專利名稱：：一種星形孢菌素提取純化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種星形孢菌素提取純化的方法。
背景技術(shù)：
：星形孢菌素(staurosporine，以下簡稱STS)—種廣譜非特異性蛋白激酶C抑制劑，可強有力地抑制蛋白激酶C和其他大部分激酶(包括酪氨酸蛋白激酶)。可用于抵抗酵母和真菌引起的許多感染性疾病，抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞程序性死亡，廢除細胞周期檢査點，抑制血管增生等。還具有極強的抗腫瘤活性，在臨床上對12種人腫瘤細胞平均ICs。為0.016pg/ml(U.S.Patent4735039)。另外，STS的衍生物UCN-01等作為抗腫瘤藥物已經(jīng)進入臨床二期(EP0238011Bl,EP0575955Al)。U.S.Pat.No.4,107,297描述了從放線菌AM-2282發(fā)酵液中提取STS的工藝。方法為發(fā)酵液用氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH10.0，再用乙酸丁酯萃取，乙酸丁酯相轉(zhuǎn)移到0.1N鹽酸中，萃取后，用氨水調(diào)節(jié)水相pH為10.0，然后用乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取相加入充水硫酸鈉干燥，然后真空濃縮，硅膠柱(Merk，KiesdgelG)層析分離，洗脫劑為氯仿甲醇(60:1，v/v)，生物堿跟碘化鉍鉀發(fā)生顏色反應(yīng)，利用薄層層析檢測(氯仿甲醇=10:1)。收集生物堿部分，并真空濃縮干燥得到淡黃色粉末。粉末利用氯仿甲醇(50:1，v/v)重結(jié)晶得到淡黃色針狀晶體。該工藝操作復(fù)雜，收率很低，最終獲得的產(chǎn)品很少。Morioka等描述了從發(fā)酵液中提取STS的工藝(參考文獻Morioka,H.，Ishihara，M.,Shibai，H.&Suzuki,T.Staurosporine-induceddifferentiationinahumanneuroblastomacellline,NB國l.所o/.CA亂1985，49，1959-1963)。4萃取液真空濃縮，濃縮物用乙酸乙酯萃取，然后上兩次硅膠柱層析純化，兩次重結(jié)晶，得到STS。此方法操作容量有限，耗時多，收率低，也不適應(yīng)于生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有的星形孢菌素提取純化的方法存在的高純度和高收率不能兼得的不足，提供一種不但產(chǎn)品純度高，而且收率也較高的星形孢菌素提取純化的方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，一種星形孢菌素提取純化的方法，可包含以下步驟1)將星形孢菌素產(chǎn)生菌菌體的親水性有機溶劑或親水性有機溶劑的水溶液提取液除去有機溶劑后加入酸溶液至酸性，然后離心、取上清；2)上清在堿性條件下用親脂性有機溶劑萃??；3)萃取液濃縮后，進行硅膠柱層析。根據(jù)本發(fā)明，步驟l)將星形孢菌素產(chǎn)生菌菌體的親水性有機溶劑或親水性有機溶劑的水溶液提取液除去有機溶劑后加入酸溶液至酸性，然后離心、取上清。所述的提取液較佳的為星形孢菌素產(chǎn)生菌菌體在堿性條件下用親水性有機溶劑或親水性有機溶劑的水溶液提取所得，此步驟可采用現(xiàn)有技術(shù)，如上述Morioka的工藝。其中，所述的堿性條件為pH8.0-14.0，較佳的為pH10.013.0，更佳的為pH12.0，可以加入氨水或氫氧化鈉達到上述堿性條件。星形孢菌素產(chǎn)生菌菌體較佳的可由星形孢菌素產(chǎn)生菌的發(fā)酵液離心而得，通常選用濕菌體即可。提取時采用的親水性有機溶劑或親水性有機溶劑的水溶液的用量較佳的為星形孢菌素產(chǎn)生菌的發(fā)酵液體積的0.5倍以上，或者其用量可以使星形孢菌素產(chǎn)生菌菌體在其中的濃度不超過1g/ml。所述的親水性有機溶劑較佳的可選自醇、酮和四氫呋喃。所述的醇較佳的為Cw的低級脂肪醇，更優(yōu)選自甲醇和乙醇。所述的酮較佳的為丙酮。所述的親水性5有機溶劑的水溶液較佳的可為85100%甲醇水溶液、85~100%乙醇水溶液或85~100%丙酮水溶液，更佳的可為90°/。的甲醇水溶液、90%的乙醇水溶液或95%的丙酮水溶液，上述百分比為重量百分比。所述提取液更佳的可以是星形孢菌素產(chǎn)生菌菌體在堿性條件下用親水性有機溶劑或親水性有機溶劑的水溶液提取兩次或多次所得。該提取液在除去其中的親水性有機溶劑后加入酸溶液至酸性，所述酸溶液較佳的可選自鹽酸和草酸，優(yōu)選0.1N鹽酸。所述酸性較佳的為pH15，優(yōu)選pH23。根據(jù)本發(fā)明，步驟2)將得到的上清在堿性條件下用親脂性有機溶劑萃取。較佳的所述的親脂性有機溶劑可選自乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、二氯甲烷、乙酸丙酯、丙酸乙酯和丙酸甲酯。所述的堿性條件為pH8.014.0，較佳的為pH10.0~13.0，更佳的為pH12.0?？梢约尤氚彼驓溲趸c到上述堿性條件。根據(jù)本發(fā)明，步驟3)將所得的萃取液濃縮后，進行硅膠柱層析。較佳的所述的萃取液加入無水硫酸鈉除去水分，蒸餾除去有機溶劑后進行硅膠柱層析。所述的硅膠柱層析較佳的包括步驟用體積比為100:150:l的氯仿-甲醇混合液為洗脫劑進行梯度洗脫，分步收集洗脫梯度為60:1的目標物。較佳的用薄層層析-碘化鉍鉀跟蹤檢測。本發(fā)明的星形孢菌素提取純化的方法較佳的還可以包括將硅膠柱層析得到的目標物進行濃縮或重結(jié)晶的步驟。本發(fā)明上述步驟2)的親脂性有機溶劑萃取、步驟3)硅膠柱層析及濃縮或重結(jié)晶等的方法均可采用現(xiàn)有技術(shù)，如
背景技術(shù)：
中提及的兩份文獻中公開的星形孢菌素分離純化過程中的相應(yīng)技術(shù)。本發(fā)明的上述各個步驟，如步驟2)的親脂性有機溶劑萃取，步驟3)的硅膠柱層析，以及其后的濃縮或重結(jié)晶步驟等都可以重復(fù)兩次或多次，以得到更好的結(jié)果。本發(fā)明所述的各原料或試劑均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點是-成本低，周期短，方法簡單，易于掌握，高。本發(fā)明星形孢菌素提取純化的方法不但產(chǎn)品純度高，而且產(chǎn)品收率也具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。下述的內(nèi)容中除特別說明之外，所用的百分比都是重量百分比。實施例1將&cc/araf/w^A:aeraco/om^gew&ssw6平加wrawweaCGMCC4.1708(購于中國普通微生物菌種保藏中心)種子取出活化后接種斜面培養(yǎng)基(ISP4培養(yǎng)基可溶性淀粉1.0%、K2HP040.1%、MgS04'7H200.1%、&aCl0.1%、(NH4)2SO40.2%、CaCO30.4%，余量為水，pH7.2，121。C滅菌20min)，將接種菌種的斜面置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)10天，得到成熟的孢子，然后成熟的孢子接種于裝有30ml種子培養(yǎng)基(葡萄糖2.0%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，酵母粉0.3%，CaCO30.4%，余量為水，pH7.0,121。C滅菌20min)的250ml搖瓶中，在28。C、220rpm搖床上培養(yǎng)3天，得到成熟的種子，得到的種子以5%的接種量接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖3.0%，大豆餅粉2%，碳酸鈣0.4%，余量為水，pH7.0)的750ml搖瓶中，置于28°C、220rpm搖床繼續(xù)培養(yǎng)60小時，得到發(fā)酵液。1L發(fā)酵液離心(轉(zhuǎn)速4000rpm，時間10分鐘)處理，棄上清液。濕菌體0.45kg先加入lL的甲醇，用0.1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值12.0，常溫攪拌浸泡2小時后過濾，菌體再用0.5L的甲醇以同樣方法再提取一次。兩次提取得到的濾液混合，蒸餾除去濾液中的甲醇，得到濃縮液。在濃縮液中加入200ml0.1NHC1，使溶液的pH值為3，攪拌，離心，取上清。然后再加入100ml0.1NHCl，使溶液的pH值為3，重復(fù)上述操作。合并所有上清液，調(diào)節(jié)pH值至12.0，然后分別用300ml和200ml乙酸乙酯萃取兩次，合并所有的萃取液，加入10g無水硫酸鈉去除水。然后蒸餾除去乙酸乙酯至淡黃色油狀物。油狀物用乙酸乙酯充分溶解后上硅膠柱層析，用體積比為100:1~100:20的氯仿-甲醇混合液為洗脫劑進行梯度洗脫，流速為0.3ml/min，分步收集。用薄層層析-碘化鉍鉀跟蹤檢測，當洗脫梯度為60:1時目標物流出。收集含目標物的洗脫液，真空濃縮得到淡黃色粉末，室溫下用氯仿熱溶，4°C冷卻過夜結(jié)晶，得到純度為96.1%的化合物19.8mg。換算成收率為61%。實施例2菌體先用1.5L卯。/。(wt)甲醇溶液提取，再用0.6L90。/。(wt)甲醇溶液溶液提取，萃取所用的親脂性有機溶劑為氯仿，其他同實施例1，最后得到94.5%純度的產(chǎn)物17.31mg。換算成收率為52.4%。實施例3菌體先用95。/。(wt)乙醇溶液提取兩次，用量分別為1.5L、0.6L，其他同實施例l，最后得到純度89.3%的產(chǎn)物19.93mg。換算成收率為57.06%。實施例4菌體先后用1.5L、0.8L95Q/。(wt)丙酮溶液提取兩次，其他同實施例1，最后得到純度94.1%的產(chǎn)物13.17mg。換算成收率為39.7%。實施例5菌體先用85。/。(wt)乙醇溶液提取兩次，用量分別為l.OL、0.5L，其他同實施例2，最后得到純度91.3n/。的產(chǎn)物17.93mg。換算成收率為52.5%。實施例6菌體先用四氫呋喃在pH8.0條件下提取兩次。提取得到的溶液混合，蒸餾除去溶液中的四氫呋喃后，加入0.1N鹽酸溶液至酸性為pH3.0，攪拌，離心，取上清。上清液調(diào)節(jié)至pH值lO.O，用乙酸丁酯萃取。其他同實施例l，最后得到純度94.1%的產(chǎn)物9.34mg。換算成收率為29.8%。實施例7菌體先用90。/。(wt)的乙醇水溶液在pH14.0條件下提取兩次。提取得到的溶液混合，蒸餾除去溶液中的有機溶劑后，加入0.1N鹽酸溶液至酸性為pHl.O，攪拌，離心，取上清。上清液調(diào)節(jié)pH值14.0，用氯仿萃取。其他同實施例l，最后得到純度92.24。/。的產(chǎn)物18.67mg。換算成收率為55.21%。實施例8菌體先用乙醇在pH10.0條件下提取兩次。提取得到的溶液混合，蒸餾除去溶液中的有機溶劑后，加入草酸溶液至酸性為pH4.0，攪拌，離心，取上清。上清液調(diào)節(jié)pH值10.0，用二氯甲烷萃取。其他同實施例l，最后得到純度93.5°/。的產(chǎn)物17.31mg。換算成收率為51.89%。實施例9菌體先用85。/。(wt)的甲醇水溶液在pH13.0條件下提取一次。提取得到的溶液混合，蒸餾除去溶液中的有機溶劑后，加入0.1N鹽酸溶液至酸性為pH5.0，攪拌，離心，取上清。上清液調(diào)節(jié)pH值13.0，用乙酸丙酯萃取。其他同實施例1，最后得到純度92.91%的產(chǎn)物15.24mg。換算成收率為45.39%。實施例10菌體先用85。/。(wt)的丙酮水溶液在pH12.0條件下提取兩次。提取得到的溶液混合，蒸餾除去溶液中的有機溶劑后，加入0.1N鹽酸溶液至酸性為pH2.0，攪拌，離心，取上清。上清液調(diào)節(jié)pH值12.0，用丙酸乙酯萃取。其他同實施例1。最后得到純度89.37%的產(chǎn)物14.26mg。換算成收率為40.86%。實施例11菌體先用乙醇在pH12.0條件下提取兩次。提取得到的溶液混合，蒸餾除去溶液中的有機溶劑后，加入0.1N鹽酸溶液至酸性為pH3.0，攪拌，離心，取上清。上清液調(diào)節(jié)pH值12.0,用丙酸甲酯萃取。其他同實施例1。最后得到純度89.24%的產(chǎn)物14.91mg。換算成收率為42.66%。實施例124L同實施例1的發(fā)酵液分成4份，取其中一份進行如下操作。9發(fā)酵液離心(轉(zhuǎn)速4000rpm，時間10分鐘)，棄掉上清，收集菌體。加入500ml甲醇，用氨水調(diào)節(jié)pH12.0，室溫攪拌lh，過濾，用100ml甲醇重新洗滌濾餅并過濾，合并濾液，真空濃縮除去甲醇，得到100ml左右濃縮液。在濃縮液中加入1/2體積0.1NHC1，攪拌，離心，取上清。調(diào)節(jié)上清液pH為12.0，加入乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取相，加入無水硫酸鈉除水。然后蒸餾除去乙酸乙酯，得到淡黃色油狀物。油狀物中STS含量為84%(wt)左右。油狀物用乙酸乙酯充分溶解后上硅膠柱層析，用不同比例的氯仿-甲醇混合液為洗脫劑進行梯度洗脫，流速為0.3ml/min，分步收集。用薄層層析-碘化鉍鉀跟蹤檢測，當洗脫梯度為60:1時目標物流出。將收集的洗脫液真空濃縮得到淡黃色粉末，室溫下用氯仿熱溶，4'C冷卻并靜置過夜，得到淡黃色針狀晶體。純度為96.5%，收率為64.9%。實施例13取實施例12中4份發(fā)酵液中的另一份進行如下操作。菌體先后用500ml和100ml丙酮提取，其他步驟同實施例1。即實施例1中，除菌體先后用500ml和100ml甲醇提取的步驟中所用的甲醇被丙酮代替外，其他步驟都與實施例2相同。對比例1U.S.Pat.No.4,107,297描述的酸堿提取法。取實施例12中4份發(fā)酵液中的第三份進行如下操作。發(fā)酵液用氨水調(diào)節(jié)pH值lO.O，加入500ml乙酸乙酯萃取，靜置分液，離心，分出有機相；在有機相中加入250mL0.1NHCl，萃取水相。再用稀氨水調(diào)水相pH值為10.0，并用100mL的乙酸乙酯抽提兩次，分液漏斗除去水相，加無水硫酸鈉脫水后，減壓蒸餾濃縮有機相至漿狀粗提物，粗提物中STS含量為75。/。(wt)左右。粗提物用乙酸乙酯充分溶解后上硅膠柱層析，用不同比例的氯仿-甲醇混合液為洗脫劑進行梯度洗脫，收集含目標化合物的洗脫液，濃縮，結(jié)晶，得到化合物。純度為94.5%，收率為35.2%。對比例2Morioka描述的甲醇提取法取實施例12中4份發(fā)酵液中的最后一份進行如下操作。發(fā)酵液離心，菌體先后用500ml和300ml甲醇提取，然后將所有甲醇溶液合并，減壓濃縮除去甲醇后，得到100ml左右濃縮液，濃縮液用乙酸乙酯萃取，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉脫水，減壓濃縮至漿狀物。漿狀物中STS含量為55。/。(wt)左右，雜質(zhì)很多。槳狀物用乙酸乙酯溶解后上硅膠柱層析一次，但仍有較多雜質(zhì)不能分離，因此純度較低。實施例12是本發(fā)明的甲醇-酸堿處理提取。實施例13本發(fā)明的丙酮-酸堿處理提取。對比例1是U.S.Pat.No.4,107,297描述的酸堿提取法。對比例2是Morioka描述的甲醇提取法。這四種提取方法的結(jié)果見表1，有表可知本發(fā)明的兩種方法的提取效果明顯的要好于兩種現(xiàn)有的提取方法。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求1、一種星形孢菌素提取純化的方法，其特征在于，包含以下步驟1)將星形孢菌素產(chǎn)生菌菌體的親水性有機溶劑或親水性有機溶劑的水溶液提取液除去有機溶劑后加入酸溶液至酸性，然后離心、取上清；2)上清在堿性條件下用親脂性有機溶劑萃取；3)萃取液濃縮后，進行硅膠柱層析。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的提取液為星形孢菌素產(chǎn)生菌菌體在堿性條件下用親水性有機溶劑或親水性有機溶劑的水溶液提取所得。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的星形孢菌素產(chǎn)生菌菌體由星形孢菌素產(chǎn)生菌的發(fā)酵液離心所得。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，提取時采用的親水性有機溶劑或親水性有機溶劑的水溶液的用量為星形孢菌素產(chǎn)生菌的發(fā)酵液體積的0.5倍以上。5、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的親水性有機溶劑選自醇、酮和四氫呋喃。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的醇選自甲醇和乙醇，所述的酮為丙酮。7、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的親水性有機溶劑的水溶液為85~100%甲醇水溶液、85~100%乙醇水溶液或85~100%丙酮水溶液，上述百分比為重量百分比。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的親水性有機溶劑的水溶液為90%的甲醇水溶液、90%的乙醇水溶液或95%的丙酮水溶液，上述百分比為重量百分比。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的酸性為pHl~5。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟l)所述的酸溶液選自鹽酸和草酸。11、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的親脂性有機溶劑選自乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、二氯甲垸、乙酸丙酯、丙酸乙酯和丙酸甲酯。12、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的堿性條件為pH8.014.0。13、根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述的堿性條件為pH10.0~13.0。14、根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述的堿性條件為pH12.0。15、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的硅膠柱層析包括步驟用體積比為100:1~50:1的氯仿-甲醇混合液為洗脫劑進行梯度洗脫，分步收集洗脫梯度為60:l的目標物。16、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括將硅膠柱層析得到的目標物進行濃縮或重結(jié)晶。全文摘要本發(fā)明公開了一種星形孢菌素提取純化的方法，包含以下步驟1)將星形孢菌素產(chǎn)生菌菌體的親水性有機溶劑或親水性有機溶劑的水溶液提取液除去有機溶劑后加入酸溶液至酸性，然后離心、取上清；2)上清在堿性條件下用親脂性有機溶劑萃??；3)萃取液濃縮后，進行硅膠柱層析。本發(fā)明星形孢菌素提取純化的方法成本低，周期短，方法簡單，易于掌握，不但產(chǎn)品純度高，而且產(chǎn)品收率也高。文檔編號C12P17/18GK101580515SQ20081003751公開日2009年11月18日申請日期2008年5月16日優(yōu)先權(quán)日2008年5月16日發(fā)明者琴張,張海紅,胡海峰申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院