專利名稱：：D-氨甲酰水解酶的突變體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體內(nèi)容涉及D-氨甲酰水解酶的突變體及其在生產(chǎn)D-對羥基苯甘氨酸中的應(yīng)用。D-對羥基苯甘氨酸(D-p-hydroxyphenylglycine,DHPG)是合成羥氨芐青霉素和羥氨芐頭孢霉素等(3-半合成內(nèi)酰胺類抗生素的關(guān)鍵手性中間體。目前的全球市場需求在22000噸左右，折合人民幣約17億元。以有機(jī)合成消旋對羥基苯甘氨酸再手性拆分曾是生產(chǎn)DHPG的主要方法，80年代以后D-海因酶(D-hydantoinase，Dhase)/D-氨甲酰水解酶(D-carbamoylase，Dcase)兩步不對稱水解混旋對羥基苯海因生產(chǎn)DHPG的方法逐漸為國外大公司所采用，其原理如下
背景技術(shù)：
：D-海因酶D-氨甲酰水解酶酶法的技術(shù)原理是用D-乙內(nèi)酰脲酶(也稱為D-海因酶)將DL-對羥基苯海因不對稱水解成N-氨甲?；鵇-對羥基苯甘氨酸，然后在N-氨甲酰-D-氨基酸水解酶(也稱為D-氨甲酰水解酶，簡稱Dcase)的作用下，將N-氨甲?；?D-對羥基苯甘氨酸不可逆水解轉(zhuǎn)變成DHPG。兩種酶中，DCase的熱穩(wěn)定性相對較差，這對于只使用一次的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化影響不太大，但對于固定化酶的使用方式卻相當(dāng)不利，不能被長時(shí)間反復(fù)使用。因此，提高DCase熱穩(wěn)定性是固定化酶的研發(fā)重點(diǎn)。獲得熱穩(wěn)定的酶，一種方法是從自然界篩選天然耐熱的酶，日本鐘淵株式會社從土壤中篩選到一株能產(chǎn)生耐熱DCase的尸wwcfono朋ssp.KNK003(Ikenaka,Y.，etal.,BioscienceBiotechnologyandBiochemistry,1998.62(5):p.882-886.)，但是與來源于^gra6""e〃wwsp.KNK712的不耐熱DCase相比，其比活力要低很多。因此，鐘淵株式會社選擇了另一種獲得耐熱酶的方法，對來源于KNK712的DCase基因進(jìn)行隨機(jī)突變，隨后通過篩選大量突變體。鐘淵株式會社首先以羥胺對來源于KNK712的DCase基因進(jìn)行正鏈隨機(jī)突變，篩選27,000株突變體庫獲得熱穩(wěn)定性提高約5'C的突變酶，測序結(jié)果顯示57位的組氨酸突變?yōu)槔野彼?；隨后，鐘淵又對KNK712來源的DCase基因片段的正鏈用亞硝酸鈉處理，而負(fù)鏈用羥胺處理后分別獲得突變體庫，篩選得到耐熱突變體，測序結(jié)果顯示203位的脯氨酸突變?yōu)榱涟彼峄蚪z氨酸可提高KNK712DCase的熱穩(wěn)定性，236位的纈氨酸突變?yōu)楸彼峥商岣邿岱€(wěn)定性10°C。進(jìn)一步對上述3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)57位的組氨酸變?yōu)榱涟彼幔?03位的脯氨酸突變?yōu)樘於０罚劝彼?，丙氨酸，異亮氨酸，組氨酸或蘇氨酸；236位的纈氨酸突變?yōu)樘K氨酸或絲氨酸后，酶的熱穩(wěn)定性均可提高。三突變酶455M(H57Y、P203E、V236A)的熱穩(wěn)定性比野生型酶提高了19'C，這些突變點(diǎn)申請了專利(池中康裕，etal.,Editor.1993)(注鐘淵對氨基酸序列的編號與其他文獻(xiàn)不同，不計(jì)入第一位的甲硫氨酸，因此這3個(gè)突變點(diǎn)對應(yīng)后面的58，204禾卩237位氨基酸殘基)。Giuliano等將來源于^gra6ac/e〃'wwmwe/oderaNRRLB11291來源的DCase的243，250，279位的半胱氨酸殘基定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)243和279位突變?yōu)楸彼岷?，酶穩(wěn)定性可以提高6倍，這些突變申請了歐美日等國專利(Giuliano,G.,etal.，1995，EniricercheSpa(Enie).p.677584-Bl)。韓國Hak-SungKim實(shí)驗(yàn)室則通過DNA混組技術(shù)，提高了來源于^gra^"m'wwftwe/ac/eraNRRLB11291的DCase的熱穩(wěn)定性和抗氧化能力。研究表明四個(gè)點(diǎn)突變(Q23L、H58Y、M184L和T262A)導(dǎo)致酶的熱穩(wěn)定性和抗氧化性都增強(qiáng)，其中T262A表現(xiàn)出最強(qiáng)的影響力(Oh,K.H.，etal.,BiotechnolProg,2002.18(3):p.413-7.;Oh,K.H"etal"ProteinEng,2002.15(8):p.689-95.)。許禎等從一株能將DL-對羥基苯海因轉(zhuǎn)化為D-對羥基苯甘氨酸的菌株(皮氏羅雷斯頓菌CGMCC1596)中，克隆出DCase基因，Genebank登陸號為:AF320814(許禎等，生物工程學(xué)報(bào)，2002，18(2):149-54)。在將DCase基因構(gòu)建入pET表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞過量表達(dá)后，對目的蛋白的活性和SDS-PAGE進(jìn)行分析，結(jié)果顯示大腸桿菌可以大量表達(dá)出重組蛋白，但是70-80%左右的重組蛋白是以包涵體的形式存在。姜世民等利用一種蛋白質(zhì)可溶性監(jiān)測系統(tǒng)(W.ChristianWigleyetc.2001NatureBiotechnology19,131-136)檢測重組蛋白的可溶性，通過隨機(jī)突變，獲得了3個(gè)重組蛋白可溶性表達(dá)增加的突變體，分別為A18T，Y30N和K34E(Jiang，S.,etal.，BiochemJ,2007.402(3):p.429-37)。然而，雖然這三個(gè)突變體的蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)得到了很大的提高，其熱穩(wěn)定性仍然沒有得到提高。但運(yùn)用分子定向進(jìn)化技術(shù)比如易錯(cuò)PCR技術(shù)(error-pronePCR)，DNA改組(DNAshuffling)技術(shù)和定點(diǎn)突變技術(shù)等對微生物來源的酶進(jìn)行分子改性和人工進(jìn)化在近些年中取得了令人矚目的進(jìn)展，使進(jìn)一步改善該3個(gè)重組蛋白可溶性表達(dá)增加的突變體，使其熱穩(wěn)定性的性狀得以改善成為可能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的首要目的就在于通過定向進(jìn)化技術(shù)對目的基因進(jìn)行隨機(jī)突變，并用高通量的篩選方法，獲得熱穩(wěn)定性提高的D-氨甲酰水解酶突變體。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供D-氨甲酰水解酶突變體的DNA序列。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種重組表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一種基因工程菌。本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供所述D-氨甲酰水解酶突變體在D-對羥基苯甘氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明的第六個(gè)目的在于提供所述D-氨甲酰水解酶突變體的編碼基因在D-對羥基苯甘氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明的第七個(gè)目的在于提供所述重組表達(dá)質(zhì)粒在D-對羥基苯甘氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明的第八個(gè)目的在于提供所述基因工程菌在D-對羥基苯甘氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明使用易錯(cuò)PCR技術(shù)，以可溶性表達(dá)得到提高的三突變DCase基因作為出發(fā)基因，進(jìn)行隨機(jī)突變。D-氨甲酰水解酶的Genebank登陸號為AF320814，由304個(gè)氨基酸組成，其編碼DNA序列包括915bp。本發(fā)明將反應(yīng)使體系的pH升高引起指示劑顏色變化作為篩選指標(biāo)將正突變檢出。氨甲酰水解酶催化反應(yīng)后，使反應(yīng)體系的pH得到提高，而該方法使用的酚紅指示劑能在pH大于6.3時(shí)由黃色變?yōu)榧t色。通過上述方法，本發(fā)明人篩選得到了數(shù)個(gè)重組蛋白熱穩(wěn)定性提高的突變體，所獲得的突變體與出發(fā)基因的區(qū)別分別為-1、D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第12位的谷氨酰胺突變?yōu)榉菢O性氨基酸；2、D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第263位的蘇氨酸突變?yōu)榧琢虬彼幔?、D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第263位的蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸；4、D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第12位的谷氨酰胺突變?yōu)樘K氨酸，且第263位的蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸。根據(jù)本發(fā)明，所述非極性氨基酸為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。根據(jù)本發(fā)明，所述D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列與SEQIDN0.2所示的D-氨甲酰水解酶-M3序列具有80%以上的同源性，優(yōu)選的是與SEQIDN0.2所示的D-氨甲酰水解酶-M3序列具有卯％以上的同源性，更優(yōu)選的是與SEQIDN0.2所示的D-氨甲酰水解酶-M3序列具有95%以上的同源性，更優(yōu)選的是與SEQIDN0.2所示的D-氨甲酰水解酶-M3序列具有98%以上的同源性，最好的是具有SEQIDN0.2所示的D-氨甲酰水解酶-M3序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的突變體在67度保溫10min后，其剩余活力比出發(fā)基因編碼的DCase-M3均上升，熱穩(wěn)定性得到了顯著提高，表明采用定向進(jìn)化技術(shù)改造工業(yè)用酶是一個(gè)十分有效的手段。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。DCaseGenebank登陸號為AF320814,由304個(gè)氨基酸組成，其編碼DNA序列包括915bp。以下實(shí)施例中，所使用的三突變體出發(fā)基因——DCase-M3基因，是指可溶性表達(dá)得到提高的三突變DCase基因，其序列及編碼的氨基酸序列分別如SEQIDNO:l和2所示，其與該DCase基因的區(qū)別分別為1、A18T的第18位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸，相對應(yīng)地，其編碼DNA序列中52—54bp的GCG變?yōu)锳CG;2、Y30N的第30位的氨基酸由酪氨酸突變?yōu)樘於０?，相對?yīng)地，其編碼DNA序列中88—90bp的TAC變?yōu)锳AC;3、K34E的第34位的氨基酸由賴氨酸突變?yōu)楣劝彼?，相對?yīng)地，其編碼DNA序列中100—102bp的AAA變?yōu)镚AA。實(shí)施例1、DCase-M3基因的克隆1.1、PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)一對引物5,-GCTTTCAGAGTTCCGCGATCA-3，；禾口5'-TATGACACGTCAGATGATACTTGC-3'。以pET28b-Dcase-M3(Jiang，S"etal.,BiochemJ,2007.402(3):p.429-37)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系重蒸水17.75^1，2,5)alPCRbuffer,1^1MgCl2(25mM)，1.5pidNTP(2.5mM),0.5^上述兩條引物，上述模板15ng，2個(gè)單位的Taq酶(上海sangon公司)。PCR條件:94'C變性10min后，94。C變性30sec，58。C退火30sec,72。C延伸50sec，共進(jìn)行30循環(huán)，最后72'C充分延伸10min。1.2、含DCase-M3基因的質(zhì)粒構(gòu)建PCR擴(kuò)增結(jié)束后，先使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電壓為100伏的核苷酸電泳，割膠后，用膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)回收900bp左右的DNA片段，接著按照寶生物公司(網(wǎng)址www.takara.com.cn)2005-2006產(chǎn)品目錄說明書描述的方法，將所獲得的DNA片段和載體pTrc99A(Invitrogen公司，含有氨芐霉素抗性基因)用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物再次進(jìn)行電壓為100伏的核苷酸電泳，回收相應(yīng)大小分別為900bp、4100bp左右的片段和載體，最后將載體和片段按1:3的比例混合后，加入1個(gè)單位的T4連接酶，16。C連接IO小時(shí)以上。連接產(chǎn)物(重組質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐霉素抗生素的LB平板上篩選，挑取重組子，經(jīng)過SawHl和歷m/ni雙酶切和DNA測序驗(yàn)證，其DNA序列及對應(yīng)的氨基酸序列分別如SEQIDNO:l和2所示，證明克隆的基因序列為正確，將其命名為DCase-M3。1.3、表達(dá)DCase-M3的基因工程菌株構(gòu)建用常規(guī)方法(郝福英等編著，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，北京大學(xué)出版社，1998，第12-15頁)將含DCase-M3的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入五.co/iDH10B(Invitrogen公司)，即獲得DCase-M3基因的大腸桿菌表達(dá)菌株。實(shí)施例2、DCase-M3基因的隨機(jī)突變引物對5，-GCTTTCAGAGTTCCGCGATCA-3，；禾口5，-TATGACACGTCAGATGATACTTGC-3'。易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系(50^1):20ng的模板pET28b-Dcase-M3(Jiang，S.,etal.,BiochemJ,2007.402(3):p.429-37)，各30pmo1的一對引物，7mMMgCl2，50mMKC1，10mMTris-HCl(pH8.3)，0.2mMdGTP，0.2mMdATP，lmMdCTP,1mMdTTP,0.05mMMnCl2，和5個(gè)單位的Taq酶(上海sangon公司)。PCR反應(yīng)條件94°C變性10min后，94°C變性30sec，58°C退火30sec，72。C延伸50sec，共進(jìn)行30循環(huán)，最后72r充分延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，先使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電壓為100伏的核苷酸電泳，割膠后，用膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)回收900bp左右的DNA目的片段。以回收純化的DNA片段作為引物，重組質(zhì)粒DCase-M3作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體如下-反應(yīng)體系20ng的DNA模板，引物10^1，2.5mMdNTP8pl，和2個(gè)單位的KOD聚合酶(toyobo公司)。PCR反應(yīng)條件95。C變性8min后，95。C變性45sec,58。C退火45sec,68。C延伸5.5min，共進(jìn)行25循環(huán)，最后68'C充分延伸10min。最終的PCR產(chǎn)物用Dpnl酶于37。C消化l小時(shí)去除DNA模板，后經(jīng)65°C10min處理使DpnI失活，得到了超過2乂104個(gè)克隆的突變體庫。實(shí)施例3、突變體庫的篩選3.1、突變體轉(zhuǎn)化通過電擊方法將實(shí)施例2中構(gòu)建得到的突變體轉(zhuǎn)化到￡.co//DH10B(Invitrogen公司)中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于含氨芐抗生素的LB平板(蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化鈉1%、瓊脂2%)上，37。C培養(yǎng)。3.2、突變體篩選與鑒定菌體生長12h后，挑取單菌落至加入300pl/孔的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，1單菌落/孔，37°C,220rpm搖床培養(yǎng)。2小時(shí)后對菌體進(jìn)行l(wèi)mMIPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)18h。取10(Htl/孔培養(yǎng)后菌液至96孔酶標(biāo)板中，將其整體置于一70"C環(huán)境中，L5h后轉(zhuǎn)放至37'C環(huán)境中復(fù)蘇，復(fù)蘇時(shí)間30min左右。將復(fù)蘇后的菌液與反應(yīng)液(5。/。NCHPG，lmMEDTA，0.01%酚紅，pH6.3)混合于96孔酶標(biāo)板中，置于37'C下反應(yīng)3小時(shí)后觀察，檢出反應(yīng)體系中由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色的突變株。3.3、篩選結(jié)果通過上述篩選步驟，從突變體庫中篩選獲得到了篩選獲得到了2個(gè)重組蛋白穩(wěn)定性提高的突變體，它們分別是Q12L、T263S。3.4、突變體測序經(jīng)對2個(gè)突變體的氨基酸序列和基因序列進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)與出發(fā)基因DCase-M3編碼的D-氨甲酰水解酶相比，分別是2個(gè)位置的氨基酸發(fā)生了變化，相應(yīng)的編碼DNA也發(fā)生了改變，具體如表l所示表1、兩個(gè)DCase突變體的氨基酸序列和基因序列變化結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例4、DCase-M3酶和突變體酶熱穩(wěn)定性的比較4.1、菌體(粗酶)制備分別取實(shí)施例3.2中發(fā)酵培養(yǎng)的菌體各lml，加入1.5ml的離心管中，離心，棄上清。用O.lmM，pH8.0的磷酸鈉緩沖液重懸，于超聲波破碎儀中超聲破碎細(xì)胞，5瓦的功率，超聲5秒后停止，15秒作為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)行15個(gè)循環(huán)后停止。將得到的粗酶液于4。C下12000轉(zhuǎn)/min離心10min。取上清，置于4。C下備用。4.2、粗酶液的熱處理將4.1所得的粗酶液置于65。C水浴中，在放置Omin、10min、30min、60min、卯min后取出，置于冰上備用。4.3、酶促水解反應(yīng)將4.2熱處理過的粗酶液400|il加入40(^1的100mM的N-氨甲酰-D-對羥基苯甘氨酸底物，進(jìn)行水解反應(yīng)。在4(TC的水浴搖床，以150轉(zhuǎn)/分鐘的速度振蕩。反應(yīng)30min后，加入800^1的10%鹽酸中止反應(yīng)。4.4、酶活測定將4.3所述的反應(yīng)物稀釋5倍后，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心5min，取上清進(jìn)行HPLC測定。HPLC測定D-氨甲酰水解酶的方法是以含磷酸2.25mM，磷酸二氫鉀20mM,pH5.0的甲醇與水為流動相，其比例是20:80，流速為1.0ml/min，在210nm處檢測不同含量物質(zhì)以及相同物質(zhì)的不同峰高和保留值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)測定的樣品數(shù)值確定在標(biāo)準(zhǔn)曲線中的位置，從而得到測定樣品酶活的絕對數(shù)值。1U酶活定義為每分鐘產(chǎn)生1微摩爾D-對羥基苯甘氨酸所需的酶量。酶活力的計(jì)算公示AX5X2X0.8X2.5X1000/(167.2X30)，其中A為HPLC測定得到的數(shù)值。剩余酶活力的計(jì)算公示=酶經(jīng)高溫處理后的酶活+酶在零度保溫后的酶活乂100%。4.5、菌體酶活比較酶活測定結(jié)果見表2:表2、經(jīng)過65"C熱處理后DCase-M3酶和突變體酶的酶活情況比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表2結(jié)果可知，突變體酶Q12L和T263S在65'C保溫10min后，其剩余活力為初始酶活的65.6%和62.5%。而出發(fā)基因編碼的酶Dcase-M3在65度保溫10min后，其剩余活力為初始酶活的5%，上述Q12L和T263S兩個(gè)突變體的熱穩(wěn)定性得到了提高。出發(fā)基因編碼的酶DCase-M3，在65'C保溫30min以后酶活力喪失，而突變體酶Q12L和T263S單位菌體的酶活在30min時(shí)達(dá)到0.160U/ml、0.131U/ml，直至卯min酶活仍達(dá)到0.065U/ml、0.052U/ml，2個(gè)突變體酶在熱穩(wěn)定性方面明顯優(yōu)于出發(fā)基因編碼的酶DCase-M3。4.6、DCase-M3在12位點(diǎn)和263位點(diǎn)氨基酸的飽和突變?yōu)榱丝疾?2位點(diǎn)和263位點(diǎn)除亮氨酸和其他氨基酸的突變對其熱穩(wěn)定性的影響，對該兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了飽和突變。其對應(yīng)的堿基突變情況如表3所示。表3、DCasel2位和263位氨基酸飽和突變基因序列變化結(jié)果Gbl12原第12位氨基酸:核苷酸位置谷氨酰胺(Q)，34-36bpThr263原第263位氨基酸蘇氨酸(T)，核苷酸位置787-789bp氨基酸由谷氨酰胺突變?yōu)楹塑账嶙兓被嵊商K氨酸突變?yōu)楹塑账嶙兓疩12A丙氨酸CAA—GCAT263A丙氨酸ACG—GCGQ12V纈氨酸CAA—GTAT263V纈氨酸ACG—GTGQ12L亮氨酸CAA—CTAT263L亮氨酸ACG—TTGQ12I異亮氨酸CAA—ATAT263I異亮氨酸ACG—ATAQ12P脯氨酸CAA—CCAT263P脯氨酸ACG—CCGQ12F苯丙氨酸CAA—TTCT263F苯丙氨酸ACG—TTCQ12W色氨酸CAA—TGGT263W色氨酸ACG—TGGQ12M甲硫氨酸CAA—ATGT263M甲硫氨酸ACG—ATGQ12G甘氨酸CAA—GGAT263G甘氨酸ACG—GGTQ12T蘇氨酸CAA—ACAT263T蘇氨酸—Q12Y酪氨酸CAA—TATT263Y酪氨酸ACG—TACQ12S絲氨酸CAA—TCAT263S絲氨酸ACG—TCGQ12C半胱氨酸CAA—TGTT263C半胱氨酸ACG—TGTQ12N天冬酰胺CAA—AATT263N天冬酰胺ACG—AACQ12Q谷氨酰胺一T263Q谷氨酰胺ACG—CAGQ12K賴氨酸CAA—AAAT263K賴氨酸ACG—AAGQ12H組氨酸CAA—CATT263H組氨酸ACG—CATQ12R精氨酸CAA—CGAT263R精氨酸ACG—AGGQ12D天冬氨酸CAA—GATT263D天冬氨酸ACG—GATQ12E谷氨酸CAA—GAAT263E谷氨酸ACG—GAG124.5、菌體酶活比較對上述飽和突變得到的各種突變體的酶活測定結(jié)果見表4:表4、經(jīng)過67'C、10min熱處理后各突變體酶的酶活情況<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表4結(jié)果可知，第12位的谷氨酰胺Gln在突變?yōu)榉菢O性氨基酸之后，其穩(wěn)定性都得到了不同程度的提高，其中以突變?yōu)榱涟彼釣樽罡?Q12L)，其剩余活力從12.3%上升到47.2%。在將其突變?yōu)闃O性不帶電荷的氨基酸之后，絕大部分突變體表現(xiàn)出與出發(fā)菌株DCase-M3相似的耐熱性能；而將其突變?yōu)闃O性帶電荷的4種氨基酸之后，其耐熱性能都下降了。此結(jié)果表明第12位的非極性氨基酸有利于該蛋白的熱穩(wěn)定性，而極性帶電荷的氨基酸起了相反的效果。另外，對于第263位的蘇氨酸來說，在突變?yōu)椴粠щ姾傻募琢虬彼岷徒z氨酸后，其穩(wěn)定性得到了最大程度的提高，熱穩(wěn)定性較出發(fā)菌株DCase-M3的12.3%分別上升到26.0%和25.0%。實(shí)施例5、DCase-M3在12位點(diǎn)和263位點(diǎn)氮基酸的同時(shí)突變?yōu)榱丝疾?2位點(diǎn)和263位點(diǎn)同時(shí)突變對熱穩(wěn)定性的影響，對目標(biāo)基因進(jìn)行兼并引物擴(kuò)增，在12位點(diǎn)和263位點(diǎn)同時(shí)引入隨機(jī)突變，生成突變體庫，進(jìn)行篩選。5.1、PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)一對兼并引物5，-TGCAGTGGGACAANNKGGTCCGATCGCG-3';禾口5，-CTTCCAGCGTNNKAGTGAGAGCGACG-3'。其中N表示AGCT，K表示TG。以pET28b-Dcase-M3(Jiang，S"etal.，BiochemJ,2007.402(3):p.429-37)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50^1):20ng的模板，各30pmo1上述兩條引物，1.5mMMgCl2，50mMKC1，10mMTris-HCl(pH8.3)，0.2mMdNTP和2單位的KOD聚合酶(toyobo公司)。PCR反應(yīng)條件94°C變性10min后，94°C變性30sec，58°C退火30sec，72"延伸50sec，共進(jìn)行30循環(huán)，最后72。C充分延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，先使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電壓為IOO伏的核苷酸電泳，割膠后，用膠回收試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)回收卯Obp左右的DNA目的片段。以回收純化的DNA片段作為引物，重組質(zhì)粒DCase-M3作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體如下反應(yīng)體系20ng的DNA模板，引物10^1，2.5mMdNTP8^1，禾B2個(gè)單位的KOD聚合酶(toyobo公司)。PCR反應(yīng)條件95。C變性8min后，95。C變性45sec，58。C退火45sec,68。C延伸5.5min,共進(jìn)行25循環(huán)，最后68'C充分延伸10min。最終的PCR產(chǎn)物用DpnI酶于37'C消化1小時(shí)去除DNA模板，后經(jīng)65°C10min處理使DpnI失活，得到了超過8乂103個(gè)克隆的突變體庫。按實(shí)施例3所述方法進(jìn)行篩選，得到一株比出發(fā)菌熱穩(wěn)定性有明顯提高的突變株All,并按實(shí)施例4所述方法對其酶活力進(jìn)行測定，具體見表5:表5、DCase-M3在12位點(diǎn)和263位點(diǎn)氨基酸的同時(shí)突變樣品核苷酸位置核苷酸變化氨基酸位置氨基酸變化68度處理10分鐘剩余活力％出發(fā)菌DCase-M37.14±1.2雙突變體All34-36bp787-789bpCAA—ACTACG—AGT12263谷氨酰胺一蘇氨酸蘇氨酸一絲氨酸33.15±2.85由表5結(jié)果可知，DCase-M3在12位點(diǎn)和263位點(diǎn)氨基酸的同時(shí)突變后，其熱穩(wěn)定性比出發(fā)菌株DCase-M3有很大程度的提高。本發(fā)明用定向進(jìn)化技術(shù)改造DCase-M3，通過篩選手段，獲得熱穩(wěn)定性得到提高的突變體，表明采用定向進(jìn)化技術(shù)改造工業(yè)用酶是一個(gè)十分有效的手段。雖然以上篩選獲得的穩(wěn)定性獲得提高的突變體是以DCase-M3為出發(fā)基因的，但是從篩選獲得的突變體來看，其關(guān)鍵位點(diǎn)在于DCase-M3的第12位和263位氨基酸，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，根據(jù)本說明書的提示，采用與本發(fā)明的出發(fā)基因具有較高同源性的其它基因，例如同源性達(dá)到80%，優(yōu)選的是卯％，更好的是95%,最好的是98%以上的其它基因，同樣可以獲得穩(wěn)定性得到提高的突變體，這是顯而易見的，因此同樣應(yīng)當(dāng)包括在本申請的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院〈120〉D-氨甲酰水解酶的突變體及其應(yīng)用〈130〉P5071095〈160〉2<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1<211〉915<212〉腿〈213〉Ralstoniapickettii〈220〉<221〉CDS〈222〉(1)..(915)<400〉MetThr11cgtcagatgatacttgcagtgggacaacaaggtArgGinMetlieLeuAlaValGlyGinGinGly510ccgategcgProlieAla1548cgcacggagacacgcgaacaggtcgtcgttcgtcttetcArgThrGluThrArgGluGinValValValArgLeuLeu2025aacatgctgAsnMetLeu3096acggaagccgcgageeggggcgcgaatttcattgtcttccccgaaetcThrGluAlaAlaSerArgGlyAlaAsnPhelieValPheProGluLeu354045144gcgcttacgaccttcttcccgcgctggcatttcaccgacgaggccgagAlaLeuThrThrPhePheProArgTrpHisPheThrAspGluAlaGlu505560192etcgatagettctatgagaccgaaatgcccggcccggtgUuAspSerPheTyrGluThrGluMetProGlyProVal657075gtccgtccaValArgPro8024016etctttLeuPheg3gGlu卿LysgccAla85gcgAlagaaetcGluLeugggGlyatelie90ggcttcGlyPhe幼tctgggcAsnLeuGly95tacTyr288getgaaetcgtcgtcgaaggcggcgtcaagcgtcgcttcaacacgtecAlaGluLeuValValGluGlyGlyValLysArgArgPheAsnThrSer100105110336attttggtggataagteaggcaagategtcggcaagtatcgtaagatelieLeuValAspLysSerGlyLyslieValGlyLysTyrArgLyslie115120125384catttgHisLeu130ccgProggtGlyC3CHis鄉(xiāng)Lysg3gt3CGluTyr135gagGlugccAlataceggTyrArg140ccgttccagcatProPheGinHis432cttgaaLeuGlu145鄉(xiāng)LyscgtArgtatTyrttcPhe150gagccgGluProggcGlygatAspetcggcLeuGly155ttcccggtcPheProVsltatTyr160480gacgtcAspValgacAspgccAlagcgAla165LysatggggMetGlyatgMetttcPhe170atetgclieCysaacgatcgcAsnAspArg175cgcArg528tggcctgaagcctggegggtgatgggcetcaggggcgccgagateateTrpProGluAlaTrpArgValMetGlyLeuArgGlyAlaGlulielie180185190576tgcggcCysGlyggcGly195tacTyr朋cAsnacgThrccgaccProThr200ceicHisAsnccccctProProgttccccagValProGin205C3CHis624ga_cC3CAspHis210ctgLeuacgThrtecSerttcPhecaccatHisHis215etcLeuetaLeutegatgSerMet220caggccgggGinAlaGlytctSer672tatcagTyrGin225AsngggGlygccAlatggTrp230tecgcgSerAlagccAlagcgAlaggcaagGlyLys235gtgggcatgValGlyMetGlu240720g￡LgELEICGluAsntgcCysatgMetctgLeu245etcLeuggccacGlyHistecSertgcCys250ategtglieValgCgCCgEICCAlaProThr255gggGly768gsaateGluliegccgtcAlaValttcaagPheLys290tgagtcValgatAsp275cagGingetetcactacgacgctggaagacgaggtgateaccgccAlaLeuThrThrThrLeuGluAspGluVallieThrAla260265270etcgatcgctgcegggaactgcgtgaacacatettcaacLeuAspArgCysArgGluLeuArgGluHisliePheAsn280285catcgtcagccccagcactatggtctgategcggaaetcHisArgGinProGinHisTyrGlyLeulieAlaGluLeu295300〈210〉2〈211〉304〈212〉PRT〈213〉Ralstoniapickettii〈400〉2MetThrArgGinMetlieLeuAlaValGlyGinGinGlyProlieAla151015ArgThrGluThrArgGluGinValValValArgLeuLeuAsnMetLeu202530ThrGluAlaAlaSerArgGlyAlaAsnPhelieValPheProGluLeu354045AlaLeuThrThrPhePheProArgTrpHisPheThrAspGluAlaGlu505560LeuAspSerPheTyrGluThrGluMetProGlyProValValArgPro65707580LeuPheGluLysAlaAlaGluLeuGlylieGlyPheAsnLeuGlyTyr859095AlaGluLeuValValGluGlyGlyValLysArgArgPheAsnThrSer100105110lieLeuValAspLysSerGlyLyslieValGlyLysTyrArgLyslie115120125816864912915HisLeuProGlyHisLysGluTyrGluAlaTyrArgProPheGinHis130135140LeuGluLysArgTyrPheGluProGlyAspLeuGlyPheProValTyr145150155160AspValAspAlaAlaLysMetGlyMetPhelieCysAsnAspArgArg165170175TrpProGluAlaTrpArgValMetGlyLeuArgGlyAlaGlulielie180185190CysGlyGlyTyrAsnThrProThrHisAsnProProValProGinHis195200205AspHisLeuThrSerPheHisHisLeuLeuSerMetGinAlaGlySer210215220TyrGinAsnGlyAlaTrpSerAlaAlaAlaGlyLysValGlyMetGlu225230235240GluAsnCysMetLeuLeuGlyHisSerCyslieValAlaProThrGly245250255GlulieValAlaLeuThrThrThrLeuGluAspGluVallieThrAla260265270AlaValAspLeuAspArgCysArgGluLeuArgGluHisliePheAsn275280285PheLysGinHisArgGinProGinHisTyrGlyLeulieAlaGluLeu29029530019權(quán)利要求1、一種D-氨甲酰水解酶的突變體，其特征在于，具有以下任一項(xiàng)所述的氨基酸序列AD-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第12位的谷氨酰胺突變?yōu)榉菢O性氨基酸；BD-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第263位的蘇氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?；CD-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第263位的蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸；DD-氨甲酰水解酶的氨基酸序列中第12位的谷氨酰胺突變?yōu)樘K氨酸，且第263位的蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸。2、如權(quán)利要求l所述的D-氨甲酰水解酶突變體，其特征在于，所述非極性氨基酸為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。3、如權(quán)利要求l所述的D-氨甲酰水解酶突變體，其特征在于，所述D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列與SEQIDN0.2所示的D-氨甲酰水解酶-M3序列具有80%以上的同源性。4、如權(quán)利要求l所述的D-氨甲酰水解酶突變體，其特征在于，所述D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列與SEQIDN0.2所示的D-氨甲酰水解酶-M3序列具有90%以上的同源性。5、如權(quán)利要求l所述的D-氨甲酰水解酶突變體，其特征在于，所述D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列與SEQIDN0.2所示的D-氨甲酰水解酶-M3序列具有95%以上的同源性。6、如權(quán)利要求l所述的D-氨甲酰水解酶突變體，其特征在于，所述D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列與SEQIDN0.2所示的D-氨甲酰水解酶-M3序列具有98%以上的同源性。7、如權(quán)利要求l所述的D-氨甲酰水解酶突變體，其特征在于，所述D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列為SEQIDN0.2所示的D-氨甲酰水解酶-M3序列。8、一種編碼權(quán)利要求l一7中任一項(xiàng)所述的D-氨甲酰水解酶突變體的DNA序列。9、如權(quán)利要求8所述的DNA序列，其特征在于，具有以下任一項(xiàng)所述的DNA序列A、SEQIDNO.l所示的D-氨甲酰水解酶-M3的基因序列中第34-36bp的CAA突變?yōu)镚TA、CTA、ATA、TTC或TGG;B、SEQIDNO.l所示的D-氨甲酰水解酶-M3的基因序列中第787-789bp的ACG突變?yōu)锳TG;C、SEQIDNO.l所示的D-氨甲酰水解酶-M3的基因序列中第787-789bp的ACG突變?yōu)門CG;D:SEQIDNO.l所示的D-氨甲酰水解酶-M3的基因序列中第34-36bp的CAA突變?yōu)锳CT，且第787-789bp的ACG突變?yōu)锳GT。10、如權(quán)利要求8所述的D-氨甲酰水解酶突變體的DNA序列，其特征在于，所述D-氨甲酰水解酶-M3的基因序列中第52-54bp為ACG，第88-90bp為AAC，且第100-102bp為GAA。11、一種重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)?？寺∮腥鐧?quán)利要求1所述的D-氨甲酰水解酶的突變體的編碼序列。12、一種基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是將權(quán)利要求11所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞而獲得。13、如權(quán)利要求12所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。14、如權(quán)利要求13所述的基因工程菌，其特征在于，所述大腸桿菌是大腸桿菌Eco/z'D腦B。15、如權(quán)利要求1—7中任一項(xiàng)所述的D-氨甲酰水解酶突變體在D-對羥基苯甘氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。16、如權(quán)利要求8所述的D-氨甲酰水解酶突變體的編碼基因在D-對羥基苯甘氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。17、如權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其特征在于，將如權(quán)利要求8所述的DNA序列克隆入宿主細(xì)胞，并將該宿主細(xì)胞的發(fā)酵菌體用于D-對羥基苯甘氨酸的生產(chǎn)。18、如權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。19、如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其特征在于，所述大腸桿菌是大腸桿菌DH10B。20、如權(quán)利要求11所述的重組質(zhì)粒在D-對羥基苯甘氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。21、如權(quán)利要求12所述的基因工程菌在D-對羥基苯甘氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了D-氨甲酰水解酶的突變體及其在生產(chǎn)D-對羥基苯甘氨酸中的應(yīng)用。通過定向進(jìn)化技術(shù)獲得的一個(gè)突變體在D-氨甲酰水解酶的第12位的谷氨酰胺突變?yōu)榉菢O性氨基酸，另一突變體在D-氨甲酰水解酶的第263位的蘇氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?，第三個(gè)突變體在D-氨甲酰水解酶的第263位的蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸，第四個(gè)突變體在D-氨甲酰水解酶的第12位的谷氨酰胺突變?yōu)樘K氨酸，且第263位的蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸。所述突變體酶在D-對羥基苯甘氨酸的生產(chǎn)中表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性和酶活力，表明采用定向進(jìn)化技術(shù)改造工業(yè)用酶是一個(gè)十分有效的手段。文檔編號C12N15/63GK101544969SQ20081003506公開日2009年9月30日申請日期2008年3月25日優(yōu)先權(quán)日2008年3月25日發(fā)明者宏余,姜衛(wèi)紅,張大龍,鍵李,晟楊,楊蘊(yùn)劉申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院