專(zhuān)利名稱(chēng)：一個(gè)能辨別海帶雌配子體的scar分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物性別鑒定的特異性分子標(biāo)記，尤其 涉及一種辨別海帶雌配子體的SCAR分子標(biāo)記。
技術(shù)背景對(duì)于大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，性別的鑒定主要是通過(guò)植物的外部形態(tài)、生理生化差異、同工 酶圖譜、特異蛋白、染色體組型、核酸等方面來(lái)進(jìn)行的。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，特別 是分子標(biāo)記技術(shù)的日趨成熟，使得分子標(biāo)記在植物性別鑒定中的作用顯得越來(lái)越重要。因 為分子標(biāo)記能夠直接從基因組DNA水平上來(lái)反映植物的差異，其測(cè)定過(guò)程不受植物發(fā)育 階段的影響，極大地提高經(jīng)濟(jì)效益。自1974年Grozdicker等人首創(chuàng)第一代DNA分子標(biāo)記——限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)以來(lái)，各種分子標(biāo)記如雨后春等般地 發(fā)展起來(lái)，到目前為止，已經(jīng)發(fā)展到近幾十種。如隨機(jī)擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性DNA (Randomly Amplified Polymorphic DNA， RAPD)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列[(Simple Sequence Repeat, SSR，又 稱(chēng)微衛(wèi)星(Microsatellite)序列)]、表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag, EST)、擴(kuò)增 的限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)、錨定簡(jiǎn)單序 列重復(fù)(Inter-simple Sequence Repeat, ISSR)、單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)、單鏈構(gòu)想多態(tài)性(Single-stranded Conformation Polymorphism, SSCP) 等。這些標(biāo)記技術(shù)在植物分子遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析與種質(zhì)鑒定、重要農(nóng)藝性狀 基因定位與圖位克隆、轉(zhuǎn)基因植物鑒定和分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面發(fā)揮重要作用。目 前，用于鑒定植物性別的分子標(biāo)記主要有RAPD、 SCAR、 AFLP、 SSR。但是在藻類(lèi)上利用分子標(biāo)記鑒定其性別的報(bào)道非常少。Haring等利用衣藻 (C/j/am>^omowas ewgametoy)性別相關(guān)的一些性狀，構(gòu)建了具有15個(gè)RAPD標(biāo)記、3個(gè) 形態(tài)學(xué)標(biāo)記和1個(gè)RFLP標(biāo)記的部分連鎖圖譜，為運(yùn)用遺傳圖譜研究與性別相關(guān)的工作打 下了基礎(chǔ)。Martinez等利用RAPD來(lái)鑒定紅藻門(mén)江蘺(Gra"7an'" gradfc)的性別，其中 OPD13 (5'-TCGTCACCCC-3') —條引物就同時(shí)在江蘺雌、雄個(gè)體中擴(kuò)增出兩個(gè)差異片斷， 可應(yīng)用于早期性別鑒定。Paran首次提出序列特異性擴(kuò)增區(qū)(Sequence characterized ampl迅ed region, SCAR)， 通過(guò)對(duì)多態(tài)性RAPD產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，設(shè)計(jì)更長(zhǎng)的引物將RAPD-PCR轉(zhuǎn)變成經(jīng)典的 PCR可以提高穩(wěn)定性、重復(fù)性和特異性。目前，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)關(guān)于辨別海帶雌配子體的SCAR分子標(biāo)記的報(bào)導(dǎo)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種能海帶雌酏子體的SCAR分子標(biāo)記。本發(fā)明根據(jù)地錢(qián)Y染色體保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物(SEQ.ID.NOl)，對(duì)海帶雌、雄配子體基因 組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了一個(gè)與海帶雌配子體性別相關(guān)的差異分子標(biāo)記，通過(guò)膠回收、 克隆、測(cè)序、引物設(shè)計(jì)及PCR等過(guò)程，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為SCAR分子標(biāo)記(SEQ.ID.N04)。該分 子標(biāo)記可用于海帶配子體性別的快速有效鑒定、單性生殖海帶孢子體親本來(lái)源及其后代的 性別鑒定。本發(fā)明利用特別設(shè)計(jì)的引物(SEQ.ID.NOl)分別對(duì)海帶雌、雄配子體中提取的基因組 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果，將原引物SEQ.ID.N01延伸為新的引物 (SEQ.ID.N03)。利用新的引物，再對(duì)海帶雌、雄配子體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增 產(chǎn)物中得到一條大約為500bp的特異條帶(見(jiàn)圖2所示)，此譜帶僅在海帶雌配子體基因組 擴(kuò)增中出現(xiàn)，而在海帶雄配子體基因組擴(kuò)增中沒(méi)有此條帶出現(xiàn)。經(jīng)測(cè)序，該海帶雌配子體 特異條帶的大小為494bp，記為F-494，作為海帶雌配子體特異性分子標(biāo)記，序列為 SEQ.ID.N04。本發(fā)明提出的辨別雌配子體的SCAR分子標(biāo)記的獲取方法如下(1) 在17il。C、 30-40|amolm—2s—i光照條件下培養(yǎng)海帶雌、雄性配子體無(wú)性繁殖系，收 集材料并提取配子體基因組DNA。(2) 根據(jù)地錢(qián)(M^r/7a油'a /7ofymwp/^) Y染色體保守區(qū)域堿基序列(GenBank登錄 號(hào)AB069714)設(shè)計(jì)引物SEQIDNO.l，利用此引物分別對(duì)海帶雌、雄配子體基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行 觀察和拍照。(3) 回收特異擴(kuò)增片段的DNA。利用購(gòu)于Takara公司的pMD19-T載體、大腸桿菌 (五wte 7'cWfl co/z')感受態(tài)菌株JM109，進(jìn)行克隆(根據(jù)Takara公司連接轉(zhuǎn)化試劑盒說(shuō)明書(shū))。挑選白色菌落，使用PCR確認(rèn)載體中插入片段的長(zhǎng)度大小，將含有目的片段的菌液進(jìn)行測(cè) 序，得SEQIDN0.2;(4) 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，將原正向引物向3'端及反向引物向5'端延長(zhǎng)至29個(gè)堿基，獲得 SCAR特異引物的序列SEQIDN0.3，對(duì)海帶雌、雄配子體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 擴(kuò)增結(jié)果在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察與拍照。(5) 按照步驟(3)進(jìn)行DNA膠回收、連接轉(zhuǎn)化、白色菌落篩選、插入片段的長(zhǎng)度 大小確認(rèn)等，最后對(duì)含有目的片段的菌液進(jìn)行測(cè)序，獲得一個(gè)能鑒別海帶雌配子體的SCAR 分子標(biāo)記，它的DNA序列見(jiàn)SEQ ID N0.4。本發(fā)明提出的SCAR分子標(biāo)記利用該標(biāo)記可以快速有效的鑒定海帶雌配子體，并可用 于單性生殖海帶孢子體親本來(lái)源及其后代的性別鑒定。


圖l 海帶雌配子體差異分子標(biāo)記的電泳圖譜。M: GeneRulerTM100bp DNA Marker Plus; l-2泳道雄配子體；3-4泳道雌配子體。圖2海帶雌配子體SCAR分子標(biāo)記的電泳圖譜。M: DL250; 0泳道空白對(duì)照，1-10 泳道雌配子體；11-20泳道雄配子體。
具體實(shí)施方式
1) 取鮮重為0.1g的海帶配子體無(wú)性繁殖系。2) 在液氮中輕柔地將配子體無(wú)性繁殖系研磨成粉末后，立即轉(zhuǎn)移入預(yù)熱的0.6 ml CTAB提取緩沖液中，該緩沖液含有重量體積比為3%的CTAB、 1.4 M NaCl、20 mM EDTA、 10 mM pH為7.8的Tris-HCl和重量體積比為2%的巰基乙醇，于渦旋混勻儀上混勻1 min。3) 65 。C溫浴30-60 min，每5 min顛倒搖動(dòng)1次。4) 加入等體積的體積比為24:1的氯仿:異物醇混合液，輕輕顛倒混勻3-5 min，至出 現(xiàn)乳化層為止。5) 室溫下12 000rpm (轉(zhuǎn)/分鐘)離心10min，上清液轉(zhuǎn)移到另一滅菌的離心管中。6) 向離心管中加入2/3體積-20。C預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，至出現(xiàn)沉淀為止。7) -20 。C下放置15 min左右后，0-4 。C下8 000 rpm離心10 min。沉淀于70%乙醇 洗滌并在無(wú)菌操作臺(tái)中通風(fēng)干燥后，溶解于200 pl滅菌的TE緩沖液中，該緩沖液內(nèi)含有 1 mM EDTA和10 mM pH為8.0的Tris-HCl。8) 待完全溶解后加入1/3體積的7.5 M的醋酸銨和2倍體積-20 。C預(yù)冷的無(wú)水乙醇。 顛倒混勻，至出現(xiàn)沉淀為止。9) -20 。C下放置30 min以上，0-4 。C下12 000 rpm離心10 min后，再用70%的乙醇 洗滌沉淀。最后將沉淀溶解于40-100 ^左右的TE緩沖液中，該緩沖液含有1 mM EDTA 和10 mM pH為8.0的Tris-HCl， -20 。C保存?zhèn)溆谩?0) 根據(jù)地錢(qián)(Man^awto/7o/ymo^p/wr) Y染色體保守區(qū)域堿基序列(GenBank登錄號(hào)AB069714)設(shè)計(jì)引物SEQIDNO.l，通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，最后確定反應(yīng)程序?yàn)橄冗M(jìn)行一輪94 。C變性1 min、 53 。C退火1 min、 72 。C延伸2 min的PCR反應(yīng)，接著進(jìn)行30個(gè)包括94 。C變性30s、 53。C退火2min、 72 。C延伸2 min的反應(yīng)循環(huán)，最后在72 。C下延伸7 min。 25 pl的PCR反應(yīng)體系含2.5 mM Mg2+、 0.4 SEQ ID NO.l引物、0.2 mMdNTPs、 2U r叫酶及30 ng模板DNA。 PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和拍照。11) 使用上海生物工程有限公司的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，參照商家實(shí)驗(yàn)步 驟說(shuō)明操作。將海帶雌、雄配子體基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5X的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳， 使雌、雄差異片段與其他擴(kuò)增條帶盡可能分開(kāi)，然后用干凈的刀片割下差異條帶，放入2.0 ml離心管中。12) 每100mg凝膠加入700(il吸附緩沖液，50-60 。C溫浴15min，使凝膠徹底融化，每 2min顛倒混勻一次。。13) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管中，加 入500 jLil漂洗液，8 000 rpm室溫離心l min。14) 重復(fù)步驟13) —次。15) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管中，12 000 rpm室溫離心15 s。16) 將UNIQ-10柱放入一個(gè)新的1.5 m啲離心管中，在柱子膜中央加40 pl溶解液，室 溫放置2 min。17) 12 000rpm室溫離心l min，離心管中的液體即為回收的DNA片斷，保存于-20 。C備用o18) 在微量離心管中加入l plpMD19-T質(zhì)粒載體，0.1-0.3 pmol待插入DNA片段，再加 犯20至5 pl。19) 加入5 nl的連接混合液，16 。C反應(yīng)30 min。20) 將上述10 pl反應(yīng)液加入至lOO nl的大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30 min。 輕輕搖動(dòng)離心管2-3次，以充分混勻。21) 冰浴后將離心管轉(zhuǎn)入42 。C水浴中熱激90 s,然后立即冰浴3-5 min。22) 加入890 pl的LB液體培養(yǎng)基，37。C下150rpm的速度振蕩培養(yǎng)45-60min。每升LB 液體培養(yǎng)基含10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，最后用5M的NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0 后，用單蒸水定容至一升，滅菌即可。23) 取O.l ml含有連接產(chǎn)物的菌液涂布于LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，37 。C培養(yǎng)過(guò)夜， 形成單菌落。LB瓊脂平板制備在每100mlLB液體培養(yǎng)基中加L5 g瓊脂，待滅菌的瓊脂 培養(yǎng)基冷卻到50 。C左右時(shí)加入4 mg的5-溴-4-氯-3-吲哚-P-半乳糖苷(X-Gal)、 2.4mg的異丙 基硫代-卩-D-半乳糖苷(IPTG)和10mg的氨芐青霉素(Amp)，制作成X-Gal、 IPTG、 Amp 平板培養(yǎng)基，搖勻后倒平板。24) 挑選白色菌落，使用PCR法確認(rèn)載體中插入片段的長(zhǎng)度大小。25) 挑取在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的白色菌落，接種到0.5-l ml的含氨 芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中。26) 37。C下150rpm的速度震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。27) 取100(al菌液于12 000rpm離心2min。28) 棄去上清液，向沉淀中加入40pl5。/。的TritonX-100水溶液。 39)煮沸5min，冰上放置5 min， 12 000 rpm離心5 min。30)取2 pl上清液作為模板DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。25 pl PCR基本反應(yīng)體系組成包含50 mMKCl， 10mMpH為8,3的Tris-HCl緩沖液、2,0 mM Mg2+、 200pMdNTPs、 M13正向和反 向通用引物各0.2 pM、 1.0 U 7hg DNA聚合酶及30 ng模板DNA。擴(kuò)增程序包括94 。C預(yù)變性 3min，緊接著按照94 。C變性45 s、 57。C退火45 s、 72 。C延伸1.5 min的程序進(jìn)行30個(gè)循環(huán)， 最后72 。C延伸10 min。 PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物6 ^1在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖 液為1XTAE，該緩沖液包括40mMTris-HAc和2mMEDTA。電壓為5Vcm—、凝膠成像系 統(tǒng)觀察并拍照。32) 將含有目的片段的菌液送至上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。33) 根據(jù)測(cè)序結(jié)果SEQ IDN0.2，將正向引物向3'端及反向引物向5'端延長(zhǎng)至29個(gè)堿 基，獲得SCAR特異引物的序列SEQ ID N0.3。對(duì)海帶雌、雄配子體基因組DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 pl)含50 mM KC1、 10 mM pH為8.3的Tris-HCl緩沖液、2.5 mM Mg2+、 100tiMdNTPs、 SEQIDNO.3引物各0.2 nM、 1.0 U DNA聚合酶及50 ng模板DNA。擴(kuò) 增程序包括94 。C預(yù)變性5 min，然后按照包括94 。C變性30 s、 62。C退火45 s、 72 。C延伸l min 的程序進(jìn)行30個(gè)反應(yīng)循環(huán)，最后72。C延伸10min。擴(kuò)增結(jié)果在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電 泳，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察與拍照。34) 按照l(shuí)l) -30)步驟進(jìn)行DNA膠回收、連接轉(zhuǎn)化、白色菌落篩選、插入片段的長(zhǎng) 度大小確認(rèn)等，最后將含有目的片段的菌液送至上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序，獲得海帶雌 配子體的一個(gè)SCAR分子標(biāo)記，序列參見(jiàn)SEQ ID N0.4。SEQ ID NO.l:正向引物5 ， AAGAC AAGCGGGTGAACT3 ， 反向引物5' CGATGCGATGTCC AGTGT3 ，SEQ ID N0.2:ACCCACTGATCGACGATGCGATGTCCAGTGTSEQ ID N0.3:正向引物5 ， AAGACAAGCGGGTGAACTCAGCGAGGTCT3 ， 反向引物5，ACACTGGACATCGCATCGTCGATCAGTGT3，SEQ IDN0.4:ACACCCTGATCGACGATGCGATGTCCAGTGT
權(quán)利要求
1. 一種能辨別海帶雌配子體的SCAR分子標(biāo)記，其特征在于為F-494，其序列為SEQ IDNO.4。
2、 一種用于海帶雌配子體基因組DNA擴(kuò)增引物對(duì)，其特征在于該引物對(duì)的序列為SEQ ID N0.3。
3、 一種能辨別海帶雌配子體的SCAR分子標(biāo)記的提取方法，其特征在于具體步驟如下(1) 在17±1 °C、 30-40 pmolm'、"光照條件下培養(yǎng)海帶雌、雄性配子體無(wú)性繁殖系，收 集材料并提取配子體基因組DNA;(2) 根據(jù)地錢(qián)Y染色體保守區(qū)域堿基序列設(shè)計(jì)引物SEQIDNO.l，利用此引物分別對(duì) 海帶雌、雄配子體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，溴 化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和拍照；(3) 回收特異擴(kuò)增片段的DNA，利用pMD19-T載體、大腸桿菌感受態(tài)菌株JM109, 進(jìn)行克隆，挑選白色菌落，使用PCR確認(rèn)載體中插入片段的長(zhǎng)度大小，將含有目的片段的 菌液進(jìn)行測(cè)序，得SEQ IDNO. 2;(4) 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，將原正向引物向3'端及反向引物向5，端延長(zhǎng)至29個(gè)堿基，獲得 SCAR特異引物的序列SEQ ID N0.3，對(duì)海帶雌、雄配子體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增結(jié)果在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察與拍照；(5)按照步驟(3)進(jìn)行DNA膠回收、連接轉(zhuǎn)化、白色菌落篩選、插入片段的長(zhǎng)度大 小確認(rèn)等，最后對(duì)含有目的片段的菌液進(jìn)行測(cè)序，獲得一個(gè)能鑒別海帶雌配子體的SCAR 分子標(biāo)記，它的DNA序列為SEQ ID N0.4。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種能辨別海帶雌配子體的SCAR分子標(biāo)記。該分子標(biāo)記的序列為SEQ ID No.4。它由下述方法提取獲得根據(jù)地線(xiàn)Y染色體保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，對(duì)海帶雌、雄配子體基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果，將原引物延伸為新的引物SEQ ID No.3。利用此引物對(duì)海帶雌、雄配子體基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到海帶雌配子體的SCAR分子標(biāo)記F-494，其序列為SEQ ID No.4。利用該SCAR分子標(biāo)記，可以對(duì)海帶配體子性別進(jìn)行快速有效的鑒定，也可對(duì)單性生殖海帶孢子體親本來(lái)源及其后代的性別進(jìn)行鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101280339SQ200810038220
公開(kāi)日2008年10月8日 申請(qǐng)日期2008年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月29日
發(fā)明者劉艷省, 吳文凱, 周志剛, 李利華 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)