專利名稱：一種紅外線輔助蛋白快速酶解方法
技術領域：
本發(fā)明屬蛋白質組學技術領域，具體涉及一種紅外線輔助蛋白快速酶解方法。 背暴技術肽質量指紋圖譜法(Peptide mass fringprint，PMF)是研究蛋白質結構信息和鑒定蛋白 質的常用方法。蛋白質的酶解是蛋白質組學研究中蛋白質分析的一個關鍵步驟，目的是將 蛋白分解成肽段，然后用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)或液相 色譜電噴霧質譜(LC-ESI-MS)分析多肽混合物，獲得肽質量指紋圖譜。由于傳統(tǒng)的溶液 酶解方法耗時(12小時以上)，限制了蛋白質分析速度的提高，建立高效快速的新型蛋白 質酶解方法具有重要意義。目前提高酶解效率的方法主要有固定化酶技術以及微波和超聲波輔助酶解技術等。固 定化酶技術中研究較多的有酶微反應器和磁固定化酶技術。酶微反應器主要是將蛋白水解 酶(如胰蛋白酶)通過溶膠-凝膠包埋和共價鍵合等技術固定在毛細管或微流芯片的微通道 內表面，由于可將高濃度的蛋白水解酶固定在微小的通道內，可使酶解時間大幅縮短。而 磁固定化酶技術是將蛋白水解酶通過共價鍵合等手段固定在磁球表面，使固定有酶的磁球 與蛋白溶液反應生成多肽后，通過磁鐵將磁球分離。該酶解技術需要外加熱源，以促進酶 解。最近釆用微波輔助溶液蛋白酶解已有報道，利用該技術酶解蛋白只需要十幾分鐘。此 外，超聲波也被用于促進蛋白溶液酵解，酶解時間可縮短到數(shù)分鐘。紅外線是一種重要的 電磁波，其波長范圍在750納米到1000微米，在醫(yī)療、電器、化工等諸多領域獲得廣泛 應用。按其波長的不同，可分為近紅外線(0.75-1.5微米)、中紅外線(1.5-5.6微米)和 遠紅外線(波長5.6~1000微米)。然而采用紅外線促進蛋白質酶解尚未見文獻報道。 一次 偶然的機會我們嘗試用紅外線燈泡代替水浴作為能量來源促進蛋白質酶解，意外的發(fā)現(xiàn)在 5分鐘內蛋白已經(jīng)完全酶解，于是開展了深入研究，并設計了紅外線輔助蛋白快速酶解裝 置。本發(fā)明提出的紅外線輔助蛋白酶解技術將蛋白質的酶解時間從傳統(tǒng)溶液酶解的12小 時以上大幅度降低到5到10分鐘，大大節(jié)約了酶解時間，提高了工作效率。由于該技術 僅用紅外線代替?zhèn)鹘y(tǒng)蛋白溶液酶解技術中使用的水浴，設備簡單，紅外線對人體無害，操 作安全，可用于批量蛋白樣品的高通量酶解和鑒定。本發(fā)明提出的紅外線輔助蛋白快速酶 解技術及其裝置在蛋白質研究、生物醫(yī)學研究以及藥品和食品分析等領域有良好的應用前景。發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提出一種紅外線輔助蛋白快速酶解方法。由于紅外線照射物體會產(chǎn)生熱量,而蛋白水解酶(如胰蛋白酶)的最適宜溫度為37°C， 且溫度過高酶會失活。本發(fā)明首先設計了可控溫的紅外線輔助蛋白質酶解裝置，其結構如 附

圖1所示。將紅外線燈泡1 (功率100-500 W，紅外線波長范圍1.72到16.66微米)安 裝在一有通氣孔的箱子5中，在箱的側壁安裝風扇4，向箱內鼓入冷風以調節(jié)箱內溫度。 風扇4的啟動和關閉通過連有熱電偶2的溫度控制儀6控制，熱電偶2置于箱中以探測其 中的溫度。因紅外線燈泡會產(chǎn)生熱量，當箱中溫度高于設定溫度(如37 'C)，溫度控制儀 6將開啟風扇，而當箱中溫度低于設定溫度，風扇將被關閉，從而構成可控溫的紅外線輔 助蛋白酶解裝置。將蛋白質溶解在10-100毫摩爾/升的緩沖液(如碳酸氫銨溶液)中，pH值為7.5-8.5， 蛋白質在緩沖液中的濃度一般在卜500納克/微升，于90-100 'C的水浴中加熱變性5-15 分鐘，使蛋白的酶切位點充分暴露。然后與蛋白水解酶溶液(如胰蛋白酶溶液)混合，其 中蛋白質與蛋白水解酶的質量比為1: 20-1: 100,該溶液密封于對紅外線透明的容器(如 聚丙烯離心管等)中，也可以直接點在板上(如不銹鋼質譜耙板)，然后于上述酶解裝置 中進行紅外線輔助酶解，酶解時間控制在5到10分鐘，可使溶液中蛋白酶解完全。紅外線能量較低，主要引起被照物體分子的伸縮振動、彎曲振動、扭曲振動等，并產(chǎn) 生熱量。為說明紅外線促進蛋白質酶解的原理，本發(fā)明測定了所用的蛋白(如牛血清白蛋 白、馬心肌紅蛋白等)的紅外吸收光譜圖，發(fā)現(xiàn)所用蛋白的紅外線咴收光譜圖的特征峰相 同，所以本說明書僅給出牛血清白蛋白的紅外吸收光譜圖，見附圖2。本發(fā)明所用的紅外 線燈泡發(fā)射波長為1.72到16.66微米，即波數(shù)范圍為600到5800cm—、附圖2顯示，蛋白 分子在波數(shù)3458.4,2960.17,1652.08,1538.69，和1396.27 cm—1處有特征紅外吸收峰，分別 對應于N-H鍵的伸縮振動、C-H鍵的伸縮振動、C-O鍵的伸縮振動、N-H鍵的彎曲振動 和C-N鍵的伸縮振動，吸收峰正好落在紅外線燈泡的發(fā)射波長范圍內。更重要的是這些鍵 恰恰構成蛋白質肽鏈中的肽鍵，其中一些肽鍵正是蛋白水解酶的酶切位點。所以紅外線引 起的蛋白質分子中肽鍵的振動會使更多的酶切位點暴露出來，使蛋白水解酶更容易與酶切 位點接近，提高酶切位點與蛋白水解酶的作用頻率，從而提高酶解效率。此外，紅外線引 起溶液分子振動產(chǎn)生的熱量，在動力學上對加速蛋白酶解有利。圖3顯示了紅外線輔助酶解時間對溶菌酶酶解結果的影響。當酶解時間為0時，蛋白 質未發(fā)生酶解。紅外線照2.5分鐘后，有9條肽段獲得鑒定，蛋白序列覆蓋度為47%;而紅外線照5分鐘后有12條肽段獲得鑒定，蛋白序列覆蓋度上升到61%;繼續(xù)提高紅外線照 時間盡管可以提高峰的絕對強度，但鑒定的肽段數(shù)目和蛋白序列覆蓋度不再提高，所以-般紅外線輔助蛋白酶解時間控制在5到10分鐘之間。本發(fā)明巧妙地用紅外線代替?zhèn)鹘y(tǒng)蛋白溶液酶解中使用的水浴，顯著提高了酶解效率， 使用設備簡單，紅外線對人體無害，操作安全，可望用于批量蛋白樣品的高通量酶解和鑒 定，在蛋白質研究等領域中有良好的應用前景。 附圉說明圖1為本發(fā)明中使用的紅外線輔助蛋白快速酶解裝置。 圖2為本發(fā)明中使用的牛血清白蛋白的紅外吸收光譜圖。圖3為(A-E)使用紅外線輔助酶解技術酶解密封于管中的溶菌酶溶液獲得產(chǎn)物的 MALDI-TOF質譜圖和(F)酶解時間對蛋白序列覆蓋度的影響。酶解時間，(A) 0, (B) 2.5， (C) 5, (D) 10， (E) 20分鐘;蛋白質溶液濃度200 ng/^L (溶于10咖ol/L NH4HC03水溶液，pH 8. 1中)；溶菌酶和胰蛋白酶的質量比為1: 40;所有被鑒定的肽段均用"*"標出。圖4為使用紅外線輔助酵解技術酶解密封于管中的牛血清白蛋白(A)和馬心肌紅蛋 白(B)溶液獲得產(chǎn)物的MALDI-TOF質譜圖。酶解時間，5分鐘；蛋白質溶液濃度200 ng/jxL (溶于10 mmol/L NH4HC03水溶液，pH8. l中)；蛋白和胰蛋白酶的質量比為1: 40;所有 被鑒定的肽段均用"*"標出。圖5為使用紅外線J^助質譜靶上酶解牛血清白蛋白(A)和馬心細胞色素C (B)溶液 獲得的產(chǎn)物的MALDI-T0F質譜圖。其中圖5 (A)和(B)的插圖分別是為使用普通溶液酶 解牛血清白蛋白和馬心細胞色素C溶液獲得產(chǎn)物的MALDI-TOF質譜圖,酶解時間為5分鐘； 蛋白質溶液濃度200 ng/jiL (溶于10 mmol/L NH4HC03水溶液，pH 8. 1中)；蛋白和胰蛋白 酶的質量比為1: 40;，所有被鑒定的肽段均用"*"標出。圖6為使用紅外線輔助質譜靶上酶解牛血清白蛋白(A)和馬心細胞色素C (B)溶液 獲得產(chǎn)物的大范圍MALDI-TOF質譜圖。酶解時間，5分鐘；蛋白質溶液濃度200 ng/^iL (溶 于10 mmol/L NH^COa水溶液，pH 8.1中)；蛋白和胰蛋白酶的質量比為1: 40。圖中標號l為紅外線燈泡，2為熱電偶，3為裝有蛋白和蛋白水解酶混合溶液的透明 管子，或者為點有蛋白和蛋白水解酶混合溶液液滴的質譜靶板，4為風扇，5為箱子，6為 溫度控制儀。
具體實施方式
下面通過實施例和附圖進一步描述本發(fā)明-1、 管內紅外線輔助蛋白快速酶解本發(fā)明提出的可控溫的的紅外線輔助蛋白質酶解裝置，其結構如附圖l所示。將紅外線燈泡1 (功率250 W，紅外線波長范圍1.72到16.66微米)安裝在一有通氣孔的鐵箱5 中，在箱2的側壁安裝電腦機箱風扇4 (電源電壓12V,功率4.2W)。風扇向箱內鼓入冷 風以調節(jié)箱內溫度。風扇4的啟動和關閉通過連有熱電偶2的溫度控制儀6控制，溫度控 制儀6通過熱電偶2檢測箱內溫度，然后通過電路和繼電器控制風扇4的開關。因紅外線 燈泡l會產(chǎn)生熱量，當箱中溫度高于設定溫度37 'C時，風扇將開啟，而當箱中溫度低于 設定溫度，風扇將關閉，從而構成可控溫的紅外線輔助蛋白酶解系統(tǒng)。將蛋白質溶解在50毫摩爾/升的碳酸氫銨溶液(pH 8.0)中，于95 t的水浴中加熱 變性10分鐘，使蛋白的酶切位點充分暴露。然后與一定濃度的蛋白水解酶如胰蛋白酶溶 液混合，其中蛋白質的濃度為200納克/微升，蛋白質與蛋白水解酶的質量比為1: 40，該 溶液密封于聚丙烯離心管3中，然后于上述酶解裝置中進行紅外線輔助酶解，酶解時間控 制在5分鐘。圖4為使用紅外線輔助酶解技術酶解密封于聚丙烯離心管3中的牛血清白蛋白和馬心 肌紅蛋白溶液獲得產(chǎn)物的MALDI-TOF質譜圖。可見在譜圖中出現(xiàn)了酶解肽段的質譜峰，己 用"*"標出。通過檢索網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)對于牛血清白蛋白和馬心肌紅蛋白分別有42和 16條肽段匹配,得到鑒定的氨基酸分別有420和138個，蛋白序列覆蓋度分別為69%和90%; 而溶液酶解牛血清白蛋白和馬心肌紅蛋白產(chǎn)物的蛋白序列覆蓋度分別為38%和69%，表明 紅外線輔助管內蛋白酶解在5分鐘內的酶解結果與溶液酶解12小時的結果相當，說明本 發(fā)明提出的紅外線輔助蛋白酶解方法具有較高的酶解效率。2、 質譜靶板上紅外線輔助蛋白快速酶解對于基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)，蛋白水解溶液在分析前 需要將溶液點在質譜靶板上，而蛋白質質譜靶板上直接酶解可以簡化操作步驟。作為本發(fā) 明實施例2,進行了質譜靶上紅外線輔助快速酶解牛血清白蛋白和馬心細胞色素C工作。將蛋白質牛血清白蛋白或馬心細胞色素C的變性溶液(熱變性方法見實施例1)與胰 蛋白酶溶液的混合，其中蛋白質的濃度為200納克/微升，蛋白質與蛋白水解酶的質量比 為1: 40，取0.5微升該溶液直接點在質譜靶板上，點樣后的質譜靶板置于一底部墊有潮 濕濾紙的無色透明玻璃培養(yǎng)皿中，潮濕濾紙可以維持培養(yǎng)皿中一定的濕度。然后置于上述 酶解裝置中進行紅外線輔助靶上酶解，酶解時間控制在5分鐘。圖5為使用紅外線輔助質譜靶上酶解牛血清白蛋白和馬心細胞色素C溶液獲得產(chǎn)物的 MALDI-TOF質譜圖?？梢娫谧V圖中出現(xiàn)了酶解肽段的質譜峰，通過檢索網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)對于牛血清白蛋白和馬心細胞色素C分別有33和10條肽段匹配，得到鑒定的氨基酸分別有339和78個，蛋白序列覆蓋度分別為55%和75%,而溶液酶解牛血清白蛋白和馬心細胞 色素C產(chǎn)物的的蛋白序列覆蓋度分別為37%和75%，表明紅外線輔助靶上蛋白質酶解在5 分鐘內的酶解結果與溶液酶解12小時的結果相當，說明本發(fā)明提出的紅外線輔助蛋白質 耙上酶解具有良好的酶解能力。此外，我們還測定了紅外線輔助質譜靶上酶解牛血清白蛋白和馬心細胞色素C的產(chǎn)物 的大范圍MALDI-TOF質譜圖(見圖6)。牛血清白蛋白(分子量66,200)和馬心肌紅蛋白 (分子量12，384)的峰未在質譜圖譜中出現(xiàn)，說明采用紅外線輔助酶解方法，蛋白可在5 分鐘之內可以酶解完全。
權利要求
1、一種紅外線輔助蛋白快速酶解方法，其特征在于將蛋白質與蛋白水解酶溶解于緩沖溶液中，于紅外線照射下進行酶解，酶解時間為5到10分鐘；其中，蛋白質在緩沖液中的濃度為1-500納克/微升，蛋白質與蛋白水解酶的質量比為1∶20-1∶100。
2、 根據(jù)權利要求1所述的紅外線輔助蛋白酶解方法，其特征在于在酶解時，蛋白質與蛋白水解酶的混合溶液密封于對紅外線透明的容器中，或者直接點在板上。
3、 一種紅外線輔助蛋白快速酶解裝置，其特征在于由紅外線燈泡、帶有通氣孔的箱子、風扇、熱電偶和溫度控制儀組成，其中，紅外線燈泡安裝在有通氣孔的箱子中，風扇 安裝在箱子的側壁以調節(jié)箱內溫度，風扇的啟動和關閉通過連有熱電偶的溫度控制儀控 制，熱電偶探頭置于箱中以探測其中的溫度。
全文摘要
本發(fā)明屬蛋白質組學技術領域，具體為一種紅外線輔助蛋白快速酶解方法。本發(fā)明將紅外線燈泡安裝在一有通氣孔的箱子中，在箱的側壁安裝風扇以調節(jié)箱內溫度，風扇的啟動和關閉通過連有熱電偶的溫度控制儀控制，熱電偶探頭置于箱中以探測其中的溫度，從而構成可控溫的紅外線輔助蛋白酶解裝置。將蛋白質與蛋白水解酶如胰蛋白酶溶解于緩沖溶液中，于上述酶解裝置中進行紅外線輔助酶解，酶解時間縮短為5到10分鐘，而酶解結果與傳統(tǒng)的溶液酶解相當。本發(fā)明用紅外線代替?zhèn)鹘y(tǒng)蛋白溶液酶解技術中使用的水浴，顯著提高了酶解效率，設備簡單，可用于批量蛋白樣品的高通量酶解和鑒定。本發(fā)明提出在蛋白質研究、生物醫(yī)學研究以及食品藥品分析等領域有良好的應用前景。
文檔編號C12M1/38GK101323874SQ20081003691
公開日2008年12月17日 申請日期2008年4月30日 優(yōu)先權日2008年4月30日
發(fā)明者張魯雁, 楊芃原, 勝 王, 剛 陳 申請人:復旦大學