d, 楊繼忠, 田守生, 秦玉峰 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué);山東東阿阿膠股份有限公司