專利名稱：一種采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白酶的提純領(lǐng)域，特別是涉及一種采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法。
背景技術(shù)：
木瓜蛋白酶(Papain)簡(jiǎn)稱木瓜酶，又稱為木瓜酵素，酶學(xué)編號(hào)EC3.4.22.2，是利用未成 熟的番木瓜果實(shí)中的乳汁，采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)提煉而成的純天然生物酶制品，它是一 類(lèi)含巰基( SH)蛋白酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，其廣泛的特異性對(duì)動(dòng)植物蛋白、多肽、 酯、酰胺等有較強(qiáng)的水解能力，能催化各種蛋白質(zhì)，水解成一系列長(zhǎng)短不一的短肽或氨基 酸，還能把蛋白水解物合成為類(lèi)蛋白質(zhì)，由于它的熱穩(wěn)定性好及天然衛(wèi)生安全等特點(diǎn)，廣 泛應(yīng)用于食品、皮革、紡織、日化和制藥行業(yè)，提高產(chǎn)品質(zhì)量與檔次，降低成本。目前，木瓜蛋白酶的提取純化主要是采用沉淀法，但是這種方法工藝繁瑣，產(chǎn)品中仍 然混有其它的蛋白酶，純度不高，不能達(dá)到制藥工業(yè)的需求。隨著人們對(duì)純度和安全性提 出進(jìn)一步的要求，色譜技術(shù)應(yīng)用于木瓜蛋白酶的純化，如離子交換色譜、親和色譜，該類(lèi) 填料特異性高，純化倍數(shù)高，但分離速度受粒間擴(kuò)散和低的軸向速率限制，壓降大，分離 時(shí)間長(zhǎng)，處理量小，不能使用高的加料速度。而膜分離是一種根據(jù)分子的大小進(jìn)行分離的 技術(shù)，特點(diǎn)是表面積大、擴(kuò)散路徑短、操作壓低、處理量大，但傳統(tǒng)膜分離技術(shù)只有分離 相對(duì)分子質(zhì)量相差I(lǐng)O倍以上的物系，不能滿足生化分離的需要。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，該方 法快速、簡(jiǎn)便、有效、適用于規(guī)?；僮?。本發(fā)明的一種采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，包括(1) 尼龍膜的活化改性尼龍膜先在25。C 1 MHCl中水解24h，然后浸入20 ml甲 醛溶液，加入0.2 ml 85wt。/Q磷酸，于60'C反應(yīng)7h，40 5(TC熱水洗滌，再浸入10ml 1 wt% 2wt。/。的殼聚糖溶液中，室溫反應(yīng)lh后，轉(zhuǎn)入烘箱60 90。C烘干1 h，分別用1.0vo1。/0 5.0 voP/。醋酸和去離子水洗滌；(2) 尼龍膜螯合金屬銅離子將上述尼龍膜浸入40 55ml的環(huán)氧氯丙垸、氫氧化鈉 和硼氫化鈉的混合溶液，室溫反應(yīng)1 3 h，再加入23 ml環(huán)氧氯丙垸和46 m 12M的氫氧化 鈉溶液，60"C恒溫振蕩反應(yīng)8 18h，洗滌后再將膜浸入114.4ml的碳酸鈉、0.14g硼氫化 鈉和86mmo1的偶聯(lián)劑的混合溶液，50 70 。C反應(yīng)10 15 h，浸入500ml 50 150ppm硫酸銅的溶液，反應(yīng)l 3h，得到螯合銅離子的金屬親和膜；(3) 蛋白酶的吸附洗脫將金屬親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，蠕動(dòng)泵送入緩沖液 和洗脫液，以0.05 M pH=8.5的Tris HCl緩沖液平衡15 min，流速2.0ml/min;接著送入 100ml0.25 2.0mg/mlpH值二5.0 10.0的木瓜蛋白酶，其中氯化鈉濃度為0 2.0M，反應(yīng) 10 120min進(jìn)行吸附，然后以Tris HCl緩沖液洗去未吸附上的蛋白質(zhì)，最后以洗脫劑進(jìn) 行洗脫，得到目標(biāo)蛋白質(zhì)木瓜蛋白酶；(4) 測(cè)試酶活性和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算純化倍數(shù)。所述的步驟(1)中殼聚糖溶液是以0.5 vol% 2.0 vol.。/。醋酸溶解。 所述的步驟(2)中環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉與硼氫化鈉的混合溶液中，三者的濃度為l 3M，體積比為0.9 1.1 : 8 11 : 0.003 0.005。所述的步驟(2)中偶聯(lián)劑為亞氨基二乙酸(IDA)，其與碳酸鈉、硼氫化鈉的用量比為0.8 1.0 : 10 12 : 0.001 0.003。所述的步驟(2)中洗滌分別用去離子水和4.0vol。/。 8.0vol。/。的醋酸洗滌。 所述的步驟(3)最佳提取純化條件為反應(yīng)時(shí)間為60min， pH = 8.5,木瓜蛋白酶的吸附濃度為2.0 mg/ml，離子強(qiáng)度為0 M的氯化鈉溶液，即木瓜蛋白酶溶液中不含氯化鈉溶液。所述的步驟(3)中洗脫劑為0.5 1.5M的硫氰酸鈉。 有益效果(1) 本發(fā)明快速、簡(jiǎn)便、有效、適用于規(guī)模化操作。(2) 原料來(lái)源廣泛，純化的蛋白酶的倍數(shù)和酶活性較高；


圖1為不同反應(yīng)時(shí)間的木瓜蛋白酶溶液吸附曲線；圖2為不同pH的木瓜蛋白酶溶液吸附曲線；圖3為不同濃度木瓜蛋白酶溶液的吸附曲線；圖4為不同離子強(qiáng)度的木瓜蛋白酶溶液吸附曲線；圖5為利用金屬親和螯合膜吸附木瓜蛋白酶的洗脫曲線。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定 的范圍。實(shí)施例1尼龍膜的活化和鍵合殼聚糖進(jìn)行改性，具體步驟如下(1) 尼龍膜先在25'C lMHCl中水解24h，然后用甲醛進(jìn)行活化。IO張水解的尼龍 膜浸入20ml甲醛溶液(〉36.5wt.%)，加入0.2 ml磷酸(85wt.%)，于60。C反應(yīng)7h， 40 50。C熱水水洗多次。(2) 將上述甲醛活化的尼龍膜，浸入10ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的殼聚糖溶液(以lvol.% 醋酸溶解)，室溫反應(yīng)lh，然后轉(zhuǎn)入8(TC烘箱，lh后取出，分別用lvol.n/。醋酸和去離子 水洗去未反應(yīng)的殼聚糖。尼龍膜上的殼聚糖含量可按茚三酮的方法進(jìn)行測(cè)試。實(shí)施例2改性后的尼龍膜螯合金屬銅離子，具體步驟如下(1 )上述改性后的10張尼龍膜浸入4.6 ml環(huán)氧氯丙垸、46 ml 2M的氫氧化鈉和0.017 g硼氫化鈉混和液中，室溫反應(yīng)2h后，再直接向混和液加入23ml還氧氯丙烷、46ml2M 的氫氧化鈉，60'C反應(yīng)12h，用去離子水洗多次。(2) 將上述結(jié)合環(huán)丙烷的膜浸入含有10ml 8.6M的亞氨基二乙酸(IDA) 、 0.14g硼 氫化鈉和114.4 ml 2 M的碳酸鈉的混合溶液，60'C恒溫振蕩反應(yīng)12 h，用去離子水、5 vol.% 醋酸和去離子水洗多次。(3) 將上述的膜浸入500ml 100 ppm的硫酸銅溶液，反應(yīng)2h，就可得到螯合銅離子 的金屬膜。實(shí)施例3用金屬螯合膜吸附木瓜蛋白酶，進(jìn)行條件優(yōu)化，具體步驟如下(1) 反應(yīng)時(shí)間的確定。將10張改性尼龍膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動(dòng)泵送入100ml 1.0mg/ml木瓜蛋白酶的Tris HCl溶液(pH二8.5)，流速為2.0ml/min，分別反應(yīng)10min， 20 min, 30min, 40min, 50min， 60min， 80min和100min，進(jìn)行吸附，測(cè)定木瓜蛋白酶 吸附的量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖l，最適的反應(yīng)時(shí)間選擇在60min。(2) 反應(yīng)pH的確定。將10張改性尼龍膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動(dòng)泵送入100ml 不同pH值的1.0 mg/ml木瓜蛋白酶的Tris—HC1溶液，循環(huán)反應(yīng)2 h，流速為2.0 ml/min， 加入木瓜蛋白酶的Tris HCl溶液的pH值分別為5.0， 6.0， 7.0， 8.0， 9.0， IO.O進(jìn)行吸附， 測(cè)定木瓜蛋白酶吸附的量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2，最適的反應(yīng)pH選擇在7.0 8.0。(3) 反應(yīng)起始木瓜蛋白酶溶液濃度的確定。將10張改性尼龍膜上疊成膜堆，放入膜 橋，以蠕動(dòng)泵送入從100ml 0.25 mg/ml到2.0 mg/ml濃度不等的木瓜蛋白酶反應(yīng)液，循環(huán) 反應(yīng)2h，流速為2.0 ml/min，測(cè)定木瓜蛋白酶吸附的量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3，最佳吸附濃度 為2.0mg/ml的木瓜蛋白酶反應(yīng)液。(4) 反應(yīng)離子強(qiáng)度的確定。將10張改性尼龍膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動(dòng)泵送 入含有不同量氯化鈉的100ml 1.0 ppm的木瓜蛋白酶溶液，循環(huán)反應(yīng)2 h，流速為2.0 ml/min，所加入的氯化鈉濃度為0， 0.25， 1.0， 1.5， 2.0M (即離子強(qiáng)度)，測(cè)定木瓜蛋白 酶吸附的量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4，最佳離子強(qiáng)度為OM的氯化鈉溶液(即不含氯化鈉溶液)。實(shí)施例4用l.OM的硫氰酸鈉溶液洗脫吸附木瓜蛋白酶的膜，具體步驟如下 將10張吸附木瓜蛋白酶的膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動(dòng)泵送入l.OM的硫氰酸鈉溶液，流速為2.0 ml/min，進(jìn)行洗脫，測(cè)定木瓜蛋白酶洗脫的量，得到木瓜蛋白酶的活性保留率和洗脫率都在95%以上。實(shí)施例5螯合膜組成膜堆對(duì)木瓜蛋白酶進(jìn)行分離純化包括如下步驟10張上述方法制備的金屬螯合膜上疊成膜堆，作為分離介質(zhì)，放入一種過(guò)濾容器膜橋， 以分離木瓜蛋白酶。以蠕動(dòng)泵送入緩沖液和洗脫液等。首先以0.05MTris—HCl緩沖液(pH 8.5)平衡15min，流速1.0ml/min;接著送樣，35ml的1.0mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，然后 以0.05 MTris HCl緩沖液(pH 8.5)洗去未吸附上的蛋白質(zhì)。最后以0.05MTris—HC1緩沖 液(pH8.0)配制的l.OMNaSCN.進(jìn)行洗脫，得到目標(biāo)蛋白質(zhì)木瓜蛋白酶，其純化倍數(shù)為 10.2。實(shí)施例6精確稱取一定量按上述方法制備的金屬螯合膜，置于0.05M，不同pH值的緩沖液配 制的木瓜蛋白酶溶液中，室溫震蕩不同時(shí)間后，測(cè)量吸附前后蛋白質(zhì)溶液在280nm下的吸 光度，按下式計(jì)算吸附量《=(Ci隱Ct)Ks/mq是吸附在單位膜量上的銅離子量(mg/g); Ci和Ct是吸附前和吸附后硫酸銅溶液的濃 度；VS是硫酸銅溶液的體積；m是反應(yīng)的膜的質(zhì)量。
權(quán)利要求
1. 一種采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，包括(1)尼龍膜的活化改性尼龍膜先在25℃1M HCl中水解24h，然后浸入20ml甲醛溶液，加入0.2ml 85wt.％磷酸，于60℃反應(yīng)7h，40～50℃熱水洗滌，再浸入10ml 1wt％～2wt％的殼聚糖溶液中，室溫反應(yīng)1h后，轉(zhuǎn)入烘箱60～90℃烘干1h，分別用1.0vol％～5.0vol％醋酸和去離子水洗滌；(2)尼龍膜螯合金屬銅離子將上述尼龍膜浸入40～55ml的環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉和硼氫化鈉的混合溶液，室溫反應(yīng)1～3h，再加入23ml環(huán)氧氯丙烷和46ml 2M的氫氧化鈉溶液，60℃恒溫振蕩反應(yīng)8～18h，洗滌后再將膜浸入114.4ml的碳酸鈉、0.14g硼氫化鈉和86mmol的偶聯(lián)劑的混合溶液，50～70℃反應(yīng)10～15h，浸入500ml 50～150ppm硫酸銅的溶液，反應(yīng)1～3h，得到螯合銅離子的金屬親和膜；(3)蛋白酶的吸附洗脫將金屬親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，蠕動(dòng)泵送入緩沖液和洗脫液，以0.05M pH＝8.5的Tris～HCl緩沖液平衡15min，流速2.0ml/min；接著送入100ml0.25～2.0mg/ml pH值＝5.0～10.0的木瓜蛋白酶，其中氯化鈉濃度為0～2.0M，反應(yīng)10～120min進(jìn)行吸附，然后以Tris～HCl緩沖液洗去未吸附上的蛋白質(zhì)，最后以洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到目標(biāo)蛋白質(zhì)木瓜蛋白酶；(4)測(cè)試酶活性和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算純化倍數(shù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在于所述的 步驟(1)中殼聚糖溶液是以0.5 vol.% 2.0 vo"/。醋酸溶解。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在于所述的 步驟(2)中環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉與硼氫化鈉的混合溶液中，三者的濃度為1 3 M，其體積比為0.9 1.1 : 8 11 : 0.003 0.005。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在于所述的步驟(2)中偶聯(lián)劑為亞氨基二乙酸IDA,其與碳酸鈉、硼氫化鈉的用量比為0.8 1.0 : 10 12: 0.001 0.003。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在于所述的 步驟(2)中洗滌分別用去離子水和4.0voiy。 8.0voin/。的醋酸洗滌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的釆用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在于所述的步驟(3)最佳提取純化條件為反應(yīng)時(shí)間為60min， pH=8.5，木瓜蛋白酶的吸附濃度為 2.0mg/ml，離子強(qiáng)度為OM的氯化鈉溶液，即木瓜蛋白酶溶液不含氯化鈉溶液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在于所述的步驟(3)中洗脫劑為0.5 1.5M的硫氰酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，包括(1)尼龍膜經(jīng)甲醛活化和殼聚糖改性；(2)經(jīng)活化改性的尼龍膜與環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉和硼氫化鈉的混合溶液反應(yīng)，再將膜分別浸入碳酸鈉、硼氫化鈉和偶聯(lián)劑的混合溶液和硫酸銅溶液，得到螯合銅離子的金屬親和膜；(3)將金屬親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，蠕動(dòng)泵送入Tris-HCl緩沖液和洗脫液，接著送入木瓜蛋白酶溶液，然后以洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到目標(biāo)產(chǎn)物木瓜蛋白酶；(4)測(cè)試酶活性和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算純化倍數(shù)。該方法快速、簡(jiǎn)便、分離量大，提取的酶活性好，適用于規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/50GK101270351SQ200810036788
公開(kāi)日2008年9月24日 申請(qǐng)日期2008年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月29日
發(fā)明者何智妍, 朱利民, 聶華麗 申請(qǐng)人:東華大學(xué)