專利名稱：Loc255313基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因，尤其涉及一種L0C255313基因的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，是我國位居第二的癌癥"殺手"，常見于中年男性。因其惡性度高、病情進(jìn)展快，病人早期一般沒有什么不適， 一旦出現(xiàn)癥狀就診，往往已屬中晚期。故治療難度大、療效差， 一般發(fā)病后生存時間僅為6個月，人稱"癌中之王"。因此，提高肝癌早期診斷水平、選擇科學(xué)合理的治療方法和采取有效的預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移措施將是改變這種局面的三個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
目前診斷原發(fā)性肝癌最重要的腫瘤標(biāo)志物是甲胎球蛋白(AFP)，但在我國原發(fā)性肝癌患者中，血清AFP水平高于正常值者只占60% 70%;其中只有約32%的患者血清AFP水平能達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn)(>400yg/L)，其余均為低濃度陽性。此外，部分肝炎、肝硬變等非肝癌患者的血清AFP水平也可異常升高。這些都影響了 AFP這一指標(biāo)的診斷特異性。因此，有待開發(fā)新的特異性腫瘤標(biāo)記物，以提高原發(fā)性肝癌的診斷水平。
此外，由于我國肝癌患者多合并嚴(yán)重的肝硬化，且易肝內(nèi)播散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使手術(shù)切除受到很大限制，而且放化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，對正常細(xì)胞和免疫系統(tǒng)也有破壞和抑制作用。因此，治療肝癌除了傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療方式外，還需要腫瘤治療疫苗的輔助治療。
CT (Cancer-testis，腫瘤一睪丸)抗原，又稱腫瘤共享抗原， 一般在正常組織中不表達(dá)，但在人生殖細(xì)胞系正常表達(dá)，在多種不同類型的腫瘤中也均有表達(dá)，包括黑色素瘤，膀胱癌，肺癌，肝癌等，這些具有免疫原性的蛋白正在被積極發(fā)展為腫瘤治療疫苗的靶點(diǎn)。目前為止已有多達(dá)80多個CT抗原家族被鑒定。CT抗原在腫瘤形成中的作用也正在受到進(jìn)一步評估，精子發(fā)生過程中的部分基因表達(dá)程序在腫瘤發(fā)生時重新開放，可能有助于惡性腫瘤的表型特征一永生化，侵襲性，免疫逃逸，基因組低甲基化和轉(zhuǎn)移能力。
CT抗原根據(jù)編碼它們基因的染色體定位可分為X染色體連鎖CT抗原(X-CT)和
3常染色體(non-X CT)即非X染色體連鎖抗原。在正常睪丸中X染色體連鎖的CT抗原通常在精原細(xì)胞中表達(dá)，而精原細(xì)胞是在睪丸中保持不斷增殖的一類生殖干細(xì)胞。由于生殖干細(xì)胞、發(fā)生于胚胎滋養(yǎng)層的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞有著許多共有的特征，在已知癌基因和抑癌基因無突變的情況下，原本已沉默的生殖細(xì)胞系特異性表達(dá)基因在腫瘤干細(xì)胞中被激活后可以調(diào)節(jié)腫瘤的惡性表型。值得強(qiáng)調(diào)的是，據(jù)估計(jì)X染色體上約有1(F。的基因?qū)儆赬染色體連鎖CT基因。因此，選取X染色體連鎖的CT基因?yàn)閷ο笱芯科湓诟伟┌l(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。
人LOC255313基因(Genbank No.剛_173571.1)是CT抗原家族的成員之一。關(guān)于L0C255313基因與肝癌發(fā)生的關(guān)系尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種L0C255313基因的應(yīng)用，該L0C255313基因可作為肝癌診斷的標(biāo)記分子，提高了肝癌診斷的準(zhǔn)確性。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種L0C255313基因在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用，使腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移得到有效控制。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種L0C255313基因在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR、實(shí)時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品。
在本發(fā)明中，所述用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增LOC255313基因的引物。
所述用實(shí)時定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增L0C255313基因的引物。
所述用免疫檢測診斷肝癌的產(chǎn)品包括與L0C255313蛋白特異性結(jié)合的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。
所述用原位雜交診斷肝癌的產(chǎn)品包括與L0C255313基因的核酸序列雜交的探針。
所述用基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品包括與L0C255313基因的核酸序列雜交的探針。在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對L0C255313蛋白特異的抗體。例如，將提純的人LOC255313基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人L0C255313蛋白或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)制備(例如，Kohler et al. , Nature 256: 495, 1975; Kohler etal., Eur. J. Immunol. 6: 511, 1976; Kohler et al. ， Eur. J. Immunol. 6: 292，1976)。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑L0C255313功能的抗體，也可以是不影響人L0C255313功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人L0C255313基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人L0C255313基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的L0C255313基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以利用在原核細(xì)胞例如A 中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化L0C255313蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以利用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。
在本發(fā)明中，所述探針可以是DNA、 RNA、 DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、 20、 15、 13或10個堿基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、 80、 100、 150、 300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長度以15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補(bǔ)序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種LOC255313基因在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
所述治療肝癌的藥物包括通過RNA干擾抑制L0C255313基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸，或基于LOC255313抗原蛋白的腫瘤疫苗，或用于抑制LOC255313蛋白活性的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明中，所述RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA (double-stranded RNA， dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，該技術(shù)己被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。以細(xì)胞為基礎(chǔ)的RNAi
5篩選在功能基因?qū)W研究方面具有許多優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在大多數(shù)細(xì)胞類型都能使用RNAi方法，并且相對較容易下調(diào)或沉默任何目的基因的表達(dá)。
在本發(fā)明中，所述腫瘤疫苗是指用腫瘤組織中的特殊物質(zhì)來激發(fā)患者體內(nèi)的免疫功能，使患者的免疫功能能夠殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤疫苗主要指治療性疫苗，是在病人得病后再用疫苗的方法進(jìn)行治療，以控制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。腫瘤疫苗具有個體性，因?yàn)槊恳粋€病人所得的腫瘤類型、分期都不一樣，腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的物質(zhì)也不同，而
腫瘤疫苗又是由病人本身的腫瘤制成，因此針對患者具體的腫瘤制備的腫瘤疫苗具有個體化特征，其副作用小，針對性強(qiáng)。
所述腫瘤疫苗制備時，用手術(shù)方法切取腫瘤患者的腫瘤組織并無菌冷凍保存，以提取腫瘤抗原。本發(fā)明的L0C255313抗原蛋白可作為腫瘤抗原被提取。獲得腫瘤抗原是第一步，接著要獲得樹突狀細(xì)胞，即從病人血液的單個核細(xì)胞中獲得。采出單個核細(xì)胞后再進(jìn)行篩選和體外培養(yǎng)，然后用腫瘤抗原L0C255313在體外刺激樹突狀細(xì)胞，使該樹突狀細(xì)胞能夠傳遞免疫信息，最后將訓(xùn)練好的樹突狀細(xì)胞回輸?shù)襟w內(nèi)，使體內(nèi)產(chǎn)生針對腫瘤抗原L0C255313的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明治療肝癌的藥物施用方式可以是口服、全身施用(例如，透過皮膚、鼻吸入或者用栓劑)或腸胃外施用(例如，肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)。
本發(fā)明的藥物也可被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明L0C255313基因在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，因此L0C255313基因可作為診斷肝癌的特異標(biāo)志基因，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快速。本發(fā)明L0C255313基因?yàn)榉乐胃伟┨峁┝诵碌闹委煱悬c(diǎn)和有效新藥。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1通過RT-PCR驗(yàn)證L0C255313基因在人肝癌組織和癌旁組織中的差異表達(dá)圖2是本發(fā)明實(shí)施例6通過RT-PCR分析X染色體連鎖CT基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)圖3是本發(fā)明實(shí)施例7對L0C255313基因進(jìn)行siRNA實(shí)驗(yàn)的流程圖4是本發(fā)明針對L0C255313基因的siRNA抑制肝癌細(xì)胞生長的曲線圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一歩詳細(xì)的說明。
以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1
RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測L0C255313基因在肝癌組織中的表達(dá)情況。
1. 組織分離(Tissue isolation)
實(shí)驗(yàn)用組織來源于72例HBV陽性并表達(dá)甲胎蛋白的原發(fā)性肝癌的手術(shù)病人(RT-PCR證實(shí)AFP在肝癌均為陽性而癌旁為陰性)。手術(shù)切除的肝臟一經(jīng)離體，迅速切取病灶及周圍5公分外癌旁組織，放入液氮中(一8(TC)保存。癌和癌旁的診斷均以病理診斷為最終依據(jù)。
2. 總RNA的抽提試劑盒
抽提RNA試劑采用TRIzol reagent (GIBC0/BRL)，該試劑是基于酸性酚一步抽提法生產(chǎn)的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要進(jìn)行無RNA酶處理，以保證實(shí)驗(yàn)中無RNA酶的環(huán)境。
3. RNA的抽提步驟
將碾杵和勻漿器等器皿在20(TC干烤4h，去除RNA酶，冷卻；加入液氮中預(yù)冷，將組織從液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙將組織放入預(yù)先加入TRIzol試劑的勻漿器中，勻漿數(shù)分鐘；將勻漿后的液體轉(zhuǎn)入無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4°C離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4'C離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加異丙醇，4。C離心沉淀RNA;用75%乙醇洗滌沉淀2次；用無RNA酶的去離子水溶解沉淀。抽提的RNA質(zhì)量鑒定紫外分光光度計(jì)測定260/280比值(比值均在1. 7 2. 0);并在MOPS甲醛變性膠中觀察有無降解。
4. cDNA的合成
取總RNA2Pg，01igodT16 l叱，70。C保溫3min，立即冰上變性5min。加入5 X buffer,DTT和50mg/L的dNTP各2叱及l(fā)叱的逆轉(zhuǎn)錄酶，充分混勻后，42。C2h。模板使用終濃度通常為1 U g/100PU
75. RT-PCR擴(kuò)增
LOC255313 (F):上游引物為5' - TCTCACAACGACCACATCCTCA -3' (SEQ ID NO: 1); L0C255313 (R):下游引物為5， - CAGCATCTTGGGCCTCTTCATC -3， (SEQ ID N0:2); P-actin(F): 5' - CATCCTGCGTCTGGACCT -3， (SEQ ID NO:3);
actin(R): 5， - GTACTTGCGCTCAGGAGGAG -3，(SEQ ID NO:4)。 以e-actin作內(nèi)對照，反應(yīng)混合物中各成分為P-actin(F)、 e-actin(R)、 L0C255313 (F) 、 L0C255313 (R) 、 lOXBuffer、 MgC12、 dNTP、 Taq DNA聚合酶、cDNA 模板分別為0. 2、 0. 2、 0. 4、 0. 4、 1. 0、 1. 0、 0. 2、 0. 1和5叱,最后補(bǔ)充ddH20使反 應(yīng)體系為10叱。PCR的反應(yīng)條件如下94匸，5分鐘預(yù)變性；94°C， 30秒變性；55°C， 30秒退火；72°C， 30秒延伸；35個循環(huán)，電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
6. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，L0C255313基因在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織 中L0C255313基因的表達(dá)水平(見圖l)，差異率達(dá)95. 8%， L0C255313特異擴(kuò)增片斷 大小為391bp，內(nèi)參e-actin的產(chǎn)物片斷大小為490 bp，在圖1中，"N"指癌旁組織，
"C"指肝癌組織。
7. 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可通過RT-PCR診斷肝癌設(shè)計(jì)L0C255313基因的PCR引 物，檢測腫瘤組織中L0C255313基因RNA的含量，RNA含量高則說明患肝癌的可能性 高，反之則低。
實(shí)施例2實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)
采用相對定量法檢測LOC255313基因在肝癌樣本中的表達(dá)差異(Thermal Cycler DiceTM Real Time System TP800, Takara; SYBR Premix Ex TaqTM ，Takara)。實(shí) 時定量PCR檢測表明，L0C255313基因在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織中 的表達(dá)水平，經(jīng)t檢驗(yàn)，P〈0.01。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，可通過實(shí)時定量PCR診斷肝癌 設(shè)i十LOC255313基因的PCR引物，檢測腫瘤組織中L0C255313基因RNA的含量，RNA 含量高則說明患肝癌的可能性高，反之則低。
實(shí)施例3原位雜交
用L0C255313基因探針，與腫瘤切片進(jìn)行原位雜交，陽性雜交信號越強(qiáng)，患肝癌 的可能性越高。實(shí)驗(yàn)步驟為將肝臟腫瘤組織取材后OCT包埋、液氮速凍，恒冷箱冰 凍切片，該冰凍切片進(jìn)一步用于原位雜交。
實(shí)施例4免疫檢測1. 抗原蛋白獲得
(1) 利用基因工程表達(dá)可從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲得人LOC255313基因的cDNA 序列，通過PCR擴(kuò)增獲得編碼框，插入原核生物或真核生物表達(dá)載體中，表達(dá) L0C255313蛋白，并按基因工程表達(dá)產(chǎn)物的純化體系純化蛋白質(zhì)。
(2) 通過培養(yǎng)高表達(dá)L0C255313基因的人體來源細(xì)胞或組織，再分離純化 L0C255313蛋白。
2. 抗體制備
可采用以下幾種方法制備抗體
(1) 細(xì)胞融合法用上述制備的L0C255313蛋白免疫動物(包括兔子、山羊等)， 獲得脾臟細(xì)胞，再與骨髓瘤細(xì)胞融合，并按常規(guī)單克隆抗體制備技術(shù)制備單克隆抗體。
(2) 利用噬菌體表面展示庫，克隆免疫動物的脾臟IgG可變區(qū)并表達(dá)成基因工程 單克隆抗體。
(3) 利用純化的蛋白質(zhì)免疫動物，制備多抗血清。
3. 檢測
(1) 用制備的抗體(多抗或單抗)，用組織化學(xué)方法進(jìn)行肝癌的病理檢測，陽性 信號為肝癌。
(2) 取患者血清，用ELISA方法檢測，陽性反應(yīng)為肝癌可疑病人。
(3) 將L0C255313抗體作為蛋白質(zhì)芯片的探針之一，用于多種腫瘤診斷。 實(shí)施例5
用去甲基化藥物DAC (終濃度為2000nM)，處理15株肝癌細(xì)胞株后，使用基因芯片檢 測處理前后基因表達(dá)水平的差異，發(fā)現(xiàn)在8株細(xì)胞株中，LOC255313基因表達(dá)差異明顯。 其中，基因芯片實(shí)驗(yàn)主要包括如下四個步驟芯片制備、樣品制備、雜交反應(yīng)和信號檢 測以及結(jié)果分析。
1. 芯片制備目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體。通過點(diǎn)樣法將耙基因 作為探針按順序排列在載體上，靶基因可分為基因組DNA、 cDNA (或人工合成DNA)。
2. 樣品制備待測樣品中總RNA的抽提步驟如下分別取用去甲基化藥物DAC 處理的15株肝癌細(xì)胞株和15株未經(jīng)去甲基化處理的肝癌細(xì)胞株，再用TRIZol法抽 提總RNA。
提取的總RNA可進(jìn)一步用于樣品cDNA探針制備，其過程包括熒光探針的制備
9(cDNA第一鏈標(biāo)記)、純化和定量。定量后的探針吸回至1.5 ml離心管中，加熱抽 干，保存于-2(TC，待雜交。
3. 芯片雜交
取出經(jīng)定量的Cy3和Cy5標(biāo)記的探針，各用9 15y 1 ddH20充分溶解混合于 L5ml離心管內(nèi)，然后配制雜交液，Cy3/Cy5熒光標(biāo)記探針的雜交液由20X SSPE緩 沖液、50X Denhandts緩沖液和溶解有探針的ddH20組成，接著，取雜交液滴加在 芯片上，并蓋上蓋玻片。最后，將該雜交芯片放入加有PBS的雜交盒，置于42。C雜 交箱中雜交12 20小時。
4. 洗滌、掃描和數(shù)據(jù)分析芯片雜交反應(yīng)結(jié)束后，需進(jìn)行芯片洗滌。再通過特 定的掃描儀比如激光共聚焦掃描儀進(jìn)行掃描，掃描后將圖像轉(zhuǎn)化為基于熒光強(qiáng)度的數(shù) 字信號，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。由于樣本差異、熒光標(biāo)記效率和檢出率的不平衡， 需對原始提取信號進(jìn)行均衡和修正才能進(jìn)一歩分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。經(jīng)分析，由基因芯片檢 測肝癌及癌旁組織中L0C255313基因的表達(dá)差異，結(jié)果顯示L0C255313基因在肝癌組 織中表達(dá)顯著上調(diào)。
實(shí)施例6 肝癌細(xì)胞株模型的選擇
利用RT-PCR分析了約40個X染色體連鎖CT基因在17株肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況 (見圖2)，發(fā)現(xiàn)它們在其中兩細(xì)胞株(PLC, Focus)中均有表達(dá)，因此選擇這兩株細(xì)胞 系作為篩選模型。
肝癌細(xì)胞株Focus、 PLC由本實(shí)驗(yàn)室保種，復(fù)蘇后在含10%胎牛血清、200單位/ 毫升青霉素、200皮克/毫升鏈霉素的DMEM(GIBCO)培液中，5% C02、 37"C條件下培養(yǎng)， 以用于siRNA轉(zhuǎn)染。
實(shí)施例7基于肝癌細(xì)胞株P(guān)LC、Focus對X染色體連鎖CT基因進(jìn)行siRNA篩選
1.特異性針對候選基因siRNA的產(chǎn)生 為確保候選基因能夠在篩選體系中被高效剔除或沉默，針對每個候選基因的m脂A 序列(Refseq， NCBI GenBank)設(shè)計(jì)2 3 siRNA特異性片斷。針對X染色體連鎖的 CT基因共設(shè)計(jì)了 177條siRNAs。 siRNA的設(shè)計(jì)根據(jù)己發(fā)表的通用設(shè)計(jì)原則(Elbashir et. al 2001， Schwarz et. al 2003， Khvorova et. al 2003, Reynolds et. al 2004, Hsieh et.al 2004， Ui-Tei et. al 2004)，通過在線工具完成設(shè)計(jì)，該在線工具為siRNA Selection Program of Whitehead Institute (BingbingYuan et.al 2004，
10http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)禾口 BLOCK—iT RNAi Designer of 麗ITROGEN(winner of the 2004 Frost & Sull].van Excellence in Research Award, https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。為了進(jìn)一步提高siRNA片斷的有 效性，綜合兩個在線設(shè)計(jì)工具的優(yōu)點(diǎn)來設(shè)計(jì)用于篩選的siRNA片斷。最后，通過同源 性比對(NCBI BLAST)來過濾siRNA序列，以提高siRNA片斷的特異性并減少RNAi 干擾的脫靶效應(yīng)。SiRNA寡核苷酸由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司化學(xué)合成，由DEPC 處理過的RNase-free的雙蒸水溶解，溶度為20uM。兩條siRNA片斷作為陰性對照， 序列如下
S:5'CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT3' (SEQ ID NO:5)， AS: 5' UCGAAG畫UCCGCGUACGdTdT3' (SEQ ID NO: 6); S:5，UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT 3， (SEQ ID NO:7), AS:5' ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT 3' (SEQ ID NO:8)。
2. siRNA轉(zhuǎn)染和細(xì)胞增殖分析
如圖3所示，在96孔板中接種合適密度的肝癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前換成無血清的DMEM 培液，并且細(xì)胞密度不高于40%。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine 2000 (Invotrogen), 用Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基(Invotrogen)配置siRNA oligomer-Lipofectamine 2000復(fù)合物(轉(zhuǎn)染條件已優(yōu)化)，室溫放置30分鐘后加入細(xì)胞中，混勻，37。C培養(yǎng)4 6小時后換成含10%胎牛血清的DMEM培液。每條siRNA片斷轉(zhuǎn)染三復(fù)孔細(xì)胞，轉(zhuǎn)染實(shí) 驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)兩次。
轉(zhuǎn)染后細(xì)胞經(jīng)過3天培養(yǎng)，采用CCK-8 (cell counting kit_8,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑 盒，Dojindo)法分析細(xì)胞增殖狀態(tài)。力tUO ul CCK-8溶液/孔于96孔板后，37 °C， 5% C02培養(yǎng)2小時，通過溶液比色度分析來反映每孔活性細(xì)胞數(shù)；酶標(biāo)儀 (Bio-Tek，MQX200)在波長段450nm測定溶液的比色度，重復(fù)兩次讀數(shù)。
3. 數(shù)據(jù)分析
鑒于細(xì)胞RNAi干擾實(shí)驗(yàn)的變異和大規(guī)模實(shí)驗(yàn)時的操作誤差，采用必要的統(tǒng)計(jì)學(xué) 方法分析數(shù)據(jù)可提高篩選體系的可信度，降低篩選體系得出的假陽性率，因此在數(shù)據(jù) 分析時引入Z值(篩選系數(shù))和P值(T檢驗(yàn)可信度)。Z值是一個簡明的無自由度限 制的統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)，用于評估和調(diào)整任何篩選體系。Z=l-(3Ss+3Sc)/i us-y c I (Journal of Biomolecular Screening, 1999) ， S s:實(shí)驗(yàn)組siRNA標(biāo)準(zhǔn)差；S c:對照組siRNA標(biāo)準(zhǔn)差；y s:實(shí)驗(yàn)組siRNA均數(shù)；U C:對照組SiRNA均數(shù)；實(shí)驗(yàn)組SiRNA 和對照siRNA標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)進(jìn)行單側(cè)t檢驗(yàn)，求出P值。
將數(shù)據(jù)處理后，按上述方式算出統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)Z值和P值，認(rèn)為P<0. 05， Z〉l的si脂A 導(dǎo)致的表型有意義，并由此劃定陽性si脂A片斷。
針對L0C255313基因(Genbank No. NM—173571. 1 )設(shè)計(jì)的siRNA，算出的 P〈0.05，Z〉1，對表型有意義。L0C255313基因的陽性siRNA片斷之一是針對耙序列 AAATCCAGATGCCTGTGGGAATT(1150-1172)設(shè)計(jì)的siRNA,名稱為SI—105，其序列如下 S:5'AUCCAGAUGCCUGUGGGAAdTdT3， (SEQ ID N0:9) ， AS:5，UUCCCACAGGCAUCUGGAUdTdT 3' (SEQ ID NO: 10); LOC255313基因的另一陽性siRNA片斷是針對耙序列 ACAACGACCACATCCTCATAGAGAA(666-690)設(shè)計(jì)的siRNA，名稱為SI—106，其序列如下 S:5' ACAACGACCACAUCCUCAUAGAGAAdTdT3 ， (SEQ ID NO:11)， AS:5' UUCUCUAUGAGGAUGUG GUCG艦UdTdT 3， (SEQ ID NO: 12)。
4.驗(yàn)證L0C255313基因的陽性siRNA片斷對肝癌細(xì)胞生長效應(yīng)的影響 將L0C255313基因的陽性siRNA片斷單獨(dú)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)后，用CCK_8法計(jì)量活細(xì) 胞生長數(shù)，以天為間隔，連續(xù)測量五天，做出細(xì)胞的生長曲線。
結(jié)果顯示，針對L0C255313基因的siRNA，能使Focus、 PLC肝癌細(xì)胞的存活率 明顯低于對照組的細(xì)胞(見圖4)，說明人L0C255313基因的表達(dá)下調(diào)能在一定程度上 抑制肝癌細(xì)胞生長。
實(shí)施例8L0C255313抗原蛋白作為腫瘤疫苗的應(yīng)用
1.原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本在術(shù)中取材，術(shù)后均經(jīng)病理診斷確證。采用美國 PEL-FREEZA-SSP UNITRAY試劑盒對肝癌組織DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂 糖凝膠中電泳，根據(jù)電泳結(jié)果對細(xì)胞株HLA-A位點(diǎn)分型。
2. 總RNA的提取和c腿的合成利用Trizol試劑(Gibco BRL公司)提取肝癌組 織總RNA，溶于適量焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的超純水中并定量。取5ugRNA標(biāo)本， 用逆轉(zhuǎn)錄酶S叩erscript II合成c腿。
3. 抗原基因cDNA的PCR擴(kuò)增:總反應(yīng)體積為50ul。其中含2ulcDNA、 25pmol CT抗原基因L0C255313的引物。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
4. PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測序參照《分子克隆》(第3版)的方法。
5. DC(樹突狀細(xì)胞)的體外分離和培養(yǎng)患者外周靜脈血經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液Ficoll
12梯度離心后分離界面單個核細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)洗滌2次后，用無血清培養(yǎng)基AIM — V培養(yǎng) 液(Gibco BRL公司)懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度到3X106個/ml，接種入6孔培養(yǎng)板。在 37°C、 5%C02孵箱中培養(yǎng)過夜后，輕輕吹打懸浮細(xì)胞并回收凍存，用以制備效應(yīng)細(xì) 胞。在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)液中加入含1000U/ml粒單集落刺激因子和500U/ml白細(xì)胞介素 的AIM-V。培養(yǎng)至第7天時，收獲懸浮的DC。
6. 多肽合成L0C255313抗原多肽由多肽合成儀合成。T2細(xì)胞或HLA-A2的EBV (Epstein Barr Virus,非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒)轉(zhuǎn)染的人B淋巴細(xì)胞與終濃度為20ug/ml 的L0C255313抗原多肽共孵育4小時，洗滌后作為耙細(xì)胞。
7. 通過以下方式鑒定本發(fā)明治療肝癌的腫瘤CT抗原疫苗，通過DC遞呈 L0C255313抗原肽活化效應(yīng)T細(xì)胞，產(chǎn)生特異性針對L0C255313抗原表位的免疫應(yīng)答
(1) DC膜標(biāo)志的鑒定用熒光標(biāo)記抗體，HLA-DR(購自Pharmingen公司)檢測， 通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型。
(2) DC細(xì)胞的處理DC經(jīng)離心后重懸浮在2mlA頂-V中，并加入L0C255313抗 原肽至該多肽終濃度為40ug/ml。 37°C、 5% (302培養(yǎng)18小時，經(jīng)3000rad放射線照射 后，洗滌待用。
(3) 效應(yīng)細(xì)胞的制備非貼壁細(xì)胞復(fù)蘇后，與照射后的DC細(xì)胞以20: 1混合共 孵育6-7天，再按照相同比例加入DC， 6-7天后，再次重復(fù)刺激一次，作為效應(yīng)T細(xì) 胞。于O、 7、 10、 14、 19天，分別留取培養(yǎng)上清，用于細(xì)胞因子檢測。
(4) 細(xì)胞因子檢測采用細(xì)胞因子檢測試劑盒(購自美國Endogen公司)檢測 培養(yǎng)上清中分泌的細(xì)胞因子。
8. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)本發(fā)明L0C255313抗原肽剌激的DC所活化的效應(yīng)T細(xì)胞， 能產(chǎn)生特異性針對L0C255313抗原表位的免疫應(yīng)答，從而特異性殺傷結(jié)合有該相同 L0C255313抗原肽的靶細(xì)胞，說明本發(fā)明L0C255313抗原蛋白可以作為潛在的肝癌治 療性疫苗。
實(shí)施例9 以L0C255313基因表達(dá)產(chǎn)物為耙分子設(shè)計(jì)的基因治療 以L0C255313基因表達(dá)產(chǎn)物為靶分子，設(shè)計(jì)一種攜帶某基因的表達(dá)載體，導(dǎo)入該
載體，其產(chǎn)物對LOC255313基因的表達(dá)有抑制作用，或?qū)0C255313蛋白活性有抑制作用。序歹'J 表
<110>上海人類基因組研究中心
〈120〉 LOC255313基因的應(yīng)用
〈130〉 NP-08-12165
〈160〉 12
<170〉 Patentln version 3. 3
<210〉 1
〈211〉 22
<212> 腿 〈213〉人工序列
<220>
〈221> misc_feature
〈222〉 (1)..(22)
<223〉 引物
〈400〉 1
tctcacaacg accacatcct ca 22
<210〉 2
〈211〉 22
<212〉 腿 <213〉人工序列
<220>
<221> misc—feature
〈222〉 (1)..(22)
〈223〉 引物
<400> 2
cagcatcttg ggcctcttca tc 22
<210> 3
〈211> 18
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
〈220>
〈221> misc—feature
《222> (1)..(18)
〈223〉 引物
14〈400〉 3
catcctgcgt ctggacct
〈210〉 4
<211〉 20
〈212> DNA
〈213> 人工序列
〈220〉
<221> misc—feature
〈222〉 (1).. (20)
〈223〉 引物
〈400〉 4
gtacttgcgc tcaggaggag
〈210〉 〈211〉 〈212〉 〈213〉
<220> <221> 〈222> <223>
5
21 腿
人工序列
misc—RNA (1)…(21) si腿
<400> 5
cguacgcgga auacuucgat t
<210〉 〈211〉 <212> 〈213>
<220> 〈221〉 <222> 〈223〉
6
21
RNA
人工序列
misc—腿 (21)
si腿
<400〉 6
ucgaaguauu ccgcguacgt t
〈210〉 7 〈211> 21
18
20
21
21〉人工序列
〈220〉
<221〉 misc—RNA
<222〉 (1)..(21)
〈223〉 siRNA
〈400〉 7
uucuccgaac gugucacgut t 21
〈210〉 8
〈211〉 21
<212〉 RNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈221> misc一腿
〈222〉 (1).. (21)
〈223〉 siRNA
〈400〉 8
acgugacacg uucggagaat t 21
〈210〉 9
〈211〉 21
<212〉 認(rèn)A 〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉 misc_RNA
〈222〉 (1)..(21)
<223〉 siRNA
〈400〉 9
auccagaugc cugugggaat t 21
〈210〉 10
〈211〉 21
〈212> RNA
〈213〉人工序列 <220>
<221> misc廳
16<222> (1).. (21)
<223〉 si腿
<400〉 10
uucccacagg caucuggaut t 21
〈210〉 11
<211> 27
〈212> RNA <213〉人工序列
〈220〉
〈221〉 misc_RNA
〈222> (1)..(27)
〈223〉 siRNA
<400〉 11
acaacgacca cauccucaua gagaatt 27
〈210〉 12
<211> 27
〈212〉 RNA <213〉人工序列
〈220〉
〈221> misc—RNA
〈222> (1)..(27)
〈223〉 si腿
〈400〉 12
uucucuauga ggaugugguc g而gutt 2權(quán)利要求
1.一種LOC255313基因的應(yīng)用，其特征在于，所述LOC255313基因在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR、 實(shí)時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少 包括一對特異擴(kuò)增L0C255313基因的引物。
4. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用實(shí)時定量PCR診斷肝癌的產(chǎn) 品至少包括一對特異擴(kuò)增L0C255313基因的引物。
5. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用免疫檢測診斷肝癌的產(chǎn)品包 括與L0C255313蛋白特異性結(jié)合的抗體。
6. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用原位雜交診斷肝癌的產(chǎn)品包 括與L0C255313基因的核酸序列雜交的探針。
7. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品包 括與LOC255313基因的核酸序列雜交的探針。
8. —種L0C255313基因的應(yīng)用，其特征在于，所述L0C255313基因在制備治療 肝癌的藥物中的應(yīng)用。
9. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述治療肝癌的藥物包括通過RNA 干擾抑制L0C255313基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸，或基于L0C255313抗原蛋白的腫瘤疫 苗，或用于抑制L0C255313蛋白活性的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種LOC255313基因的應(yīng)用，用于制備診斷肝癌的產(chǎn)品和制備治療肝癌的藥物。本發(fā)明的LOC255313基因，可作為診斷肝癌的特異標(biāo)志基因，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快速，且為防治肝癌提供了新的治療靶點(diǎn)和有效新藥。
文檔編號C12Q1/68GK101492713SQ20081004304
公開日2009年7月29日 申請日期2008年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月21日
發(fā)明者慶 鄧, 韓澤廣, 健 黃 申請人:上海人類基因組研究中心