專利名稱：Magea1基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因，尤其涉及一種MAGEA1基因的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，是我國位居第二的癌癥"殺手"，常見于中年 男性。因其惡性度高、病情進(jìn)展快，病人早期一般沒有什么不適， 一旦出現(xiàn)癥狀就診， 往往已屬中晚期。故治療難度大、療效差， 一般發(fā)病后生存時(shí)間僅為6個(gè)月，人稱"癌 中之王"。因此，提高肝癌早期診斷水平、選擇科學(xué)合理的治療方法和采取有效的預(yù) 防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移措施將是改變這種局面的三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
目前診斷原發(fā)性肝癌最重要的腫瘤標(biāo)志物是甲胎球蛋白(AFP)，但在我國原發(fā)性 肝癌患者中，血清AFP水平高于正常值者只占60X 70X;其中只有約32%的患者 血清AFP水平能達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn)(>400yg/L)，其余均為低濃度陽性。此外，部分肝 炎、肝硬變等非肝癌患者的血清AFP水平也可異常升高。這些都影響了 AFP這一指標(biāo) 的診斷特異性。因此，有待開發(fā)新的特異性腫瘤標(biāo)記物，以提高原發(fā)性肝癌的診斷水 平。
此外，由于我國肝癌患者多合并嚴(yán)重的肝硬化，且易肝內(nèi)播散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使手 術(shù)切除受到很大限制，而且放化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞和免疫系統(tǒng)也 有破壞和抑制作用。因此，治療肝癌除了傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療方式外，還需要腫 瘤治療疫苗的輔助治療。
CT (Cancer-testis，腫瘤一睪丸)抗原，又稱腫瘤共享抗原， 一般在正常組織 中不表達(dá)，但在人生殖細(xì)胞系正常表達(dá)，在多種不同類型的腫瘤中也均有表達(dá)，包括 黑色素瘤，膀胱癌，肺癌，肝癌等，這些具有免疫原性的蛋白正在被積極發(fā)展為腫瘤 治療疫苗的靶點(diǎn)。目前為止己有多達(dá)80多個(gè)CT抗原家族被鑒定。CT抗原在腫瘤形成 中的作用也正在受到進(jìn)一步評(píng)估，精子發(fā)生過程中的部分基因表達(dá)程序在腫瘤發(fā)生時(shí) 重新開放，可能有助于惡性腫瘤的表型特征一永生化，侵襲性，免疫逃逸，基因組低 甲基化和轉(zhuǎn)移能力。
CT抗原根據(jù)編碼它們基因的染色體定位可分為X染色體連鎖CT抗原(X-CT)和常染色體(non-X CT)即非X染色體連鎖抗原。在正常睪丸中X染色體連鎖的CT抗 原通常在精原細(xì)胞中表達(dá)，而精原細(xì)胞是在睪丸中保持不斷增殖的一類生殖干細(xì)胞。 由于生殖干細(xì)胞、發(fā)生于胚胎滋養(yǎng)層的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞有著許多共有的特征，在已知 癌基因和抑癌基因無突變的情況下，原本已沉默的生殖細(xì)胞系特異性表達(dá)基因在腫瘤 干細(xì)胞中被激活后可以調(diào)節(jié)腫瘤的惡性表型。值得強(qiáng)調(diào)的是，據(jù)估計(jì)X染色體上約有 10呢的基因?qū)儆赬染色體連鎖CT基因。因此，選取X染色體連鎖的CT基因?yàn)閷?duì)象研 究其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。
人MAGEA1基因(Genbank No.麗—004988. 3)是CT抗原家族的成員之一。關(guān)于 MAGEA1基因與肝癌發(fā)生的關(guān)系尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種MAGEA1基因的應(yīng)用，該MAGEA1基因可 作為肝癌診斷的標(biāo)記分子，提高了肝癌診斷的準(zhǔn)確性。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種MAGEA1基因在制備治療肝癌的藥物中 的應(yīng)用，使腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移得到有效控制。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種MAGEA1基因在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。 所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或
基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品。
在本發(fā)明中，所述用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增MAGEA1基
因的引物。
所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增MAGEA1基因的引物。
所述用免疫檢測(cè)診斷肝癌的產(chǎn)品包括與MAGEA1蛋白特異性結(jié)合的抗體，包括 多克隆抗體和單克隆抗體。
所述用原位雜交診斷肝癌的產(chǎn)品包括與MAGEA1基因的核酸序列雜交的探針。 所述用基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品包括與MAGEA1基因的核酸序列雜交的探針。 在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對(duì)MAGEA1蛋白特異的 抗體。例如，將提純的人MAGEA1基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動(dòng)物體內(nèi)以產(chǎn)生多 克隆抗體。同樣，表達(dá)人MAGEA1蛋白或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來對(duì)動(dòng)物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜 交瘤技術(shù)制備(例如，Kohleretal.， Nature 256: 495， 1975; Kohler et al. ， Eur. J. Immunol. 6: 511， 1976; Kohler et al. ， Eur. J. Immunol. 6: 292， 1976)。 本發(fā)明的抗體包括可以阻抑MAGEA1功能的抗體，也可以是不影響人MAGEA1功能的抗 體。每一類抗體都可以通過對(duì)人MAGEA1基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而 人MAGEA1基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修 飾形式的MAGEA1基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以利用在原核細(xì)胞例如￡ 中產(chǎn)生的基 因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化MAGEA1蛋白或多肽 結(jié)合的抗體，可以利用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而 得到。
在本發(fā)明中，所述探針可以是DNA、 RNA、 DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。 所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任 何長度都可以。所述探針的長度可短至25、 20、 15、 13或10個(gè)堿基長度。同樣，所 述探針的長度可長至60、 80、 100、 150、 300個(gè)堿基對(duì)或更長，甚至整個(gè)基因。由于 不同的探針長度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是 14個(gè)堿基對(duì)，最長一般不超過30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長度以15-25 個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種MAGEA1基因在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
所述治療肝癌的藥物包括通過RNA干擾抑制MAGEA1基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸， 或基于MAGEA1抗原蛋白的腫瘤疫苗，或用于抑制MAGEA1蛋白活性的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明中，所述RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度 保守的、由雙鏈RNA (double-stranded RNA， dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性 降解的現(xiàn)象。使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，該技術(shù)已被廣 泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。以細(xì)胞為基礎(chǔ)的RNAi 篩選在功能基因?qū)W研究方面具有許多優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)在大多數(shù)細(xì)胞類型都能使用RNAi 方法，并且相對(duì)較容易下調(diào)或沉默任何目的基因的表達(dá)。
在本發(fā)明中，所述腫瘤疫苗是指用腫瘤組織中的特殊物質(zhì)來激發(fā)患者體內(nèi)的免疫
功能，使患者的免疫功能能夠殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤疫苗主要指治療性疫苗，是在病人 得病后再用疫苗的方法進(jìn)行治療，以控制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。腫瘤疫苗具有個(gè)體性，
5因?yàn)槊恳粋€(gè)病人所得的腫瘤類型、分期都不一樣，腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的物質(zhì)也不同，而 腫瘤疫苗又是由病人本身的腫瘤制成，因此針對(duì)患者具體的腫瘤制備的腫瘤疫苗具有 個(gè)體化特征，其副作用小，針對(duì)性強(qiáng)。
所述腫瘤疫苗制備時(shí)，用手術(shù)方法切取腫瘤患者的腫瘤組織并無菌冷凍保存，以 提取腫瘤抗原。本發(fā)明的MAGEA1抗原蛋白可作為腫瘤抗原被提取。獲得腫瘤抗原是 第一步，接著要獲得樹突狀細(xì)胞，即從病人血液的單個(gè)核細(xì)胞中獲得。采出單個(gè)核細(xì) 胞后再進(jìn)行篩選和體外培養(yǎng)，然后用腫瘤抗原MAGEA1在體外刺激樹突狀細(xì)胞，使該 樹突狀細(xì)胞能夠傳遞免疫信息，最后將訓(xùn)練好的樹突狀細(xì)胞回輸?shù)襟w內(nèi)，使體內(nèi)產(chǎn)生 針對(duì)腫瘤抗原MAGEA1的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明治療肝癌的藥物施用方式可以是口服、全身施用(例如，透過皮膚、鼻 吸入或者用栓劑)或腸胃外施用(例如，肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)。
本發(fā)明的藥物也可被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的 水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制 備。針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明區(qū)GEA1基因在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，因此 MAGEA1基因可作為診斷肝癌的特異標(biāo)志基因，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快速。本發(fā)明 MAGEA1基因?yàn)榉乐胃伟┨峁┝诵碌闹委煱尹c(diǎn)和有效新藥。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1通過RT-PCR驗(yàn)證MAGEA1基因在人肝癌組織和癌旁組織中 的差異表達(dá)圖2是本發(fā)明實(shí)施例6通過RT-PCR分析X染色體連鎖CT基因在肝癌細(xì)胞中的表 達(dá)圖3是本發(fā)明實(shí)施例7對(duì)MAGEA1基因進(jìn)行siRNA實(shí)驗(yàn)的流程圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條 件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989〉中所述的條件，或按照制造廠商所建議 的條件。實(shí)施例1
RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MAGEA1基因在肝癌組織中的表達(dá)情況。
1. 組織分離(Tissue isolation)
實(shí)驗(yàn)用組織來源于72例HBV陽性并表達(dá)甲胎蛋白的原發(fā)性肝癌的手術(shù)病人 (RT-PCR證實(shí)AFP在肝癌均為陽性而癌旁為陰性)。手術(shù)切除的肝臟一經(jīng)離體，迅速切 取病灶及周圍5公分外癌旁組織，放入液氮中(一80'C)保存。癌和癌旁的診斷均以 病理診斷為最終依據(jù)。
2. 總RNA的抽提試劑盒
抽提RNA試劑采用TRIzol reagent (GIBC0/BRL)，該試劑是基于酸性酚一步抽提 法生產(chǎn)的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要進(jìn)行無RNA酶處理，以保證實(shí)驗(yàn)中無RNA 酶的環(huán)境。
3. RNA的抽提步驟
將碾杵和勻漿器等器皿在20(TC干烤4h，去除RNA酶，冷卻；加入液氮中預(yù)冷， 將組織從液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙將組織放入預(yù)先加入TRIzol試劑的勻 漿器中，勻漿數(shù)分鐘；將勻漿后的液體轉(zhuǎn)入無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4°C 離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4。C離心分層；將 上層水相轉(zhuǎn)入一無脂A酶的離心管中，加異丙醇，4T:離心沉淀RNA;用75%乙醇洗 滌沉淀2次；用無RNA酶的去離子水溶解沉淀。抽提的RNA質(zhì)量鑒定紫外分光光度 計(jì)測(cè)定260/280比值(比值均在1. 7 2. 0);并在MOPS甲醛變性膠中觀察有無降解。
4. cDNA的合成
取總RNA2^g， 01igodT16 l叱，70。C保溫3min，立即冰上變性5min。加入5X buffer, DTT和50mg/L的dNTP各2叱及l(fā)叱的逆轉(zhuǎn)錄酶，充分混勻后，42°C2h。模板使用終 濃度通常為lu g/100叱。
5. RT-PCR擴(kuò)增
MAGEA1 (F):上游引物為5， - GCCTTTCCCACTACCATCAACT -3， (SEQ ID N0:1); MAGEA1 (R):下游引物為5， - TCCCATCATACACCTCCATCAC -3， (SEQ ID NO:2); e-actin(F): 5， - CATCCTGCGTCTGGACCT -3， (SEQ ID NO:3);
e-actin(R): 5， - GTACTTGCGCTCAGGAGGAG _3'(SEQ ID NO:4)。
以e-actin作內(nèi)對(duì)照，反應(yīng)混合物中各成分為e-actin(F)、 e-actin(R)、
MAGEA1 (F)、 MAGEA1 (R) 、 10XBuffer、 MgC12、 dNTP、 Taq DNA聚合酶、cDNA模板分別為0.2、 0.2、 0.4、 0.4、 1.0、 1.0、 0.2、 0. 1和5叱，最后補(bǔ)充ddH20使反應(yīng)體 系為10叱。PCR的反應(yīng)條件如下94。C，5分鐘預(yù)變性；94°C， 30秒變性；55°C， 30 秒退火；72°C， 30秒延伸；35個(gè)循環(huán)，電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
6. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MAGEAl基因在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織中 MAGEAl基因的表達(dá)水平(見圖1)，差異率達(dá)79. 2%，MAGEAl特異擴(kuò)增片斷大小為493bp， 內(nèi)參0-actin的產(chǎn)物片斷大小為490 bp，在圖1中，"N"指癌旁組織，"C"指肝癌 組織。
7. 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可通過RT-PCR診斷肝癌設(shè)計(jì)MAGEAl基因的PCR引物， 檢測(cè)腫瘤組織中MAGEAl基因RNA的含量，RNA含量高則說明患肝癌的可能性高，反之 則低。
實(shí)施例2實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)
采用相對(duì)定量法檢測(cè)MAGEAl基因在肝癌樣本中的表達(dá)差異(Thermal Cycler DiceTM Real Time System TP800, Takara; SYBR Premix Ex TaqTM ， Takara)。實(shí) 時(shí)定量PCR檢測(cè)表明，MAGEAl基因在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織中的表 達(dá)水平，經(jīng)t檢驗(yàn)，P<0.01。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，可通過實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌設(shè)計(jì) MAGEAl基因的PCR引物，檢測(cè)腫瘤組織中MAGEAl基因RNA的含量，RNA含量高則說 明患肝癌的可能性高，反之則低。
實(shí)施例3原位雜交
用MAGEAl基因探針，與腫瘤切片進(jìn)行原位雜交，陽性雜交信號(hào)越強(qiáng)，患肝癌的 可能性越高。實(shí)驗(yàn)步驟為將肝臟腫瘤組織取材后OCT包埋、液氮速凍，恒冷箱冰凍 切片，該冰凍切片進(jìn)一步用于原位雜交。
實(shí)施例4免疫檢測(cè)
1. 抗原蛋白獲得
(1) 利用基因工程表達(dá)可從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲得人MAGEAl基因的cDNA序列， 通過PCR擴(kuò)增獲得編碼框，插入原核生物或真核生物表達(dá)載體中，表達(dá)MAGEAl蛋白， 并按基因工程表達(dá)產(chǎn)物的純化體系純化蛋白質(zhì)。
(2) 通過培養(yǎng)高表達(dá)區(qū)GEA1基因的人體來源細(xì)胞或組織，再分離純化MAGEAl蛋白。
2. 抗體制備
8可采用以下幾種方法制備抗體
(1) 細(xì)胞融合法用上述制備的MAGEA1蛋白免疫動(dòng)物(包括兔子、山羊等)，獲 得脾臟細(xì)胞，再與骨髓瘤細(xì)胞融合，并按常規(guī)單克隆抗體制備技術(shù)制備單克隆抗體。
(2) 利用噬菌體表面展示庫，克隆免疫動(dòng)物的脾臟IgG可變區(qū)并表達(dá)成基因工程
單克隆抗體。
(3) 利用純化的蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物，制備多抗血清。 3.檢測(cè)
(1) 用制備的抗體(多抗或單抗)，用組織化學(xué)方法進(jìn)行肝癌的病理檢測(cè)，陽性 信號(hào)為肝癌。
(2) 取患者血清，用ELISA方法檢測(cè)，陽性反應(yīng)為肝癌可疑病人。
(3) 將MAGEA1抗體作為蛋白質(zhì)芯片的探針之一，用于多種腫瘤診斷。 實(shí)施例5
用去甲基化藥物DAC (終濃度為2000nM),處理15株肝癌細(xì)胞株后，使用基因芯片檢 測(cè)處理前后基因表達(dá)水平的差異，發(fā)現(xiàn)在8株細(xì)胞株中，MAGEA1基因表達(dá)差異明顯。其 中，基因芯片實(shí)驗(yàn)主要包括如下四個(gè)步驟芯片制備、樣品制備、雜交反應(yīng)和信號(hào)檢測(cè) 以及結(jié)果分析。
1. 芯片制備目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體。通過點(diǎn)樣法將靶基因 作為探針按順序排列在載體上，靶基因可分為基因組DNA、 cDNA (或人工合成DNA)。
2. 樣品制備待測(cè)樣品中總RNA的抽提步驟如下分別取用去甲基化藥物DAC 處理的15株肝癌細(xì)胞株和15株未經(jīng)去甲基化處理的肝癌細(xì)胞株，再用TRIZol法抽 提總RNA。
提取的總RNA可進(jìn)一步用于樣品cDNA探針制備，其過程包括熒光探針的制備 (cDNA第一鏈標(biāo)記)、純化和定量。定量后的探針吸回至1.5 ml離心管中，加熱抽 干，保存于-20'C，待雜交。
3. 芯片雜交
取出經(jīng)定量的Cy3和Cy5標(biāo)記的探針，各用9 15y 1 ddH20充分溶解混合于 1.5ml離心管內(nèi)，然后配制雜交液，Cy3/Cy5熒光標(biāo)記探針的雜交液由20X SSPE緩 沖液、50X Denhandts緩沖液和溶解有探針的ddH20組成，接著，取雜交液滴加在 芯片上，并蓋上蓋玻片。最后，將該雜交芯片放入加有PBS的雜交盒，置于42'C雜
9交箱中雜交12 20小時(shí)。
4.洗滌、掃描和數(shù)據(jù)分析芯片雜交反應(yīng)結(jié)束后，需進(jìn)行芯片洗滌。再通過特 定的掃描儀比如激光共聚焦掃描儀進(jìn)行掃描，掃描后將圖像轉(zhuǎn)化為基于熒光強(qiáng)度的數(shù) 字信號(hào)，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。由于樣本差異、熒光標(biāo)記效率和檢出率的不平衡， 需對(duì)原始提取信號(hào)進(jìn)行均衡和修正才能進(jìn)一步分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。經(jīng)分析，由基因芯片檢 測(cè)肝癌及癌旁組織中MAGEA1基因的表達(dá)差異，結(jié)果顯示MAGEA1基因在肝癌組織中表 達(dá)顯著上調(diào)。
實(shí)施例6 肝癌細(xì)胞株模型的選擇
利用RT-PCR分析了約40個(gè)X染色體連鎖CT基因在17株肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況 (見圖2)，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谄渲袃杉?xì)胞株(PLC， Focus)中均有表達(dá)，因此選擇這兩株細(xì)胞 系作為篩選模型。
肝癌細(xì)胞株Focus、 PLC由本實(shí)驗(yàn)室保種，復(fù)蘇后在含10%胎牛血清、200單位/ 毫升青霉素、200皮克/毫升鏈霉素的DMEM(GIBCO)培液中，5% C02、 37'C條件下培養(yǎng)， 以用于siRNA轉(zhuǎn)染。
實(shí)施例7基于肝癌細(xì)胞株P(guān)LC、Focus對(duì)X染色體連鎖CT基因進(jìn)行siRNA篩選 1.特異性針對(duì)候選基因siRNA的產(chǎn)生 為確保候選基因能夠在篩選體系中被高效剔除或沉默，針對(duì)每個(gè)候選基因的mRNA 序列(Refseq， NCBI GenBank)設(shè)計(jì)2 3 siRNA特異性片斷。針對(duì)X染色體連鎖的 CT基因共設(shè)計(jì)了 177條siRNAs。 siRNA的設(shè)計(jì)根據(jù)已發(fā)表的通用設(shè)計(jì)原則(Elbashir et. al 2001， Schwarz et. al 2003， Khvorova et. al 2003， Reynolds et. al 2004， Hsieh et.al 2004， Ui-Tei et. al 2004)，通過在線工具完成設(shè)計(jì)，該在線工具為siRNA Selection Program of Whitehead Institute (BingbingYuan et.al 2004， http://jura.wi. mit. edu/bioc/siRNAext/)和 BLOCK—iT RNAi Designer of INVITR0GEN(winner of the 2004 Frost & Sullivan Excellence in Research Award, https://rnaidesigner.invitrogen.cora/sirna/)。 為了進(jìn)一步提高siRNA片斷的有 效性，綜合兩個(gè)在線設(shè)計(jì)工具的優(yōu)點(diǎn)來設(shè)計(jì)用于篩選的siRNA片斷。最后，通過同源 性比對(duì)(NCBI BLAST)來過濾siRNA序列，以提高siRNA片斷的特異性并減少RNAi 干擾的脫靶效應(yīng)。SiRNA寡核苷酸由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司化學(xué)合成，由DEPC 處理過的RNase-free的雙蒸水溶解，溶度為20 y M。兩條siRNA片斷作為陰性對(duì)照，序列如下
S:5，CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT3' (SEQ ID NO:5)， AS:5'UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT3' (SEQ ID NO:6); S:5'UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT 3' (SEQ ID NO:7)， AS:5' ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT 3， (SEQ ID NO:8)。
2. siRNA轉(zhuǎn)染和細(xì)胞增殖分析
如圖3所示，在96孔板中接種合適密度的肝癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前換成無血清的DMEM 培液，并且細(xì)胞密度不高于40°/。。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipof ectamine 2000 (Invotrogen)， 用Opt i-MEM I低血清培養(yǎng)基(Invotrogen)配置siRNA oligomer-Lipof ectamine 2000復(fù)合物(轉(zhuǎn)染條件已優(yōu)化)，室溫放置30分鐘后加入細(xì)胞中，混勻，37i:培養(yǎng)4 6小時(shí)后換成含10%胎牛血清的服EM培液。每條siRNA片斷轉(zhuǎn)染三復(fù)孔細(xì)胞，轉(zhuǎn)染實(shí) 驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)兩次。
轉(zhuǎn)染后細(xì)胞經(jīng)過3天培養(yǎng)，采用CCK-8 (cell counting kit_8，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑 盒，Dojindo)法分析細(xì)胞增殖狀態(tài)。力tl 10 yl CCK-8溶液/孔于96孔板后，37 °C, 5% C02培養(yǎng)2小時(shí)，通過溶液比色度分析來反映每孔活性細(xì)胞數(shù)；酶標(biāo)儀 (Bio-Tek，MQX200)在波長段450nm測(cè)定溶液的比色度，重復(fù)兩次讀數(shù)。
3. 數(shù)據(jù)分析
鑒于細(xì)胞RNAi干擾實(shí)驗(yàn)的變異和大規(guī)模實(shí)驗(yàn)時(shí)的操作誤差，采用必要的統(tǒng)計(jì)學(xué) 方法分析數(shù)據(jù)可提高篩選體系的可信度，降低篩選體系得出的假陽性率，因此在數(shù)據(jù) 分析時(shí)引入Z值(篩選系數(shù))和P值(T檢驗(yàn)可信度)。Z值是一個(gè)簡明的無自由度限 制的統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)，用于評(píng)估和調(diào)整任何篩選體系。Z=1-(3SS+3SC)/| u s-y c I (Journal of Biomolecular Screening, 1999) ， S s:實(shí)驗(yàn)組siRNA標(biāo)準(zhǔn)差；S c: 對(duì)照組siRNA標(biāo)準(zhǔn)差；u s:實(shí)驗(yàn)組siRNA均數(shù)；u c:對(duì)照組siRNA均數(shù)；實(shí)驗(yàn)組si謂A 和對(duì)照siRNA標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)進(jìn)行單側(cè)t檢驗(yàn)，求出P值。
將數(shù)據(jù)處理后，按上述方式算出統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)Z值和P值，認(rèn)為P〈0. 05， Z〉l的siRNA 導(dǎo)致的表型有意義，并由此劃定陽性siRNA片斷。
4. 驗(yàn)證MAGEA1基因的陽性siRNA片斷對(duì)肝癌細(xì)胞生長效應(yīng)的影響
將MAGEA1基因的陽性siRNA片斷單獨(dú)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)后，用CCK-8法計(jì)量活細(xì)胞 生長數(shù)，以天為間隔，連續(xù)測(cè)量五天，做出細(xì)胞的生長曲線。
11結(jié)果顯示，針對(duì)MAGEAl基因的siRNA，能使Focus、 PLC肝癌細(xì)胞的存活率明顯 低于對(duì)照組的細(xì)胞，說明人MAGEAl基因的表達(dá)下調(diào)能在一定程度上抑制肝癌細(xì)胞生 長。
實(shí)施例8MAGEAl抗原蛋白作為腫瘤疫苗的應(yīng)用
1.原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本在術(shù)中取材，術(shù)后均經(jīng)病理診斷確證。采用美國 PEL-FREEZA-SSP UNITRAY試劑盒對(duì)肝癌組織DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂 糖凝膠中電泳，根據(jù)電泳結(jié)果對(duì)細(xì)胞株HLA-A位點(diǎn)分型。
2. 總RNA的提取和cDNA的合成利用Trizol試劑(Gibco BRL公司)提取肝癌組 織總RNA，溶于適量焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的超純水中并定量。取5ug脂A標(biāo)本， 用逆轉(zhuǎn)錄酶Superscript II合成c腿。
3. 抗原基因cDNA的PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體積為50ul。其中含2ylcDNA、 25pmo1 CT抗原基因MAGEAl的引物。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
4. PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測(cè)序參照《分子克隆》(第3版)的方法。
5. DC(樹突狀細(xì)胞)的體外分離和培養(yǎng)患者外周靜脈血經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液Ficoll 梯度離心后分離界面單個(gè)核細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)洗滌2次后，用無血清培養(yǎng)基AIM—V培養(yǎng) 液(Gibco BRL公司)懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度到3X106個(gè)/ml，接種入6孔培養(yǎng)板。在 37°C、 5%C02孵箱中培養(yǎng)過夜后，輕輕吹打懸浮細(xì)胞并回收凍存，用以制備效應(yīng)細(xì) 胞。在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)液中加入含1000U/ml粒單集落刺激因子和500U/ml白細(xì)胞介素 的AIM-V。培養(yǎng)至第7天時(shí)，收獲懸浮的DC。
6. 多肽合成區(qū)GEA1抗原多肽由多肽合成儀合成。T2細(xì)胞或HLA-A2的EBV (Epstein Barr Virus,非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒)轉(zhuǎn)染的人B淋巴細(xì)胞與終濃度為20ug/ml 的MAGEAl抗原多肽共孵育4小時(shí)，洗滌后作為靶細(xì)胞。
7. 通過以下方式鑒定本發(fā)明治療肝癌的腫瘤CT抗原疫苗，通過DC遞呈MAGEAl 抗原肽活化效應(yīng)T細(xì)胞，產(chǎn)生特異性針對(duì)MAGEAl抗原表位的免疫應(yīng)答
(1) DC膜標(biāo)志的鑒定用熒光標(biāo)記抗體，HLA-DR(購自Pharmingen公司)檢測(cè)， 通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型。
(2) DC細(xì)胞的處理DC經(jīng)離心后重懸浮在2mlAIM-V中，并加入MAGEAl抗原肽 至該多肽終濃度為40ug/ml。 37°C、 5% 0)2培養(yǎng)18小時(shí)，經(jīng)3000rad放射線照射后， 洗滌待用。(3) 效應(yīng)細(xì)胞的制備非貼壁細(xì)胞復(fù)蘇后，與照射后的DC細(xì)胞以20: l混合共
孵育6-7天，再按照相同比例加入DC， 6-7天后，再次重復(fù)刺激一次，作為效應(yīng)T細(xì) 胞。于0、 7、 10、 14、 19天，分別留取培養(yǎng)上清，用于細(xì)胞因子檢測(cè)。
(4) 細(xì)胞因子檢測(cè)采用細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(購自美國Endogen公司)檢測(cè) 培養(yǎng)上清中分泌的細(xì)胞因子。
8.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)本發(fā)明MAGEA1抗原肽刺激的DC所活化的效應(yīng)T細(xì)胞，能產(chǎn) 生特異性針對(duì)MAGEA1抗原表位的免疫應(yīng)答，從而特異性殺傷結(jié)合有該相同MAGEA1抗 原肽的靶細(xì)胞，說明本發(fā)明MAGEA1抗原蛋白可以作為潛在的肝癌治療性疫苗。 實(shí)施例9 以MAGEA1基因表達(dá)產(chǎn)物為靶分子設(shè)計(jì)的基因治療 以MAGEA1基因表達(dá)產(chǎn)物為靶分子，設(shè)計(jì)一種攜帶某基因的表達(dá)載體，導(dǎo)入該載 體，其產(chǎn)物對(duì)MAGEA1基因的表達(dá)有抑制作用，或?qū)AGEA1蛋白活性有抑制作用。
13〈110〉上海人類基因組研究中心
<120〉 MAGEAl基因的應(yīng)用
<130〉 NP-08-12187
<160〉 8
〈170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 22
<212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
<221〉 misc—feature
<222> (1).. (22)
〈223〉 引物
〈400〉 1
gcctttccca ctaccatcaa ct 22
〈210> 2
〈211〉 22
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220>
<221> misc一feature
<222> (1)..(22)
〈223> 引物
〈400〉 2
tcccatcata cacctccatc ac 22
<210> 3
<211> 18
<212> DNA 〈213〉人工序列
<220〉
<221> misc一feature
〈222> (1)..(18)
〈223> 引物〈400〉 3
catcctgcgt ctggacct
〈210〉 4
<211〉 20
〈212〉 DNA 〈213>人工序列
〈220〉
<221> misc—feature
〈222〉 (1)..(20)
<223> 引物
〈400〉 4
gtacttgcgc tcaggaggag
〈210〉 〈211〉 〈212〉 <213>
〈220〉 〈221> 〈222〉 <223>
5
21 腿
人工序列
misc_RNA (l).. (21) si RNA
〈400〉 5
cguacgcgga auacuucgat t
<210> <211〉 〈212〉 〈213〉
〈220〉 〈221〉 <222〉 <223>
6
21
RNA
人工序列
misc一RNA (l).. (21) siRNA
<400〉 6
ucgaaguauu ccgcguacgt t
<210〉 7 <211> 21
18
20
21
21〈212〉 RNA 〈213〉人工序列
〈220〉
<221> misc—RNA
〈222〉 (1)..(21)
〈223〉 siRNA
<400〉 7
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210〉 8
〈211〉 21
〈212〉 RNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈221> misc_RNA
〈222〉 (1)..(21)
〈223〉 siRNA
〈400〉 8
acgugacacg uucggagaat t 2權(quán)利要求
1.一種MAGEA1基因的應(yīng)用，其特征在于，所述MAGEA1基因在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括:用RT-PCR、 實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少 包括一對(duì)特異擴(kuò)增MAGEA1基因的引物。
4. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌的產(chǎn) 品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增MAGEA1基因的引物。
5. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用免疫檢測(cè)診斷肝癌的產(chǎn)品包 括與MAGEA1蛋白特異性結(jié)合的抗體。
6. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用原位雜交診斷肝癌的產(chǎn)品包 括與MAGEA1基因的核酸序列雜交的探針。
7. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品包 括-與MAGEA1基因的核酸序列雜交的探針。
8. —種MAGEA1基因的應(yīng)用，其特征在于，所述MAGEA1基因在制備治療肝癌的 藥物中的應(yīng)用。
9. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述治療肝癌的藥物包括通過RNA 干擾抑制MAGEA1基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸，或基于MAGEA1抗原蛋白的腫瘤疫苗，或 用于抑制MAGEA1蛋白活性的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種MAGEA1基因的應(yīng)用，用于制備診斷肝癌的產(chǎn)品和制備治療肝癌的藥物。本發(fā)明的MAGEA1基因，可作為診斷肝癌的特異標(biāo)志基因，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快速，且為防治肝癌提供了新的治療靶點(diǎn)和有效新藥。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101492729SQ200810043068
公開日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2008年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月22日
發(fā)明者慶 鄧, 韓澤廣, 健 黃 申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心