專利名稱：抗炭疽多肽及其應(yīng)用與制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗炭疽多肽的基因、重組質(zhì)粒、多肽及其應(yīng)用與制備方法，所述炭 疽為炭疽桿菌或炭疽毒素所致的致死性感染疾病。
背景技術(shù)：
炭疽桿菌或炭疽毒素所致的致死性感染疾病一直是對(duì)人類健康的巨大威脅。此外， 在生物恐怖襲擊中，炭疽桿菌或炭疽毒素也一直是最駭人聽聞的病原體和毒素。對(duì)炭疽 桿菌或炭疽毒素所致的致死性感染疾病，目前的防治手段主要是采用抗菌素、抗毒血清、 抗體治療和疫苗預(yù)防注射。由于上述手段不是十分有效，人類一直在積極尋找新的防治 途徑。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種抗炭疽多肽的基因、重組質(zhì)粒、多肽，此種多肽能 特異性的破壞炭疽桿菌或炭疽毒素的生物活性，卻不會(huì)傷害正常的細(xì)胞。本發(fā)明的再一 目的是提供上述抗炭疽多肽的制備方法。本發(fā)明的發(fā)明人構(gòu)建了一種抗體的簡(jiǎn)化模擬物，編碼抗體模擬物的基因?yàn)樾蛄斜碇?SEQ ID N0.12所述的核苷酸序列，上述編碼抗體模擬物的核苷酸序列是分別以食蟹猴 產(chǎn)生的抗炭疽桿菌蛋白抗原一致死因子復(fù)合體抗體(NCBI CAL58671)的重鏈CDR1 區(qū)，重鏈FR2連接段和家鼠產(chǎn)生的抗炭疽桿菌蛋白抗原結(jié)構(gòu)域1抗體(NCBI ABF69350)輕鏈CDR3區(qū)的基因?yàn)樗{(lán)本構(gòu)建而成。具有高度生物危險(xiǎn)性的炭疽毒素是一種二元毒素，其生物殺傷性極強(qiáng)。炭疽毒素由 兩種成分構(gòu)成1 )蛋白抗原(protective antigen, PA); 2)壞死因子和水腫因子(lethal factor, LF; edema factor, EF)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，蛋白抗原與壞死因子聯(lián)合使用，可迅速引起細(xì)胞 壞死，但分別單獨(dú)給予動(dòng)物則不引起反應(yīng)。由于本發(fā)明所述的抗炭疽多肽的基本成分是PA，因此必須設(shè)法去除PA對(duì)人體和動(dòng) 物正常細(xì)胞的毒性。本發(fā)明中，使用了兩種手段來(lái)去除PA對(duì)正常細(xì)胞的毒性1)將 PA中負(fù)責(zé)識(shí)別靶細(xì)胞上相關(guān)受體的氨基酸殘基突變掉，2)在PA的羧基端連接上述抗體 模擬物。構(gòu)建本發(fā)明所述抗炭疽多肽的技術(shù)方案如下將編碼突變氨基酸殘基的基因(SEQ IDN0.2、 4、 6、 8)與炭疽桿菌的蛋白抗原(PA) 基因(見序列表中的SEQIDNO.l)可操作地連接，從而獲得編碼重組突變炭疽桿菌蛋 白抗原(PA)基因的核苷酸序列，編碼重組突變炭疽桿菌蛋白抗原的基因?yàn)樾蛄斜碇蠸EQ ID NO. 10所述的核苷酸序列。將上述編碼抗體模擬物的基因SEQIDNO. 12與編碼重組突變炭疽桿菌蛋白抗原的 基因SEQIDNO. IO的羧基端基因連接，獲得表達(dá)重組抗炭疽多肽的基因，該基因?yàn)樾?列表中SEQ ID NO. 14所述的核苷酸序列。本發(fā)明所述重組質(zhì)粒，是將如上所述的SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.6、 SEQ ID N0.8核苷酸序列經(jīng)雙鏈寡聚核苷酸點(diǎn)突變技術(shù)插入炭疽桿菌的蛋白抗原(SEQ ID NO.I)的基因中形成重組突變炭疽桿菌蛋白抗原基因(SEQ ID NO.10),再將如上所述 的抗體模擬物的核苷酸序列(SEQ ID NO. 12)經(jīng)雙鏈寡聚核苷酸點(diǎn)突變技術(shù)插入重組 突變炭疽桿菌蛋白抗原的羧基端基因(SEQ ID NO. 10)而形成。本發(fā)明的又一方面，提供本發(fā)明所述抗炭疽多肽的制備方法。將序列表中的SEQ ID NO. 12所述的編碼抗體模擬物的基因與裝載了編碼重組突變炭疽桿菌蛋白抗原基因 SEQ ID NO.10的pET22b質(zhì)?？刹僮鞯剡B接獲得編碼重組抗炭疽多肽的基因，將獲得的 基因?qū)氲酱竽c桿菌(￡.co// ) BL-21(DE3)工程菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)His-tag柱 (Ni Sepharose High Performance柱)分離純化即獲得本發(fā)明所述的抗炭疽多肽(命名為 PA-anti-PA，簡(jiǎn)稱PA-aPA,以下描述將使用該命名)。本發(fā)明所述抗炭疽多肽可在制備治療或預(yù)防炭疽桿菌或炭疽毒素致死性感染的藥 中應(yīng)用。可以通過(guò)將本發(fā)明中的多肽添加藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或可選的其它成分而制成適于臨床使用的藥物組合物。其機(jī)理是本發(fā)明所述抗炭疽多肽單體可與野生 型炭疽桿菌蛋白抗原單體在靶細(xì)胞膜上組成一個(gè)雜合七聚體跨膜孔道，該雜合七聚體跨 膜孔道部分或完全喪失了野生七聚體跨膜孔道的生物活性。這樣野生型炭疽桿菌壞死因 子和水腫因子將無(wú)法與七聚體識(shí)別并穿過(guò)七聚體跨膜孔道進(jìn)入細(xì)胞，從而無(wú)法殺死宿主細(xì)胞；同時(shí)本發(fā)明所述抗炭疽多肽單體上的抗體模擬物又能中和蛋白抗原一致死因子復(fù)合體；這就達(dá)到了我們防治炭疽桿菌或炭疽毒素致死性感染的目的。


圖1是含有編碼抗體模擬物的基因SEQIDNO.12和編碼重組突變炭疽桿菌蛋白抗 原基因SEQ ID NO.10的重組質(zhì)粒pCHCA-PAl的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是本發(fā)明所述抗炭疽多肽(PA-aPA)的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中，Mimetic為抗炭疽 桿菌蛋白抗原抗體模擬物，S337K、 G342S、 I656R、 N682S和D683K為炭疽桿菌蛋白抗 原中被突變的氨基酸殘基。圖3是被野生型炭疽桿菌蛋白抗原(PA) /壞死因子(LF)復(fù)合物殺傷的小鼠經(jīng)本 發(fā)明所述抗炭疽多肽保護(hù)的生存曲線，橫坐標(biāo)為生存天數(shù)，縱坐標(biāo)為小鼠生存數(shù)量。曲線1為腹腔注射野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物組，曲線2為腹腔注射抗炭疽多肽/LF復(fù) 合物組，曲線3為腹腔注射野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物+抗炭疽多肽組，曲線4為腹 腔注射野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物+抗腫瘤二元多肽組。圖4是野生型炭疽桿菌蛋白抗原(PA) /壞死因子(LF)復(fù)合物殺傷的小鼠6小 時(shí)后再給予本發(fā)明所述抗炭疽多肽保護(hù)的生存曲線，橫坐標(biāo)為生存天數(shù)，縱坐標(biāo)為小鼠 生存數(shù)量。曲線1為野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物組，曲線2為野生型炭疽桿菌PA/LF 復(fù)合物6小時(shí)后再給予抗炭疽多肽組。圖5是被野生型炭疽桿菌蛋白抗原(PA) /壞死因子(LF)復(fù)合物殺傷的大鼠經(jīng)本 發(fā)明所述抗炭疽多肽保護(hù)的生存曲線，橫坐標(biāo)為生存天數(shù)，縱坐標(biāo)為小鼠生存數(shù)量。曲 線1為尾靜脈注射野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物組，曲線2為野生型炭疽桿菌PA/LF 復(fù)合物+抗炭疽多肽組。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1表達(dá)抗炭疽多肽的質(zhì)粒的構(gòu)建和重組抗炭疽多肽的制備原始質(zhì)粒為裝載了野生型炭疽桿菌蛋白抗原(PA)基因SEQIDNO.l的pET22b 質(zhì)粒(7.6 kb，空白質(zhì)粒為Novagan pET22b質(zhì)粒，PA基因由Harvard Univ. Dr. J.Collier裝載)，經(jīng)雙鏈寡聚核苷酸點(diǎn)突變技術(shù)(QuickChangeTM Kit, Strategene公司) 在PA基因的氨基端插入六個(gè)組氨酸的基因-CACCACCACCACCACCAC-后，分 別將編碼突變氨基酸殘基的基因(SEQ ID N0.2、 4、 6、 8)與野生型炭疽桿菌蛋 白抗原(PA)基因可操作地連接，從而獲得編碼重組突變炭疽桿菌蛋白抗原基因的 核苷酸序列SEQ ID NO. 10。再將編碼抗體模擬物的基因SEQ ID N0.12插入到重 組突變炭疽桿菌蛋白抗原基因的羧基端G735位點(diǎn)后，就制備出了抗炭疽多肽的重 組質(zhì)粒pCHCA-PAl (見圖1)。將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Eco" BL-21(DE3)工程菌里 制備多肽，獲得序列表中SEQ ID NO.15所述的抗炭疽多肽。 突變程序按Strategene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (catalog#200518) 藥箱手冊(cè)進(jìn)行 1、準(zhǔn)備點(diǎn)突變反應(yīng)物 5ul 10 x buffer2ul(10ng)野生型炭疽桿菌蛋白抗原質(zhì)粒 1.25ul(125ng)設(shè)計(jì)的5'-3'寡聚核苷酸引物 1.25ul(125ng)設(shè)計(jì)的3'-5'寡聚核苷酸引物1 ul dNTP 雙蒸水50 ul 1 ul pfli(除質(zhì)粒、引物和雙蒸水外,均為藥箱所備試劑)2、 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件變性95。C, 35秒，退火53°C， 70秒，延伸68°C, 17 分共20個(gè)循環(huán)；3、 加入Dpnl內(nèi)切酶1 ul消化母體DNA鏈后(37'C,1小時(shí))，取1 ul反應(yīng)物與 XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞50 ul冰孵30分鐘，行熱沖擊42°C， 45秒,再置入冰中2分鐘；4、 加入NZY培基0.5 ml后220rpm， 37'C搖菌1小時(shí)后，取50-100 ul反應(yīng)物鋪板 (LB培基加1%瓊脂加50—100 ug/ml氨芐青霉素,37'C過(guò)夜)；5、 18小時(shí)后挑菌,循Qiagene，Gibco等公司的各種商用提取質(zhì)粒藥箱提取質(zhì)粒均可, 測(cè)序確定突變成功；6、 將質(zhì)粒50ng與制備的BL-21(DE3)工程菌感受態(tài)細(xì)胞50ul冰孵5分,42'C,30秒 熱沖擊,取50-100 ul反應(yīng)物加入LB培基0.5 ml, 220 rpm， 37。C搖菌1小時(shí)后鋪板(LB 培基加1%瓊脂加50 ug/ml氨芐青霉素)37'C孵育，18小時(shí)后挑取菌落；7、 大量增菌，8-16升LB培基，220rpm,37。C，3小時(shí)，加入1M IPTG lml/升LB培基 后，將溫度降為28'C,220rpm生長(zhǎng)5小時(shí)，離心沉淀菌體，4°C, 4000g， 15分鐘，取4'C,20 %蔗糖，20 mM Tris， 1 mM EDTA， 1 mM PMSF 300 ml懸浮菌體，冰孵8 min，4°C, 8000g, 20分鐘離心后，倒去上清，加入4。C,5mMMgS04, 1 mMPMSF200ml懸浮沉淀，冰孵 10 min， 4°C, lOOOOg， 10分鐘離心后，取上清裝入分子量10,000的透析袋于4°C, 20 mM Tris， 0.15MNaCl， 5 mM咪唑緩沖液10升透析過(guò)夜后(換液兩次)，將上清上樣于 His-tag柱(4。C)，經(jīng)1M咪唑，20mMTris，0.15MNaCl緩沖液洗脫，再用20mMTris， 0.15MNaCl， lmMEDTA緩沖液5升透析去掉咪唑后即可得到重組抗炭疽多肽(見圖 '2)。突變上述質(zhì)粒中S337K所設(shè)計(jì)的寡聚核苷酸序列1、 5'陽(yáng)3'gtc gca att gat cat AAA cta tct cta gca gggccc tgc tag aga tag TTT atg ate aat tgc gac 突變上述質(zhì)粒中G342S所設(shè)計(jì)的寡聚核苷酸序列ttt aaa aaa ta aat TCT aaa tta ccg tta tat2、 3，-5'ata taa egg taa ttt AGA att ata ttt ttt aaa 突變上述質(zhì)粒中1656R所設(shè)計(jì)的寡聚核苷酸序列g(shù)gg ctt aaa gaa gtt AGA aat gac aga tat gat 2、 3，-5'Ate ata tct gtc aat TCT aac ttc ttt aag ccc突變上述質(zhì)粒中N682S和D683K所設(shè)計(jì)的寡聚核苷酸序列1、 5，-3'gat ttt aaa aaa tat TCT AAA aaa tta ccg tta2、 3，-5'taa egg taa ttt TTT AGA ata ttt ttt aaa ate制備上述質(zhì)粒中抗Pa及PA-LF復(fù)合物抗體模擬物基因所設(shè)計(jì)的寡聚核苷酸序列1、 5，-3'aaa aaa ggc tat gag ata gga TCA ACC GCC CTC CAT TGG GTG AGA CAA GCC taa tga etc gag cac cac cac2、 3'陽(yáng)5'gtg gtg gtg etc gag tea tta GGC TTG TCT CAC CCA ATG GAG GGC GGT TGA tec tat etc ata gcc ttt tttetc cat tgg gtg aga caa gcc CCC GGA AAG GGC CTG GAG TGG GTA TCG taa tga etc gag cac cac cac 4、 3，-5'gtg gtg gtg etc gag tea tta CGA TAC CCA CTC CAG GCC CTT TCC GGG ggc ttg tct cac cca atg gagaag ggc ctg gag tgg gta teg CTG AGA TAT GAC GAA TTT CCT TAT ACG taa tga etc gag cac cac cac 6、 3，-5'gtg gtg gtg etc gag tea tta CGT ATA AGG AAA TTC GTC ATA TCT CAG cga tac cca etc cag gcc ctt實(shí)施例2:本發(fā)明所述抗炭疽多肽對(duì)野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物殺傷小鼠的保護(hù) 作用受試鼠為BALB/c免疫缺陷裸鼠，分為4個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組均為10只。野生 型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物、抗炭疽多肽、抗腫瘤二元多肽均經(jīng)腹腔給藥，每日同時(shí)給藥 一次，共給藥6次，已死亡小鼠不再給藥。試驗(yàn)組l:腹腔注射野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物組，注射量為20嗎/20昭/日。 試驗(yàn)組2:腹腔注射抗炭疽多肽/LF復(fù)合物組，注射量為20嗎/20昭/日。 試驗(yàn)組3:腹腔注射野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物+抗炭疽多肽組，注射量為20嗎 /20嗎+20嗎/日。試驗(yàn)組4:腹腔注射野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物+抗腫瘤二元多肽(見申請(qǐng)?zhí)?200710049653.9的中國(guó)專利申請(qǐng))組，注射量為20嗎/20 |ug/日。各試驗(yàn)組小鼠的生存狀況見圖3，從圖3可以看出，試驗(yàn)組1中的野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物毒性作用最大，7日內(nèi)即可造成小鼠全部死亡(見圖3中的曲線1)。試驗(yàn) 組2中抗炭疽多肽/LF復(fù)合物的毒性作用大為減弱，20日內(nèi)并未造成動(dòng)物死亡(見圖3 中的曲線2)。試驗(yàn)組3中的抗炭疽多肽成功的減弱了野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物的 毒性作用，20日內(nèi)90%的小鼠均可存活(見圖3中的曲線3)。試驗(yàn)組4中的抗腫瘤二 元多肽未能阻止野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物的毒性作用，12日內(nèi)小鼠均死亡(見圖 3中的曲線4)。實(shí)施例3:本發(fā)明所述抗炭疽多肽延遲6小時(shí)后給藥對(duì)野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合 物殺傷小鼠的保護(hù)作用受試鼠為BALB/c免疫缺陷裸鼠，分為2個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組均為5只。野生型 炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物、抗炭疽多肽均經(jīng)腹腔給藥，第一日抗炭疽多肽在野生型炭疽桿 菌PA/LF復(fù)合物給藥6小時(shí)后再給藥。之后每日同時(shí)給藥一次。共給藥6次，己死亡 小鼠不再給藥。試驗(yàn)組l:腹腔注射野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物組，注射量為20嗎/20昭/日。 試驗(yàn)組2:腹腔注射野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物+抗炭疽多肽組，注射量為20嗎 /20嗎+20 ng/曰。各試驗(yàn)組小鼠的生存狀況見圖4，從圖4可以看出，試驗(yàn)組l中的野生型炭疽桿菌 PA/LF復(fù)合物毒性作用最大，6日內(nèi)即可造成小鼠全部死亡(見圖4中的曲線1)。試驗(yàn) 組2中的抗炭疽多肽成功的減弱了野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物的毒性作用，但減弱作 用弱于實(shí)施例2; 20日內(nèi)約有70%的小鼠可存活(見圖4中的曲線2)。實(shí)施例4:本發(fā)明所述抗炭疽多肽對(duì)野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物殺傷大鼠的保護(hù) 作用受試大鼠為SD普通大鼠，分為2個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組均為5只。野生型炭疽 桿菌PA/LF復(fù)合物、抗炭疽多肽均經(jīng)尾靜脈給藥，每6小時(shí)給藥一次，共給藥4 次，己死亡大鼠不再給藥。試驗(yàn)組1:尾靜脈注射野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物組，注射量為80昭/40嗎/次。 試驗(yàn)組2:尾靜脈注射野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物+抗炭疽多肽組，注射量為80 嗎/40嗎+80嗎/次。各試驗(yàn)組大鼠的生存狀況見圖5，從圖5可以看出，試驗(yàn)組1中的野生型炭疽桿 菌PA/LF復(fù)合物毒性作用最大，24小時(shí)內(nèi)即可造成大鼠全部死亡(見圖5中的曲 線1)。試驗(yàn)組2中的抗炭疽多肽成功地減弱了野生型炭疽桿菌PA/LF復(fù)合物的毒 性作用，6日內(nèi)100 %的大鼠均存活(見圖5中的曲線2)。<formula>formula see original document page 10</formula>gcaacataca Ett"tttg33犯tgga^g8gtg gtgttaccgc aaattcaaga aacaactgca ctggt卿犯ggcggatagc ggcggtt犯t gatstgacat taa犯gaagc ccttaaaata ttacaat3tc犯ggga犯g3 cat犯ccgaa c犯aatatc8 ag犯tcagtt agcgg犯tta aaaatcaaat taaatgcaaa aatgaatatt agaaataaca t已gcagttgg ggctgatgag attaattcgt caacagaggg attattgtta tcaggttst3 ttgtagaa^t tgaagatact tatgatatgt tgaatatttc tagtttacgg a犯tata^tg 3taaattacc gttatat3t3 gctgttacta a^gaaaac3C tattattaat gggatcaaga aaattttaat cttttcta犯鄉(xiāng)gtgg咖caggctcgaactggagtgaa1440cgtatcatttttaatgga^aaagatttaaat1500cctagtgatccattaga犯cgactaaaccg1560gC3tttggatttaacg犯cc1620tttgattttaatttcgatcaacaaacatct1680犯cgt犯ctaacatatatactgtattagat1740ataaacgttttcattatgat1800tcagtagtta1860aatattgata已ggatat犯gaaaaatat ta1920g犯gggctta犯g犯gtt3taaatgacaga謂C犯g3tgg犯aaacatt tat2040agtaatcccaattataaggtaaatgtatat2100cct3gtg3geitagtaccaac2160aaaggctatg2211<210〉 2<211> 3<212> 腿 〈213〉人工序列〈220〉<221〉 CDS 〈222〉 (1).....(3)<223〉編碼突變炭疽桿菌蛋白抗原基因G342S序列<400> 2 tct<210〉 3<211> 1<212〉 PRT <213〉人工序列〈223〉編碼突變炭疽桿菌蛋白杭原G342S氨基酸序列<400> 3Ser1<210〉 4〈211> 6<212> 腿 <213>人工序列<220> <221> CDS <222> (1).….(6)<223〉編碼突變炭疽桿菌蛋白抗原基因N682S-D683K序列<400> 4 t c t aaa〈210〉 5<211> 2〈212> PRT <213>人工序列<223〉編碼突變炭疽桿菌蛋白抗原N682S-D683K氨基酸序列<400〉 5 Ser Lys 1〈210〉 6<211〉 3 <212>腿 <213〉人工序列<220> 〈221〉 CDS <222〉 (1).....(3)〈223>編碼突變炭疽桿菌蛋白抗原基因S337K序列 <400> 6Asn Trp Tyr Trp Gly Ala Cys His Glu Asn Ala Phe Thr Ala Leu 350 355 360Lys Asn Phe Leu Ala Leu Asp Leu Val Leu Ala His Phe Asn Tyr 365 370 375Asn Ala Ser Leu lie Uu Thr Val Asp Val Ser Arg Ser Gly Leu 380 385 390Ser Ala lie Phe Phe Gin lie Glu Ser Thr Gly Phe Ala Arg Pro 395 400 405Val Phe Phe Ala Ser Arg lie Leu Ser Val Ala Asp Asn Gly Tyr 410 415 420Ser Pro Phe Gin Val Val Ala Asn Ala lie lie Phe Cys Val Arg 425 430 435Gly Tyr Tyr His Phe Asp Tyr lie Val Gly Leu Phe His Leu Ser 440 445 450Tyr Val Gin lie Leu Asn Cys Phe Ser Trp Phe Leu Val Phe lie 455 460 465Glu Val Phe Ser Pro Thr lie Gin Cys Asn Asn Cys Leu Arg Phe 470 475 480Gly His lie Lys Asn Gin Cys Arg Ser Gin Pro Arg Arg Phe Arg 485 490 495Cys Thr Gin Pro His Cys Gly Asp Asn Cys Val Val Gin Glu Ser 500 505 510Glu Ala Ser Cys Leu Tyr Cys Ser Glu His His Phe Ser Thr Ser 515 520 525Arg Ser Cys Pro Glu Gin Glu Arg Gin Arg Ala lie Lys Met Lys 530 535 540Met Ser Arg Asp Gly lie Ser Tyr Gin Glu Ala Cys Ser Gin Thr 545 550 555Ala Lys Val Asn Arg Arg Leu Asn Gin Val Ala Gly Ser Val Pro<213>人工序列 〈222〉 (1)(2208)<223>編碼重組突變炭疽桿菌蛋白抗原基因<400〉 10atggaagtta8aC3gg3gccggttattaBa/tgaatc3gaatcaagttcccaggggtta60ctaggatactattttagtgatttgaattttcgcaccc3ttcttctact120tatctattcctagttctgagttagaaaatattccatcggaaaaccaatat180tttcatctgctatttggtcaggatttatcagttg3gtgatgaatatacattt240gctacttccgctgattcatgtaacaatgtgggttg3ccgaagtgattaataaa300gcttctaattc taacaaaatcagattagaaaaaaat t caa360tatcaacgagaaaat 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PhelieLysAspArg 595 ValGluPheLeu 340 AspAlaAsnlieAla 420 TyrThrArglieLeu 500 ThrGlyThrAsnLys 580 PheValThrValSer 325 AlaThrProGinLeu 405 LeuAsnAspValGin 485 ValThrPheGluGin 565 lieHisLysSerHis 310 AsnSerAlalieThr 390 AlaAsnGinGinArg 470 GluGluLysAsnPhe 550 LeuLysTyrGluThr 295 AlaSerGluArgTyr 375 LeuProAlaPheVal 455 ValThrArgProGlu 535 AspAlaLeuAspAla 615280 Ser ArgSerAsnArgLeu 360 AsnAlaAsnGinLeu 440 TyrAspThrArgAsp 520 ProPheGluAsnArg 600 HisPheSerThr 345 AsnValThrAsnAsp 425 GluGlyThrAlalie 505 MetAsnAsnLeuAla 585 AsnArgThrPheSer 330 TrpAlaLeulieTyr 410 AspLeuAsnGlyArg 490 AlaThrGlyPheAsn 570 LysAsnGluHis Thr 300 Asp lie 315Thr Val Ala Glu Asn lie285 Ser GluProL>ys 395 TyrPheGlulieSer 475 lieAlaLeuAsnAsp 555 ValMetlieValThr 380 AlaProSerLysAla 460 AsnlieValLysLeu 540 GinThrAsnAlalie 620GlyAlaThrArg 365 ThrLysSerSerThr 445 ThrTrpPheAsnGlu 525 GinGinAsnlieVal 605 AsnGlylieMet 350 TyrSerGluLysThr 430 LysTyrSerAsnPro 510 AlaTyrThrlieLeu 590 GlySerValSerAsp 335 GlyValLeuAsnAsn 415 ProGinAsnGluGly 495 SerLeuGinSerTyr 575 lieAlaSerHisVal 320 HisLeuAsnValGin 400 LeulieLeuPheVal 480 LysAspLysGlyGin 560 ThrArgAspThrGlu Gly Leu Leu Leu Asn lie Asp Lys Asp lie Arg Lys lie Leu Ser 625 630 635 640Gly Tyr lie Val Glu lie Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Arg645 650 655Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn lie Ser Ser Leu Arg Gin Asp Gly660 665 670Lys Thr Phe lie Asp Phe Lys Lys Ser Lys Lys Leu Pro Leu Tyr lie675 680 685Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn690 695 700Thr lie lie Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly lie 705 710 715 720Lys Lys lie Leu lie Phe Ser.Lys Lys Gly Tyr Glu lie Gly 725 730<210> 12〈211〉 84<212> DNA 〈213〉人工序列<220><221> CDS<222> (1).....(84)<223>編碼抗體模擬物基因序列<400> 12tcaaccgccc tccattgggt gagacaagcc cccggaaagg gcctggagtg ggtatcgctg 60 agatatgacg aatttcctta tacg 84〈210〉 13 <211> 28 <212〉 PRT <213>人工序列<223>編碼抗體模擬物氨基酸序列 〈400〉 5Ser Thr Ala Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser1 5 10 15Pro Arg Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr 20 25〈210> 14<211> 2292<212〉 ■ <213>人工序列<222> (1) (2292)<223>編碼抗炭疽多肽基因〈400〉 14atgg犯gttaccggttattaaatgaatcagaatcaagttcccaggggtta60ctaggatactattttagtgatttgaattttc肌gca^ccc3tggtggttacttcttctact120ac鄉(xiāng)ggatttatctattcctagttctgagttxcatcggaaaaccaata"t180tttcaatctgcta"tttggtcaggatttatcatatacattt240gctacttccgctgataatcatgtaacaatgtgggt卿tgaccaag犯gtgattaataaa300gcttctaatta犯gg犯gattatat caaataaaaat t caa360tatcaacgagaaBatcctacttggatttcaagttgt￡LCtggaccgattct420aag犯g"tgatttctsgtg8ttgccag犯tt■tcttcgaactgcgaBgtacaagtgctggacctacggttccagaccgtgac540aatgatgg3atccctgattc3ttag3ggtacggttgatgt600agaacttttctttcaccatggatttctaateLget犯ggeittaacc&a&"tat660aaatcatctcctg犯a犯tggagcacggcttctgatccgtacagtgatttcgaaaaggtt720織ggacggattga^t^ga^tgtatcaccag3ggc犯gacacccccttgtggcagcttat780ccgattgtacatgtagatatgg已gaatattattctctcaaa^犯tgaggaitcaatccaca840C3g犯t已Ctgatagtca犯cgag^caataagtaaaaateicttctacaag900actagtgaagtac8tggaaatgc卿agtgc已tgcgtcgttctttgatattggtgggagt960gtatctgcagg已tttagta已ttcgaattcaagtacggtcgc犯ttgatcataaactatct1020ctagcatctg犯ag犯cttgggctgaaacaatgggtttaaataccgctgatacagcaaga1080"ttaaa^tgcc3at3t"t eightsgggacggctccgtgttacca1140acg已cttcgttagtgttaggacactcgcgacaattaa^3gcteiagga^aac1200caattaagtca犯tacttgctatta"tccttc t aaaaac 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555Lys 220 PheArgAsnSerThr 300 lieValGlulieThr 380 AlaProSerLysAla 460 AsnlieValLysLeu 540 GinSerGluHislieGin 285SerGlyAlaThrArg 365 ThrLysSerSerThr 445 ThrTrpPheAsnGlu 525 GinGinSer Pro Glu Lys Prolie 270 ThrGluGlylieMet 350 TyrSerGluLysThr 430 LysTyrSerAsnPro 510 AlaTyrThrVal Thr 240 Leu Val 255Leu SerArg ThrVal HisSer Val 320 Asp His 335Gly LeuVal AsnLeu ValAsn Gin 400 Asn Leu 415Pro lieGin LeuAsn PheGlu Val 480 Gly Lys 495Ser AspLeu LysGin GlySer Gin 560Asn lie Lys AsnValAspGluGlu 625 GlyAsnLysSerThr 705 LysAlaSerLeuLysSer 610 GlyTyrAspThrAsn 690 lieLysLeuProAsp Lys 580 Arg Phe 595Val ValLeu Leulie ValArg Tyr 660 Phe lie 675Pro Asnlie Asnlie LeuHis Trp 740 Arg Tyr755Gin Leu 565lie LysHis TyrLys GluLeu Asn 630 Glu lie 645Asp MetAsp PheTyr LysPro Ser 710 lie Phe 725Val Arg Asp GluAla GluLeu AsnAsp Arg 600 Ala His 615lie AspGlu AspLeu AsnLys L>ys 680 Val Asn 695Glu Asn Ser Lys Gin AlaPhe Pro760LeuAla 585 AsnArgLysThrlie 665 SerValGlyLysPro 745 TyrAsn 570 LysAsnGluAspGlu 650 SerLysTyrAspGly 730 GlyThrVal Thr Asn lieMetlieVallie 635 GlyAsnAlalie 620 ArgLeulieVal 605 AsnLysLysLeu 590 GlySerlieGluSer Leu Arg Gin 670Lys Leu Pro Leu 685Ala Val Thr Lys 700Thr Ser Thr Asn 715Tyr Glu lie GlyLys Gly Leu Glu750Tyr 575 lieAlaSerLeuVal 655 AspTyrGluGlyThrArgAspThrSer 640 ArgGlylieAsnlie 720 ThrSer 735Trp Val
權(quán)利要求
1、一種編碼抗炭疽多肽的基因，其特征在于所述基因由編碼重組突變炭疽桿菌蛋白抗原的基因與編碼抗體模擬物的基因連接而成，為序列表中SEQ ID NO.14所述的核苷酸序列。
2、 一種抗炭疽多肽的重組質(zhì)粒，其特征在于它含有權(quán)利要求l所述的基因。
3、 一種抗炭疽多肽，其特征在于它由權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒表達(dá)而成，為序 列表中SEQ ID N0.15所述的氨基酸序列。
4、 權(quán)利要求3所述抗炭疽多肽在制備治療或預(yù)防炭疽桿菌或炭疽毒素致死性感染 的藥中的應(yīng)用。
5、 一種抗炭疽多肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟將序列表中的SEQ ID N0.12所述的編碼抗體模擬物的基因與裝載了序列表中SEQ ID NO. 10所述的編碼重組突變炭疽桿菌蛋白抗原基因的pET22b質(zhì)?？刹僮鞯剡B接獲 得編碼重組抗炭疽多肽的基因，將獲得的基因?qū)氲焦こ叹磉_(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng) His-tag柱分離純化即獲得抗炭疽多肽。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述抗炭疽多肽的制備方法，其特征在于序列表中SEQIDNO. 10所述的編碼重組突變炭疽桿菌蛋白抗原基因由序列表中SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8所述的編碼突變氨基酸殘基的基因與序列表中SEQ ID NO.l 所述的炭疽桿菌的蛋白抗原基因連接而成。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗炭疽多肽的基因、重組質(zhì)粒、多肽及其應(yīng)用與制備方法。將編碼抗體模擬物的基因與編碼重組突變炭疽桿菌蛋白抗原的基因可操作地連接，從而獲得表達(dá)重組抗炭疽多肽的基因。將如上所述的編碼抗體模擬物的基因經(jīng)雙鏈寡聚核苷酸點(diǎn)突變技術(shù)插入重組突變炭疽桿菌蛋白抗原基因即形成本發(fā)明的重組質(zhì)粒。將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入大腸桿菌BL-21工程菌中而獲得可產(chǎn)生抗炭疽多肽的工程菌細(xì)胞；大量增菌、離心沉淀菌體、蔗糖—硫酸鎂法提取含多肽上清、上清過(guò)柱純化即可得到抗炭疽多肽。此種抗炭疽多肽可特異性的破壞炭疽桿菌毒素的生物活性，且不會(huì)攻擊正常人體細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/31GK101215568SQ20081004521
公開日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2008年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月18日
發(fā)明者丘小慶 申請(qǐng)人:丘小慶