專利名稱：一種細(xì)胞因子cDNA重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞因子cDNA 重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
原發(fā)性胃癌為我國(guó)高發(fā)的惡性腫瘤。在胃癌治療歷史上，手術(shù)切除是主要手
段，但術(shù)后常復(fù)發(fā)。胃癌晚期(m期)患者，常缺乏有效的延長(zhǎng)病人生命的治療方 法。若這些胃癌患者經(jīng)一些有效的輔助治療措施使胃癌腫瘤縮小后，再行切除， 有可能使胃癌治療有一個(gè)突破。
90年代新興的腫瘤基因治療已成為腫瘤生物治療的重要措施之一，并被譽(yù) 為繼手術(shù)、化療和放療之后的另一種具有潛在前途的治療方法。近年來(lái)腫瘤基因
治療的研究無(wú)論從深度上還是廣度上都取得了很大進(jìn)展。在獲得美國(guó)重組DNA 咨詢委員會(huì)(RAC)、 NIH專家委員會(huì)和FDA批準(zhǔn)的基因治療臨床試驗(yàn)方案中，以 腫瘤為最多，充分顯示基因治療在腫瘤研究中的迫切性。目前所開(kāi)展的腫瘤基因 治療中，以腫瘤免疫基因治療的研究為最多。腫瘤細(xì)胞耙向的細(xì)胞因子基因治療 是以主動(dòng)免疫治療為基礎(chǔ)，即將細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中，以制備出免疫 原性更強(qiáng)的新型瘤苗，并由于細(xì)胞因子的持續(xù)分泌，從而激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免 疫反應(yīng)，達(dá)到治療腫瘤的目的。研究表明，細(xì)胞因子基因治療不僅在一定程度上 克服了以往臨床直接應(yīng)用細(xì)胞因子需反復(fù)多次且副作用明顯的缺點(diǎn)，而且也取得 了直接應(yīng)用所不具有的療效。
白細(xì)胞介素-2是由活化T細(xì)胞所分泌的一種細(xì)胞因子，具有刺激多種免疫 效應(yīng)細(xì)胞活化的作用，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。在腫瘤免疫 中起到重要作用。十多年前已開(kāi)始將重組白細(xì)胞介素-2應(yīng)用于臨床惡性腫瘤病 人。這種白細(xì)胞介素-2的系統(tǒng)性應(yīng)用在黑色素瘤及其它一些腫瘤病人中取得一 定的效果，報(bào)道有效率為15 20%。這種療法主要是基于白細(xì)胞介素-2可使T細(xì)胞活化，從而有助于殺傷腫瘤細(xì)胞。然而由于白細(xì)胞介素-2在血液中的半衰期 較短，而反復(fù)多次大劑量的應(yīng)用又產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，因而限制了白細(xì)胞介素 -2的臨床應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種細(xì)胞因子cDNA重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法，為癌 癥的治療提供了一種新的治療途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種細(xì)胞因子cDNA重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法。包括 mRNA的抽提及cDNA的合成、PCR擴(kuò)增IL-2基因、IL-2 cDNA的克隆、 含IL-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的組建。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種含信號(hào)肽的白細(xì)胞介素-2 cDNA。 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種含IL-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的組建方法。


無(wú)。
具體實(shí)施例方式
第一步含信號(hào)肽的白細(xì)胞介素-2 cDNA的制備。
1. PHA剌激的人外周血細(xì)胞人外周血用淋巴細(xì)胞分離液分離出單 個(gè)核細(xì)胞，共約lxl(^細(xì)胞，經(jīng)植物血凝素(PHA)l(Vg/ml剌激30小時(shí)， 使細(xì)胞因子基因表達(dá)，以備抽提mRNA。
2. mRNA的抽提及cDNA的合成
(1) mRNA的抽提離心收集細(xì)胞，懸浮于1.5mlRNA抽提緩沖液， 用注射器反復(fù)抽打勻漿細(xì)胞，然后再補(bǔ)加3ml抽提緩沖液，充分混合，離 心1000 cpm5分鐘，收集上清。取Oligo (dT)-Cellulose Spun Column,混 合內(nèi)容物，350g離心兩分鐘，棄去柱內(nèi)液體，取4ml上清上柱，混勻，棄 去液體。然后用高鹽緩沖液洗三遍，低鹽緩沖液洗二遍，最后用經(jīng)65°C預(yù) 熱的洗脫緩沖液洗脫三次，每次用0.25ml，收集洗脫液，然后乙醇沉淀 poly(A)十RNA(mRNA)。(2)cDNA的合成將mRNA溶于20nl ddH20中，65°C10分鐘，置于 冰上備用。在第一條鏈反應(yīng)混合液內(nèi)加入lmlDTT和熱變性的RNA， 37 。C保溫1小時(shí)，再將此反應(yīng)液加入第二條鏈反應(yīng)混合液中，12°C和22" 各保溫1小時(shí)，最后加lpl Klenow酶，37°C 30分鐘，65°C10分鐘后再 用酚和氯仿抽提，經(jīng)Sephacryl S-300柱純化后-20匸保存。
2. PCR擴(kuò)增IL-2基因取制備好的PBLcDNA10pl，加入5'和3'擴(kuò) 增引物各lpl( 30pmo1)、 IOX反應(yīng)緩沖液5^1、 dNTP4pl、加水至50|iil， 94°C 5分鐘變性，力卩Pfu酶1U(2.5U)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng).(94。C 45"、 55TM5"、 72'C1'20")。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物用等體積苯酚/氯仿抽提一 次，乙醇沉淀。
3. IL-2 cDNA的克隆為了鑒定PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性，須先將產(chǎn)物克 隆入pUC18或pBluescriptDNA， 經(jīng)DNA序列測(cè)定確認(rèn)為IL-2 cDNA無(wú) 誤后再將這一片段回收，并與表達(dá)載體重組。故將PCR產(chǎn)物溶于TE，用 適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶水解后，與用同樣酶水解過(guò)的載體DNA重組，轉(zhuǎn)化 TG1后涂于LB/AP平板，37t:培養(yǎng)過(guò)夜。
4. 質(zhì)粒DNA小量抽提將一個(gè)單菌落接入含AP(50iag/ml)的3ml LB 中，37。C培養(yǎng)過(guò)夜。將菌液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，5000rpm離心2分鐘， 沉淀菌體。用lOOial溶液I懸浮菌體，再加200lal溶液II ，溫和顛倒混勻， 置于冰上，待溶液澄清后，加入150^1溶液m，充分混勻。15000rpm 10 分鐘離心，收集上清，用等體積苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，加2.5倍乙 醇混勻，沉淀。離心15000rpm 10分鐘，將沉淀用70%乙醇洗一次，水 泵抽干，最后溶于20^ilTE，用200pg/mlRNase處理1小時(shí)，-20°<:存放。
5. 質(zhì)粒DNA的大量抽提
(1) 接種培養(yǎng)將一個(gè)單菌落接種于3mlLB(含AP)中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)晚期 (OD600"0.6)，取500|nl接種入50ml含抗菌素的LB中，同樣培養(yǎng)至對(duì)數(shù) 晚期，再取15ml接種入含相應(yīng)抗菌素的1.5LLB中，培養(yǎng)過(guò)夜。
(2) 質(zhì)粒抽提將1.5L培養(yǎng)物離心5500rpml0分鐘，收集菌體。用吸 水紙將離心管壁上殘余液體擦干。將菌體懸浮于30ml溶液I中，置室溫中 IO分鐘。加液-體II60ml，混合均勻后置冰上10分鐘。加溶液IIl45ml，置冰浴IO分鐘后，15000rpm離心IO分鐘。紗布過(guò)濾后取上清，加等體積異 丙醇沉淀，15000rpm離心10分鐘，用70%乙醇洗一次，真空干燥。將沉 淀溶于20mlTE，加入等體積5M LiCl沉淀大分子RNA，在水浴中放置 IO分鐘，4°Cl5,000rpm離心10分鐘，取上清，用等體積異丙醇沉淀。離 心，干燥，溶于5mlTE，加入RNase至200叫/ml， 37°C 30分鐘。加等體 積13%PEG(8000)/1.6M NaCl沉淀DNA，冰浴放30分鐘。離心沉淀，干 燥后用TE5ml溶解，用苯酚、苯酚/氯仿/異戊醇、氯仿/異戊醇各抽提一 次。最后加1/10體積3MNaAc及2倍乙醇沉淀。-20匸保存。用時(shí)再 離心沉淀，溶于TE。
(3) CsCl超離心純化DNA: 如上述堿法抽提的DNA，經(jīng)LiCl純 化后，用于CsCl超速離心，按lg/ml的用量，加入固體CsCl， 3(TC溶解。 每10mlDNA加入0.8ml溴乙錠溶液(10mg/ml)， CsC溶液的最終密度是 1.55g/ml，折射率1.3860，溴化乙錠濃度約為704^g /ml。室溫8000rpm 5 分鐘，浮在溶液上的是溴化乙錠和蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物。將浮渣下的清亮 溶液用注射器吸入用于超離心的離心管中，用輕石蠟油補(bǔ)滿其余部分，并 封口。 45000轉(zhuǎn)/分離心24 48小時(shí)(2(TC)。離心完畢，在普通光照下可 見(jiàn)兩條DNA區(qū)帶，下部區(qū)帶由閉環(huán)質(zhì)粒DNA組成，用針頭插入此帶， 吸出至1.5ml管中，用等體積的經(jīng)水飽和的正丁醇反復(fù)抽提,直至粉紅色從 水相和有機(jī)相中消失。將水相加3倍TE稀釋，加2.5倍無(wú)水乙醇沉淀。離 心后用70%乙醇洗一次，抽干后溶于TE， -2(TC保存。
6. 限制性內(nèi)切酶反應(yīng)根據(jù)不同的限制性內(nèi)切酶選擇相匹配的緩沖 液。 一般取0.5 lpg DNA，限制性內(nèi)切酶 5U，反應(yīng)體積20jil， 37°C 保溫1 2小時(shí)，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙錠0.5 l叫/ml)鑒定 酶切結(jié)果。
7. 凍融法回收酶切片段在紫外燈下將DNA片段從瓊脂糖凝膠中切 下來(lái)，加入100nlTE，在干冰乙醇內(nèi)凍結(jié)后置37°C15分鐘，反復(fù)三次， 15000rpm離心10分鐘后吸出上清，加入1/10體積NaAc和2倍體積乙醇 沉淀，離心收集，沉淀經(jīng)水泵抽干后，溶于TE，即可進(jìn)行連接反應(yīng)。
8. DNA連接將等克分子數(shù)的待連接DNA混合，加入5XT4連接酶緩沖液4ixl，加水至20pl，加入T4DNA連接酶2U， 12。C連接過(guò)夜，即可 用于轉(zhuǎn)化。
9. 重組DNA的轉(zhuǎn)化
(1) 感受態(tài)細(xì)胞制備將培養(yǎng)過(guò)夜的受體菌250)al接種于50plLB中， 37°C1.5 3小時(shí)至對(duì)數(shù)中期，菌液置冰浴IO分鐘，5000rpm離心5分鐘， 沉淀菌體用1/2體積經(jīng)預(yù)冷的100mM MgCl2懸浮，冰浴20分鐘，4°C 5000rpm離心5分鐘，將菌體懸浮于1/15 1/10體積的100mM CaCl2中， 冰浴中放60分鐘，即可用于轉(zhuǎn)化。
(2) 重組DNA的轉(zhuǎn)化將連接過(guò)夜的DNA加入lO(Hil感受態(tài)細(xì)胞， 混勻，冰浴中放置40分鐘，間或輕輕混勻，42'C2分鐘，涂布于含抗菌素 的LB平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。
10. 雙鏈DNA測(cè)序
(1) 雙鏈變性樣品DNA約1.5-2叫，溶于8pl ddH20，加2M NaOH 2pl， 置室溫'10分鐘，力卩3^1 3M NaAc中和，再加7plddH20后，力n 60pl乙醇 沉淀，離心15000rpm IO分鐘，抽干后溶于10nlddH2O。
(2) 退火反應(yīng)10pl變性模板，加2pl引物，2pl退火緩沖液，65°C， 5分鐘，緩慢冷卻至室溫。
(3) 延伸反應(yīng)將退火后的反應(yīng)液加入lplddH20標(biāo)記混合物3pl、 T7聚合酶2pl(3U)、和0.5^1同位素(a-32p)標(biāo)記的dATP，室溫反應(yīng)5分鐘。
(4) 終止反應(yīng)取上述反應(yīng)液4.5^1至預(yù)先分裝好的4管分別標(biāo)記有 G、 A、 T、 C的終止混合物中(各2.5^11)，混勻，37°C 5分鐘，加5|xl終止 液。在電泳上樣前樣品置75 80。C2分鐘變性。
第二步含IL-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的組建。
將pLXSN用EcoRI和BamHI酶切，與經(jīng)同樣酶切的IL-2相連接，重組載 體經(jīng)酶切鑒定后含有正確的插入片段，命名為L(zhǎng)(IL-2)SN。
實(shí)施例1
mRNA的抽提及cDNA的合成 (1) mRNA的抽提離心收集細(xì)胞，懸浮于1.5mlRNA抽提緩沖液，用注射器反復(fù)抽打勻漿細(xì)胞，然后再補(bǔ)加3ml抽提緩沖液，充分混合，離 心1000 cpm5分鐘，收集上清。取Oligo (dT)-Cellulose Spun Column,混 合內(nèi)容物，350g離心兩分鐘，棄去柱內(nèi)液體，取4ml上清上柱，混勻，棄 去液體。然后用高鹽緩沖液洗三遍，低鹽緩沖液洗二遍，最后用經(jīng)65°C預(yù) 熱的洗脫緩沖液洗脫三次，每次用0.25ml，收集洗脫液，然后乙醇沉淀 poly(A)十RNA(mRNA)。
(2) cDNA的合成將mRNA溶于ddH20中，65°C 10分鐘，置于 冰上備用。在第一條鏈反應(yīng)混合液內(nèi)加入lmlDTT和熱變性的RNA， 37 'C保溫1小時(shí)，再將此反應(yīng)液加入第二條鏈反應(yīng)混合液中，12°C和22°C 各保溫1小時(shí)，最后加lpl Klenow酶，37°C 30分鐘，65°C10分鐘后再 用酚和氯仿抽提，經(jīng)Sephacryl S-300柱純化后-20。C保存。
實(shí)施例2 PCR擴(kuò)增IL-2基因 取制備好的PBLcDNAlO)til，加入5'和3'擴(kuò)增引物各lpl( 30pmo1)、 IOX反應(yīng)緩沖液5^1、 dNTP4pl、加水至50|al， 94°C 5分鐘變性，力卩Pfu 酶1U(2.5U)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng).(94。C 45"、 55。C45"、 72。Cl'20")。反 應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物用等體積苯酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀。
權(quán)利要求
1.細(xì)胞因子cDNA重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，該反轉(zhuǎn)錄病毒載體cDNA為含信號(hào)肽的白細(xì)胞介素-2 cDNA。
2. 如權(quán)利要求1所述，其特征在于，該病毒載體為缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LXSN。
3. 如權(quán)利要求l所述，其特征在于，含信號(hào)肽的白細(xì)胞介素-2 cDNA有如下步 驟得到從人外周血分離得到單核細(xì)胞，經(jīng)植物血凝素(PHA)刺激36小時(shí)后抽提總 mRNA。在體外合成cDNA，并以此為模板，使用含相應(yīng)內(nèi)切酶位點(diǎn)的白細(xì)胞介 素-2上下游引物，以PCR技術(shù)擴(kuò)增出含信號(hào)肽的IL-2 cDNA。
4. 如權(quán)利要求1所述，其特征在于，該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以用于制備治療用逆 轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種細(xì)胞因子cDNA重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法。從經(jīng)PHA誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞中抽提mRNA，在體外合成cDNA，運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)克隆了含有信號(hào)肽的白細(xì)胞介素-2 cDNA，并與缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LXSN進(jìn)行重組，構(gòu)建了含白細(xì)胞介素-2 cDNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體L(IL-2)SN。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101555488SQ20081003569
公開(kāi)日2009年10月14日 申請(qǐng)日期2008年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月7日
發(fā)明者錢關(guān)祥, 陳詩(shī)書 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院;上海新生源醫(yī)藥研究有限公司