專利名稱：Prm1基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因，尤其涉及一種PRM1基因的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大結(jié)腸癌是我國常見腫瘤之一，占全國惡性腫瘤死因的第五位。且大結(jié)腸癌的發(fā)
病率呈逐年升高趨勢，并且發(fā)病年齡趨于年輕化。我國每年約有13萬人新發(fā)大結(jié)腸
癌，發(fā)病率的增速是世界平均水平的兩倍，達到年均4%，目前大結(jié)腸癌在我國大部分
地區(qū)已經(jīng)成為發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一。因此尋找有效的免疫治療靶點十分重
要(S Zheng， SR Cai. Colorectal cancer epidemiology and prevention study in
china. The Chinese-German J Clinical Oncology, 2003，2:72-75)。
腫瘤-睪丸(cancer-testis, CT)基因可在多種組織來源的腫瘤中表達，但在人類正
常組織中僅限于睪丸的生殖細(xì)胞中表達。因為生殖細(xì)胞不表達人類白細(xì)胞抗原分子，
并且體內(nèi)存在血-睪屏障，所以睪丸組織表達的CT抗原不會引起機體免疫反應(yīng)，而表達
于腫瘤組織的CT抗原，會引起特異性免疫反應(yīng)，因此這類抗原又被視為具有腫瘤特異
性。利用這一特性，發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的特異性CT基因，可促進抗原特異性腫瘤疫苗的
發(fā)展，為腫瘤免疫治療提供新的機遇(ELke J, Dirk J， Knuth Alexander. Clinical
cancer vaccine trials. Curr Opin Immunol, 2002, 14 (2): 178 - 182)。
PRM1 (Protamine 1)基因，又稱為精蛋白Pl，定位于染色體16P13. 2上，全長為
426個堿基，含有2個外顯子，2個內(nèi)含子，編碼一個含有50個氨基酸的核蛋白
(Choudhary， S. K. ; Wykes. A haploid expressed gene cluster exists as a single chromatin domain in human sperm. J. Biol. Chem, 1995, 270: 8755-8762)，艮卩精 蛋白Pl。精蛋白是精子細(xì)胞核內(nèi)DNA結(jié)合的主要蛋白(Cho.C， Willis. Haploinsuff iciency of protamine_l or -2 causes infertility in mice. Nature Genet: 2001， 28:82-86)。人類精蛋白基因族包括三個緊密調(diào)節(jié)的基因，PRM1、 P腿2和TNP2， 在精子形成過程中，三個基因的產(chǎn)物能夠重新包裝父系基因組形成有功能的配子
(Martins RP， Krawetz SA. Nuclear organization of the protamine locus. Soc R印rod Fertil Suppl， 2007,64:1-12)。在精子的形成中發(fā)揮了重要作用。在以往的研 究中，PRM1被認(rèn)為與男性的不育有很重要的關(guān)系(Ravel C， Chantot-Bastaraud S.Mutations in the protamine 1 gene associated with male infertility. Mol Hum R印rod, 2007, 13 (7) :461-464)。
人PRM1基因是CT抗原家族的成員之一，關(guān)于PRM1基因與結(jié)腸癌的關(guān)系尚不清楚， 也未見文獻報道過。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種PRM1基因的應(yīng)用，該PRM1基因可作為 結(jié)腸癌診斷的標(biāo)記分子，提高了結(jié)腸癌診斷的準(zhǔn)確性。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種PRMl基因在制備診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。 所述診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR、實時定量PCR或免疫檢測診斷結(jié)腸癌 的產(chǎn)品。
在本發(fā)明中，所述用RT-PCR診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增PRM1基 因的引物。
所述用實時定量PCR診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增PRM1基因的引物。
所述用免疫檢測診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品包括與PRM1蛋白特異性結(jié)合的抗體，包括 多克隆抗體和單克隆抗體。
在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對PRM1蛋白特異的抗 體。例如，將提純的人PRM1基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆 抗體。同樣，表達人PRM1蛋白或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn) 生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤技 術(shù)制備(例如，Kohler et al. ， Nature 256: 495， 1975; Kohler et al.， Eur. J. Immunol. 6: 511, 1976; Kohler et al. ， Eur. J. Immunol. 6: 292, 1976)。本發(fā) 明的抗體包括可以阻抑PRM1功能的抗體，也可以是不影響人PRM1功能的抗體。每一 類抗體都可以通過對人PRM1基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人PRM1基因 產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進行合成。與非修飾形式的PRM1 基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以利用在原核細(xì)胞例如AcoW中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動 物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化PRM1蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以 利用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。本發(fā)明實驗證明PRM1基因在結(jié)腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，因此PRM1 基因可作為診斷結(jié)腸癌的特異標(biāo)志基因，使結(jié)腸癌診斷更加準(zhǔn)確、快速。


圖1是本發(fā)明通過RT-PCR檢測PRM1基因在人類正常組織中的表達圖； 圖2是本發(fā)明通過RT-PCR檢測PRM1基因在人結(jié)腸癌組織和癌旁組織中的差異表 達圖3是本發(fā)明通過實時熒光定量RT-PCR檢測PRM1基因在人結(jié)腸癌組織和癌旁組 織中差異表達的箱線圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的說明。
以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條 件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議 的條件。
實施例1
RT-PCR實驗檢測PRM1基因在人類正常組織及結(jié)腸癌組織中的表達情況。
1. 組織分離(Tissue isolation)
本發(fā)明所用結(jié)腸癌及癌旁組織均來自臨床結(jié)腸癌的手術(shù)病人。手術(shù)切除的結(jié)腸 癌組織一經(jīng)離體，迅速切取病灶及周圍5公分以外正常組織，并放入液氮中保存。癌 和癌旁的診斷均以病理診斷為最終依據(jù)。15種人體正常組織(腦、心、肺、脾、腎、 胃、食管、小腸、卵巢、乳腺、前列腺、胰腺、肝、胎肝及睪丸)RNA均購自Clontech 公司。逆轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV Reverse Transcriptase, Promega CO. 。 PCR試劑Taq DNA 聚合酶、dNTP等均為大連寶生物技術(shù)有限公司。PRM1基因(GeneID: 5619)的引物 是Forward: 5' -CAGAGTTCCACCTGCTCACA-3' (SEQ ID NO: 1) 、 Reverse: 5， -TTCTCAGGCA GGAGTTTGGT-3' (SEQ ID N0:2)， PCR產(chǎn)物長度為280bp。作為內(nèi)對照的p-actin引物 是Forward:5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3' (SEQIDN0:3)、 Reverse: 5'-CAGCGG AACCGCTCATTGCCAATGG-3' (SEQ ID N0:4); p-actin擴增片斷長度為400bp。
2. 總RNA的抽提試劑盒
抽提RNA試劑采用TRIzol reagent (GIBC0/BRL)，該試劑是基于酸性酚一步抽提法生產(chǎn)的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要進行無RNA酶處理，以保證實驗中無RNA 酶的環(huán)境。
3. RNA的抽提步驟
將碾杵和勻漿器等器皿在20(TC干烤4h，去除RNA酶，冷卻；加入液氮中預(yù)冷， 將組織從液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙將組織放入預(yù)先加入TRIzol試劑的勻 漿器中，勻漿數(shù)分鐘；將勻漿后的液體轉(zhuǎn)入無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4°C 離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4。C離心分層；將 上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加異丙醇，4。C離心沉淀RNA;用75%乙醇洗 滌沉淀2次；用無RNA酶的去離子水溶解沉淀。抽提的RNA質(zhì)量鑒定紫外分光光度 計測定260/280比值(比值均在1. 7 2. 0);并在MOPS甲醛變性膠中觀察有無降解， 本發(fā)明所用MA均無降解。為了去除基因組DNA的污染,全部RNA均用無RNA酶的DNA 酶I (美國Ambion公司)消化。
4. cDNA的合成
取總RNA 2Pg，隨機引物1W， 70。C保溫3min，立即冰上變性5 min。加入5X buffer, DTT和0. 05g *L—1的dNTP各2 W及1 W的逆轉(zhuǎn)錄酶，充分混勻后，42°C 2h。 模板使用終濃度通常為0. Olg L—、
5. 半定量RT-PCR
以cDNA為模板，PCR擴增PRM1基因，同時以P-actin作為模板量的對照。PCR 條件為94。C預(yù)變性3min; 94。C變性30s， 57。C退火30s， 72。C延伸40s，共35循環(huán) (e -actin為25循環(huán))；72'C延伸5min。用2%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物。
6. 實驗結(jié)果顯示，PRM1基因僅在睪丸中表達，其它組織中均無表達(見圖l)。 利用半定量RT-PCR方法檢測PRM1基因在人類結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達情況， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRM1基因在33% (3/9)的結(jié)腸癌中明顯上調(diào)，3例陽性結(jié)果見圖2。在圖2 中，"N"指癌旁組織，"C"指結(jié)腸癌組織。
7. 根據(jù)上述實驗結(jié)果，可通過RT-PCR診斷結(jié)腸癌設(shè)計PRM1基因的PCR引物， 檢測腫瘤組織中PRM1基因RNA的含量，RNA含量高則說明患結(jié)腸癌的可能性高，反之 則低。
實施例2實時熒光定量RT-PCR實驗
使用TaKaRa生物公司的新型實時熒光定量PCR儀(Thermal Cycler Dice
6Detection System,日本)，檢測PRM1基因在12對人類結(jié)腸癌組織及其對應(yīng)的癌旁 組織中的表達。反應(yīng)體系如下總體積20ul， SYBRPremixEXTaq 10ul，引物(10uM) 各0.4 ul ， DNA 2ul， ddH20 7.2ul，上下顛倒混勻試劑，離心后放入PCR儀中進行 擴增反應(yīng)。儀器使用按廠家的說明操作。(3-Actin被用來當(dāng)作內(nèi)對照。所述實驗均重 復(fù)三次以確保結(jié)果的可靠性。結(jié)腸癌和癌旁組織中的PRM1基因的表達水平按以下方 法進行計算PRMl厶Ct =平均PRM1—Ct -平均(5-actin—Ct， PRM1A A Ct= PRM1A Ct— 癌組織-PRM1A Ct一癌旁組織，癌和癌旁組織中的PRM1基因的倍數(shù)關(guān)系用2—""""來計 算。實驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件統(tǒng)計(x2檢驗)，P〈0.05定義為有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，PRMl基因在50y。 (6/12)的結(jié)腸癌組織中有高于2 倍的上調(diào)(P<0.01)，因此，PRM1基因在結(jié)腸癌組和癌旁組中的表達有明顯差異(見 圖3)。在圖3中，"*"代表p〈0.01，方框內(nèi)橫線代表每組檢測值A(chǔ)Ct的中值，方框 外的上下短線分別代表檢測值中的最高值和最低值。本發(fā)明熒光定量PCR檢測的陽性 率高于上述普通RT-PCR的結(jié)果，這可能與熒光定量PCR的高靈敏度有關(guān)。
該實驗結(jié)果表明，可通過實時熒光定量PCR診斷結(jié)腸癌設(shè)計PRM1基因的PCR 引物，檢測結(jié)腸癌組織中PRM1基因RNA的含量，RNA含量高則說明患結(jié)腸癌的可能性 高，反之則低。
實施例3免疫檢測
1. 抗原蛋白獲得
(1) 利用基因工程表達可從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲得人PRM1基因的cDNA序列， 通過PCR擴增獲得編碼框，插入原核生物或真核生物表達載體中，表達PRM1蛋白， 并按基因工程表達產(chǎn)物的純化體系純化蛋白質(zhì)。
(2) 通過培養(yǎng)高表達PRM1基因的人體來源細(xì)胞或組織，再分離純化PRM1蛋白。
2. 抗體制備
可采用以下幾種方法制備抗體
(1) 細(xì)胞融合法用上述制備的PRM1蛋白免疫動物(包括兔子、山羊等)，獲得 脾臟細(xì)胞，再與骨髓瘤細(xì)胞融合，并按常規(guī)單克隆抗體制備技術(shù)制備單克隆抗體。
(2) 利用噬菌體表面展示庫，克隆免疫動物的脾臟IgG可變區(qū)并表達成基因工程 單克隆抗體。
(3) 利用純化的蛋白質(zhì)免疫動物，制備多抗血清。3.檢測
(1) 用制備的抗體(多抗或單抗)，用組織化學(xué)方法進行結(jié)腸癌的病理檢測，陽 性信號為結(jié)腸癌。
(2) 取患者血清，用ELISA方法檢測，陽性反應(yīng)為結(jié)腸癌可疑病人。
(3) 將PRM1抗體作為蛋白質(zhì)芯片的探針之一，用于多種腫瘤診斷。
8序列表
〈110〉 上海人類基因組研究中心
<120〉 PRM1基因的應(yīng)用
〈130〉 NP-08-12214
<160> 4
〈170> Patentln version 3. 3
〈210〉 1
<211> 20
〈212〉 腿
<213〉 人工序列
〈220〉
〈221〉 misc—feature
<222〉 (1)..(20)
〈223〉 引物
<400> 1
cagagttcca cctgctcaca 20
〈210〉 2
〈211〉 20
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
<220>
<221〉 misc一feature
〈222〉 (l)..咖
〈223〉 引物
〈400〉 2
ttctcaggca ggagtttggt 20
〈210〉 3
〈211> 25
〈212〉 ■ 〈213〉人工序列
〈220>
<221〉 misc—feature
<222> (1)..(25)
〈223〉 引物<400〉 3
tcacccacac tgtgcccatc tacga 25
〈210> 4
〈211〉 25
〈212〉 DNA〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉 misc—feature
<222> (l),.咖
<223〉 引物
〈400〉 4
cagcggaacc gctcattgcc aatgg 2權(quán)利要求
1. 一種PRM1基因的應(yīng)用，其特征在于，所述PRM1基因在制備診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品包括用 RT-PCR、實時定量PCR或免疫檢測診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用RT-PCR診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品至 少包括一對特異擴增P服l基因的引物。
4. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用實時定量PCR診斷結(jié)腸癌的 產(chǎn)品至少包括一對特異擴增PRM1基因的引物。
5. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用免疫檢測診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品 包括與PRM1蛋白特異性結(jié)合的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種PRM1基因的應(yīng)用，用于制備診斷結(jié)腸癌的產(chǎn)品。本發(fā)明的PRM1基因，可作為診斷結(jié)腸癌的特異標(biāo)志基因，使結(jié)腸癌診斷更加準(zhǔn)確、快速。
文檔編號C12Q1/68GK101497921SQ20081004310
公開日2009年8月5日 申請日期2008年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月2日
發(fā)明者滕小梅, 韓澤廣, 健 黃 申請人:上海人類基因組研究中心