專利名稱：一種三維高通量藥物篩選芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的能實現(xiàn)細(xì)胞水平高通量藥物生物活性篩選的三維聚 二甲基硅氧垸-玻璃芯片及其制備方法，屬于微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，藥物篩選已成為當(dāng)前微流控芯片技術(shù)中最具潛力的 應(yīng)用領(lǐng)域之一。單個細(xì)胞及胞內(nèi)微量物質(zhì)的分析與檢測已在微流控芯片中得到初 步實現(xiàn)，但細(xì)胞水平的高通量藥物篩選仍然是微流控技術(shù)發(fā)展的難點和熱點。而 傳統(tǒng)的藥物篩選，主要在玻璃培養(yǎng)皿和九十六孔板中操作，工作量繁重，試劑和 藥物消耗量大，篩藥周期漫長，開發(fā)成本高昂。當(dāng)前，迫切需要開發(fā)出一種新型 的藥物篩選平臺，來加快藥物篩選的進度和中藥現(xiàn)代化的進程。 發(fā)明內(nèi)容為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明中利用微機電加工和微塑膜技術(shù)創(chuàng)新性 地設(shè)計并制作出一種三維微溝道結(jié)構(gòu)的聚二甲基硅氧烷(PDMS)-玻璃芯片，它 在細(xì)胞水平的藥物篩選中，具有芯片微型化、高通量、低成本、試劑消耗小、試 驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠和操作流程簡便等優(yōu)點。實現(xiàn)本發(fā)明目的采用的技術(shù)方案是 一種三維高通量藥物篩選芯片，至少包 括聚二甲基硅氧烷和玻璃載片，其特征是第一層聚二甲基硅氧垸芯片上設(shè)有細(xì) 胞注入和廢液輸出溝道；另一層聚二甲基硅氧烷芯片上設(shè)有藥物濃度梯度溝道和定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室以及細(xì)胞進樣打孔處和廢液出口打孔處，定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室與 藥物濃度梯度溝道的出口溝道連接，且定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室通過溝道分別與細(xì)胞進 樣打孔處和廢液出口打孔處連接，，第一層聚二甲基硅氧垸芯片的細(xì)胞注入和廢 液輸出溝道通過細(xì)胞進樣打孔處和廢液出口打孔處與另一層聚二甲基硅氧烷芯 片鍵合在一起，鍵合在一起的兩層聚二甲基硅氧垸芯片再與玻璃載片鍵合在一 起。細(xì)胞注入和廢液輸出溝道和藥物濃度梯度溝道為單向阻尼結(jié)構(gòu)或溝道內(nèi)設(shè) 有微闊門。所述三維高通量藥物篩選芯片的制備方法包括以下步驟(1) 設(shè)計細(xì)胞注入和廢液輸出溝道和藥物濃度梯度溝道的圖形，然后打印出 膠片掩膜，溝道深度為50 100um，溝道寬度為100 3000um，定量細(xì)胞培養(yǎng)腔 室尺寸在1000 3000um之間；(2) 在潔凈硅片上均勻涂甩上AZ50正型光刻膠；(3) 將涂膠硅片先于70 IOO'C下烘烤固化；(4) 將烘烤后的涂膠硅片與膠片掩膜平行對準(zhǔn)貼緊后,紫外充分曝光；(5) 曝光充分后浸入顯影溶液，待顯影完全后，用去離子水沖洗干凈,再吹干， 在涂膠硅片上制作出陽模圖形；(6) 重復(fù)步驟(1) (5)，分別制備兩片出帶細(xì)胞注入和廢液輸出溝道和藥 物濃度梯度溝道布局的硅片-光刻膠陽模。(7) 將聚二甲基硅氧烷預(yù)聚物灌注到制得的兩片硅片-光刻陽模上，待氣泡排 盡后，烘焙2 3h，直至固化完全；(8) 切割并剝離兩片含溝道的聚二甲基硅氧烷，打孔，等離子體處理后，第 一層聚二甲基硅氧烷芯片的細(xì)胞注入和廢液輸出溝道通過細(xì)胞進樣打孔處和廢 液出口打孔處與另一層聚二甲基硅氧烷芯片對準(zhǔn)鍵合得雙層聚二甲基硅氧垸芯 片；(9) 將上述雙層聚二甲基硅氧烷芯片和玻璃載片等離子體處理后再鍵合在一起；(10) 70 9(TC烘焙1 2h后，即制作出含兩層微溝道結(jié)構(gòu)的三維高通量藥物 篩選聚二甲基硅氧烷-玻璃芯片。為盡量減少溝道內(nèi)阻和穩(wěn)定流場分布，上述細(xì)胞注入和廢液輸出溝道為分叉 結(jié)構(gòu)；藥物濃度梯度的溝道藥物濃度梯度溝道為逐級分叉結(jié)構(gòu)，在藥物和培養(yǎng)基 的不同的注入流速下，形成一系列藥物濃度梯度分布。第一層聚二甲基硅氧烷芯 片的細(xì)胞注入和廢液輸出溝道通過細(xì)胞進樣打孔處和廢液出口打孔處與另一層 聚二甲基硅氧烷芯片對準(zhǔn)鍵合.得雙層聚二甲基硅氧烷芯片，雙層聚二甲基硅氧垸 芯片的兩層溝道通過數(shù)個微孔貫通，溝道呈現(xiàn)出三維分布；為了準(zhǔn)確控制流體在 溝道內(nèi)的流向，在溝道的局部位置設(shè)計為單向阻尼結(jié)構(gòu)或溝道內(nèi)設(shè)有微氣閥，以 阻止細(xì)胞懸浮液進入濃度梯度溝道。上述的細(xì)胞注入和廢液輸出溝道為分叉結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞注入和廢液輸出溝道深度為50 100um，寬度為300 3000um。藥物濃度梯度溝道為逐級分叉結(jié)構(gòu)，且 溝道深度為50 100um，寬度為100 1000um。為了保證試驗數(shù)據(jù)的精確性，細(xì)胞定量培養(yǎng)微腔室實現(xiàn)細(xì)胞的定量培養(yǎng)，向 各個腔室中注滿均勻分布細(xì)胞懸浮液，由于等體積和等濃度條件，使得每個培養(yǎng) 腔室中的細(xì)胞數(shù)目近似相等。為了使試驗數(shù)據(jù)能在統(tǒng)計學(xué)上有意義，定量細(xì)胞培 養(yǎng)腔室構(gòu)成三行平行試驗組微腔室、兩行空白對照組微腔室和一行陽性對照組微 腔室。本發(fā)明的具有如下優(yōu)點(1) 本發(fā)明實現(xiàn)了藥物篩選芯片微型化，高通量篩選，細(xì)胞定量化和操作簡便 的技術(shù)功能，并且很大程度地節(jié)約了藥物篩選的成本和縮短了新藥開發(fā)的周期。(2) 在細(xì)胞注入和廢液出口溝道處的平滑分叉結(jié)構(gòu)，達(dá)到了減少溝道內(nèi)阻和穩(wěn) 定流場分布的目的；并且在微腔室的藥物注入旁路溝道上設(shè)計了單向阻尼結(jié)構(gòu)或 溝道內(nèi)設(shè)有微閥門，能夠精確地控制細(xì)胞懸浮液不進入濃度梯度溝道,增加了藥 物篩選芯片內(nèi)兩個流場的穩(wěn)定性和通暢性；定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室構(gòu)成三行平行試驗 組、兩行空白對照組和一行陽性對照組的微腔室，使得試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可對 比性以及統(tǒng)計學(xué)意義，對藥物篩選具有良好的指導(dǎo)性。細(xì)胞培養(yǎng)微腔室通過等體 積法來實現(xiàn)細(xì)胞定量，可用MTT法或熒光檢驗法來檢測細(xì)胞在藥物作用下的成活 情況，還可用于指導(dǎo)細(xì)胞水平上的藥物篩選，并且具有操作簡便、高通量篩選等 優(yōu)點。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明。圖1是上層聚二甲基硅氧烷芯片中的溝道結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是下層聚二甲基硅氧垸芯片中的溝道結(jié)構(gòu)示意圖。圖3是濃度梯度溝道結(jié)構(gòu)示意圖。圖4是細(xì)胞培養(yǎng)腔室結(jié)構(gòu)示意圖。圖5是本發(fā)明聚二甲基硅氧垸-玻璃芯片結(jié)構(gòu)示意圖。圖中，1.細(xì)胞注入口， 2.細(xì)胞注入支流溝道，3.廢液支路溝道,4.廢液出口， 5.濃度梯度溝道，6.細(xì)胞培養(yǎng)腔室，7.細(xì)胞進樣打孔處，8.三組細(xì)胞培養(yǎng)平行腔 室，9.廢液出口打孔處，IO.兩組空白對照腔室，11.陽性藥物對照細(xì)胞培養(yǎng)腔室，12.細(xì)胞培養(yǎng)基入口， 13.藥物入口，14.折線狀濃度梯度溝道，15.單向阻尼溝道， 16.細(xì)胞進樣打孔處，17.藥物注入溝道，18.藥物入口， 19.細(xì)胞培養(yǎng)腔室，20. 廢液出口打孔處，21.細(xì)胞培養(yǎng)基入口， 22.待測藥物入口， 23.細(xì)胞培養(yǎng)基入口， 24.陽性藥物入口。
具體實施方式
本發(fā)明中高通量藥物篩選芯片的制作步驟為(1) 利用Coredraw繪圖軟件設(shè)計如圖1和圖2所示的溝道圖形，圖1所示 細(xì)胞注入和廢液輸出溝道為平滑分叉結(jié)構(gòu)，細(xì)胞注入口 1引出兩條細(xì)胞注入支流 溝道2，每條細(xì)胞注入支流溝道又分別引出兩條細(xì)胞注入支流溝道，廢液出口4 引出3條廢液支路溝道3。圖2所示溝道包括濃度梯度溝道5，定量細(xì)胞培養(yǎng)腔 室6，細(xì)胞進樣打孔處7，廢液出口打孔處9，細(xì)胞培養(yǎng)腔室構(gòu)成的三組細(xì)胞培 養(yǎng)平行腔室8、兩組空白對照腔室10和陽性藥物對照細(xì)胞培養(yǎng)腔室11。如圖3 所示藥物濃度梯度溝道14呈六邊形構(gòu)成的蜂窩狀，且六邊形的每條邊為折線， Cl、 C2、 C3、 C4、 C5分別為呈不同濃度的藥物出口溝道。細(xì)胞培養(yǎng)腔室結(jié)構(gòu)如 圖4所示，定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室19通過溝道與設(shè)在下層聚二甲基硅氧烷芯片上的 細(xì)胞進樣打孔處16和廢液出口打孔處20連接，藥物入口 18通過單向阻尼溝道 15與藥物注入溝道17連接，藥物注入溝道17即為藥物濃度梯度溝道14的藥物 出口溝道。細(xì)胞注入和廢液輸出溝道為分叉結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞注入和廢液輸出溝道深度為 50 100um，寬度為300 3000um。藥物濃度梯度溝道5為逐級分叉結(jié)構(gòu)，且溝 道深度為50 100ura，寬度為100 1000um。細(xì)胞培養(yǎng)腔室6、細(xì)胞培養(yǎng)平行腔室8、空白對照腔室10和陽性藥物對照細(xì) 胞培養(yǎng)腔室11尺寸為1000 3000um，然后用菲林打印機打印膠片掩膜；(2) 在4英寸潔凈硅片上均勻涂甩上50um厚的AZ50正型光刻膠；(3) 將涂膠硅片先于7(TC下烘烤6min,再于IO(TC下烘烤固化；(4) 將烘烤后的涂膠硅片與膠片掩膜平行對準(zhǔn)貼緊后,紫外充分曝光35s;(5) 曝光完成后，浸入顯影溶液，待顯影完全后，用去離子水沖洗干凈，再吹 干，便在硅片上制作出陽模圖形；(6) 利用上述制作工藝，制備出兩片具有如圖1和圖2所示溝道布局的硅片-光刻膠陽模。(7) 將聚二甲基硅氧烷(PDMS)預(yù)聚物灌注到上述兩片陽模上，待氣泡排盡 后，烘焙2-3h加速聚二甲基硅氧烷(TOMS)的固化；(8) 固化完全后，切割并剝離兩含溝道的聚二甲基硅氧垸(PDMS)，打孔，3min 的等離子體(PLASMA)處理后，細(xì)胞注入支流溝道2與細(xì)胞進樣打孔處16對準(zhǔn)鍵 合，細(xì)胞廢液支流溝道3和廢液出口打孔20處對準(zhǔn)鍵合，上下兩層PDMS芯片鍵 和在一起；(9) 將上述雙層PDMS芯片和玻璃載片3min的等離子體(PLASMA)處理后再鍵 合起來；(10) 70-90'C烘焙l-2h后，即制作出含兩層微溝道結(jié)構(gòu)的三維高通量藥物篩 選聚二甲基硅氧垸(PDMS)-玻璃芯片。用上述方法制得的三維高通量藥物篩選芯片由雙層聚二甲基硅氧烷芯片與 玻璃載片鍵合而成，如圖5所示。其中第一層聚二甲基硅氧烷-玻璃芯片上設(shè)有 細(xì)胞注入和廢液輸出溝道，另一層聚二甲基硅氧垸芯片上設(shè)有藥物濃度梯度溝道 和定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室以及細(xì)胞進樣打孔處和廢液出口打孔處，定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室 與藥物濃度梯度溝道的出口溝道連接，且定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室通過溝道分別與細(xì)胞 進樣打孔處和廢液出口打孔處連接，，第一層聚二甲基硅氧垸芯片的細(xì)胞注入和 廢液輸出溝道通過細(xì)胞進樣打孔處和廢液出口打孔處與另一層聚二甲基硅氧烷 芯片鍵合在一起，鍵和在一起的兩層聚二甲基硅氧烷芯片再與玻璃載片鍵合在一 起。細(xì)胞培養(yǎng)腔室構(gòu)成三行平行試驗微腔室、兩行空白對照微腔室和一行陽性對 照微腔室。本發(fā)明中三維芯片高通量藥物篩選的操作步驟為1) 排氣，往整個芯片溝道內(nèi)注滿PBS緩沖液，使芯片溝道內(nèi)部氣體排盡。2) 灌注細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮液從細(xì)胞進樣口 1注入圖4所示微腔室中，使各個 培養(yǎng)腔室中灌注等量細(xì)胞懸浮液。3) 將芯片放入5%0)2培養(yǎng)箱中，靜置4 8h后，細(xì)胞逐漸實現(xiàn)貼壁。4) 貼壁完成后，將呈藥物濃度梯度的培養(yǎng)基通入培養(yǎng)微腔室，5。/。C02培養(yǎng)箱 中36. 5"恒溫培養(yǎng)24-48h ，再用PBS緩沖液將多余藥物沖洗干凈。5) 從細(xì)胞培養(yǎng)基入口 21禾C(細(xì)胞培養(yǎng)基入口 23注入含四甲基偶氮唑鹽(MTT試劑)的培養(yǎng)基，使其注入各個微腔室，然后5%0)2培養(yǎng)箱中36.5。C恒溫培養(yǎng) 10h,再用PBS緩沖液將微腔室內(nèi)多余四甲基偶氮唑鹽(MTT試劑)沖洗干凈。6) 從細(xì)胞培養(yǎng)基入口注入二甲基亞砜(DMS0)，使其流入各個微腔室，搖晃 10-15min，用光纖光譜儀測量各個微腔室中殘留物的吸收光譜，數(shù)據(jù)處理后，繪 制出不同藥物濃度下的細(xì)胞生長曲線。7) 分析試驗所得的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，找出藥物對細(xì)胞作用的量效關(guān)系，從而檢驗評 價藥物的療效作用。本發(fā)明的藥物篩選芯片，通過實驗驗證，完全達(dá)到藥物篩選的使用要求。
權(quán)利要求
1.一種三維高通量藥物篩選芯片，至少包括聚二甲基硅氧烷和玻璃載片，其特征是第一層聚二甲基硅氧烷芯片上設(shè)有細(xì)胞注入和廢液輸出溝道；另一層聚二甲基硅氧烷芯片上設(shè)有藥物濃度梯度溝道和定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室以及細(xì)胞進樣打孔處和廢液出口打孔處，定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室與藥物濃度梯度溝道的出口溝道連接，且定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室通過溝道分別與細(xì)胞進樣打孔處和廢液出口打孔處連接，第一層聚二甲基硅氧烷芯片的細(xì)胞注入和廢液輸出溝道通過細(xì)胞進樣打孔處和廢液出口打孔處與另一層聚二甲基硅氧烷芯片鍵合在一起，鍵合在一起的兩層聚二甲基硅氧烷芯片再與玻璃載片鍵合在一起。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維高通量藥物篩選芯片，其特征是定量細(xì)胞培養(yǎng) 腔室構(gòu)成平行試驗組微腔室、空白對照組微腔室和陽性藥物對照組微腔室。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的三維高通量藥物篩選芯片，其特征是細(xì)胞注入和廢液輸出溝道為分叉結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞注入和廢液輸出溝道深度為50 100um，寬度為 300 3000um。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的三維高通量藥物篩選芯片，其特征是藥物濃度梯度 溝道為逐級分叉結(jié)構(gòu)，且溝道深度為50 100um，寬度為100 1000um。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維高通量藥物篩選芯片，其特征是定量細(xì)胞培養(yǎng) 腔室尺寸在1000 3000um之間。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的三維高通量藥物篩選芯片，其特征是細(xì)胞 注入和廢液輸出溝道和藥物濃度梯度溝道為單向阻尼結(jié)構(gòu)或溝道內(nèi)設(shè)有微閥門。
7. —種權(quán)利要求1所述三維高通量藥物篩選芯片的制備方法，其特征是包括以下 步驟(1) 設(shè)計細(xì)胞注入和廢液輸出溝道和藥物濃度梯度溝道的圖形，然后打印出 膠片掩膜，溝道深度為50 100um，溝道寬度為100 3000um，定量細(xì)胞培養(yǎng)腔 室尺寸在1000 3000咖之間；(2) 在潔凈硅片上均勻涂甩上AZ50正型光刻膠；(3) 將涂膠硅片先于70 IO(TC下烘烤固化；(4) 將烘烤后的涂膠硅片與膠片掩膜平行對準(zhǔn)貼緊后，紫外充分曝光；(5) 曝光充分后浸入顯影溶液，待顯影完全后，用去離子水沖洗干凈,再吹干，在涂膠硅片上制作出陽模圖形；(6) 重復(fù)步驟(1) (5)，分別制備兩片出帶細(xì)胞注入和廢液輸出溝道和藥 物濃度梯度溝道布局的硅片-光刻膠陽模。(7) 將聚二甲基硅氧烷預(yù)聚物灌注到制得的兩片硅片-光刻陽模上，待氣泡排 盡后，烘焙2 3h，直至固化完全；(8) 切割并剝離兩片含溝道的聚二甲基硅氧烷，打孔，等離子體處理后，第一層聚二甲基硅氧垸芯片的細(xì)胞注入和廢液輸出溝道通過細(xì)胞進樣打孔處和廢 液出口打孔處與另一層聚二甲基硅氧垸芯片對準(zhǔn)鍵合得雙層聚二甲基硅氧烷芯片；(9) 將上述雙層聚二甲基硅氧垸芯片和玻璃載片等離子體處理后再鍵合在一起；(10) 70 9(TC烘焙1 2h后，即制作出含兩層微溝道結(jié)構(gòu)的三維高通量藥物 篩選聚二甲基硅氧垸-玻璃芯片。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述三維高通量藥物篩選芯片的制備方法，其特征是步驟(1) 中設(shè)計的細(xì)胞注入和廢液輸出溝道中的細(xì)胞注入口為分叉結(jié)構(gòu)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述三維高通量藥物篩選芯片的制備方法，其特征是步驟(l) 中設(shè)計的藥物濃度梯度溝道藥物濃度梯度溝道為逐級分叉結(jié)構(gòu)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種三維高通量藥物篩選PDMS-玻璃芯片及其制備方法，利用微機電加工和微塑膜技術(shù)，制作出一種兩層微溝道結(jié)構(gòu)的三維PDMS-玻璃芯片。第一層PDMS芯片的細(xì)胞注入和廢液輸出溝道與另一層聚二甲基硅氧烷芯片鍵合在一起，另一層PDMS芯片上設(shè)有藥物濃度梯度溝道和定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室，定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室與藥物濃度梯度溝道的出口溝道連接，且定量細(xì)胞培養(yǎng)腔室通過溝道分別與細(xì)胞進樣打孔處和廢液出口打孔處連接，本發(fā)明可以克服傳統(tǒng)藥物篩選技術(shù)中工作量繁重，試劑和藥物消耗大，篩選周期長和開發(fā)成本高的缺點。在細(xì)胞水平的藥物篩選應(yīng)用中，實現(xiàn)芯片微型化、高通量、低成本、試劑消耗小、試驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠和操作流程簡便的設(shè)計要求。
文檔編號C12M1/00GK101245311SQ200810046929
公開日2008年8月20日 申請日期2008年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月26日
發(fā)明者張南剛, 王曉明, 趙興中 申請人:武漢大學(xué);湖北中醫(yī)學(xué)院