專利名稱：Exendin-4高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種Exendin-4高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種世界性疾病，全世界糖尿病患者已超過1.5億患者,其中2型 糖尿病患者占90%。在我國2型糖尿病患者將近4000萬，隨著生活水平的提高， 發(fā)病率將越來越高。目前治療2型糖尿病的藥物(西藥)主要有磺酰類、雙胍 類、a-葡萄糖苷酶抑制劑、格列酮類胰島素增敏劑以及格列奈類胰島素促分泌劑 等。這些藥物有不同程度的副作用，例如促胰島素分泌藥物，其促進(jìn)胰臟分泌 胰島素作用并不依賴血糖濃度的高低，不僅產(chǎn)生空腹低血糖癥狀，而且長期使 用會因胰島素分泌過度而導(dǎo)致胰臟(3-細(xì)胞衰竭。因而，每年約有10%的11型糖 尿病病人由于治療失效而病情加劇，引發(fā)高血壓、腦血管病變、白內(nèi)障、心肌 梗塞、下肢壞疽等致殘、致死的并發(fā)癥。
Exendin-4是一種含39個氨基酸的活性調(diào)節(jié)肽，源于爬行動物的激素。 Exendin-4能通過以下多種機制降低血糖，改善糖尿病患者的病情l)刺激葡萄 糖依賴的胰島素分泌，Exendin-4僅在高血糖時刺激胰島素分泌，而在正?；虻?血糖水平不促進(jìn)胰島素分泌，使Exendin-4更加安全；2)通過刺激(3-細(xì)胞新生 和增殖、抑制細(xì)胞凋亡等來改善胰島卩-細(xì)胞量，從而阻止和逆轉(zhuǎn)病情，使根治 糖尿病成為可能;3)降低2-型糖尿病病人饑餓及餐后血循環(huán)中的胰高血糖素;4) 調(diào)節(jié)葡萄糖在外周組織的轉(zhuǎn)運。除了作用胰島細(xì)胞，該蛋白還能直接作用于肝 臟和肌肉細(xì)胞，不依賴胰島素的途徑來抑制糖原的降解和促進(jìn)糖原的合成，達(dá) 到降血糖的作用；5) Exendin-4可以減緩胃排空、抑制食物吸收。而且由于 Exendin-4在體內(nèi)的半衰期為9.57小時，使其成為一種應(yīng)用前景非常看好的新型 2-型糖尿病治療藥物，在同類藥物中具有極強的竟?fàn)幜Α?004年美國Amylin公 司首先化學(xué)合成了 Exendin-4，并獲得專利。2005年4月29日此藥獲得了美國 FDA的上市批準(zhǔn)。臨床實驗表明，Exendin-4能有效控制二甲雙胍療效不理想的 2—型糖尿病，降低空腹及餐后血糖濃度、糖化血紅蛋白含量及體重，延緩疾病 進(jìn)程，延長壽命，提高生活質(zhì)量，減少心血管病發(fā)生；與其他同類治療2 —型糖尿病的藥物相比，Exendin-4不僅副作用小，適合長期使用，而且性價比比其他 藥物更高，經(jīng)濟實惠，適合大多數(shù)人使用。
但是目前Exendin-4主要采用化學(xué)合成，成本高(對原料氨基酸及儀器設(shè)備 要求極高)、產(chǎn)量少，市價高達(dá)7000元/毫克。利用基因工程生產(chǎn)Exendin-4，不 僅可以實現(xiàn)工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)、有效地降低產(chǎn)生成本，而且終產(chǎn)品污染各種 有害化合物的機會極小，產(chǎn)品更加安全。華東科技大學(xué)Xiaopu Yin等人曾將 Exendin-4基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，但產(chǎn)量極低，最后得到純度80%的重組 Exendin-4僅3.14mg/Kg細(xì)菌(Xiaopu Yin， Dongzhi Wei， Lina Yi， Expression and purification of Exendin-4, a GLP-1 receptor agonist, in Escherichis coli， Protein Expression and Purification, 2005, 41: 259-265,)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種Exendin-4高產(chǎn)工 程菌株的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
Exendin-4高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建方法是g以下步驟進(jìn)行的
(1) Exendin-4基因的改造將Genebank中登錄編號為AAB22006的 Exendin-4基因改造為具有SEQ ID No.l所示核苷酸序列的Exendin-4基因；人 工合成Exendin-4基因，采用PCR方法，以5'GGTACCGACGACGACGACAAGC 3'為正向引物，以5'CCATGGTTATCAAGATGGTGGCG 3'為反向引物，在 Exendin-4基因5'端加上限制性內(nèi)切酶Kpn I位點；在Kpn I位點后添加編碼腸 激酶識別位點DDDDK的核酸序列GACGACGACGACAAG，使腸激酶識別位 點的核酸序列與Exendin-4基因緊密相連；在Exendin-4基因3'端添加兩個相連 的終止密碼子TGATAA和限制性內(nèi)切酶NcoI (CCATGG)位點。
(2) 克隆載體pMD19-T-Exendin-4的構(gòu)建利用PCR擴增的改造后的 Exendin-4，純化后與pMD19-T載體連接，構(gòu)建克隆載體pMD19-T-Exendin-4。
(3) 高效表達(dá)載體pET-32a (+) - Exendin-4的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Nco I雙酶切pMD19-T-Exendin-4質(zhì)粒，回收目的片斷；用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Nco I消化表達(dá)載體質(zhì)粒pET-32a (+)，回收載體pET-32a (+)大片段，將 二者連接即重組Exendin-4表達(dá)載體？￡丁-32江(+)- Exendin-4;將表達(dá)載體pET-32a
(+) - Exendin-4轉(zhuǎn)化入大腸桿菌工程菌BL21(DE3)pLYS中，得到Exendin-4 高產(chǎn)工程菌株BL21(DE3)pLYS—pET-32a (+) -Exendin隱4。由于本發(fā)明對目的基因Exendin-4進(jìn)行了改造，使其能在大腸桿菌中高效表 達(dá)，預(yù)表達(dá)試驗表明BL21(DE3)pLYS—pET-32a (+) - Exendin-4為高產(chǎn)菌株。 重組Exendin—4產(chǎn)量達(dá)細(xì)菌總蛋白的15%。純化后，每克菌體可獲得6.44mg 純度為98%的重組Exendin—4。腸激酶消化后每克菌體可獲得1.2mg純度99% 以上的游離Exendin-4。在Exendin-4用量為0.7pg/kg小鼠時，糖尿病小鼠 (BKS.Cg-m +/+ Lepr db/J小鼠)腹腔注射lh后血糖降低15.79%, 4h后血糖降 低達(dá)40.08%。


圖1是PCR擴增改造后Exendin-4，大小正確，其中1是PCR擴增的目的 基因，M是DNA Marker。
圖2是pMD19-T-Exendin-4重組質(zhì)粒和PCR鑒定，序列測定表明重組 Exendin-4克隆載體序列正確，與理論設(shè)計完全一致。其中1. pMD19-T-Exendin-4 重組載體2.以pMD19-T-Exendin-4質(zhì)粒為模板，PCR擴增產(chǎn)物，M. DNA Marker 。
圖3 pET-32a (+) - Exendin-4質(zhì)粒(A)和PCR鑒定(B)，測序顯示表 達(dá)載體構(gòu)建成功，序列與理論設(shè)計一致。圖A 1.pET-32a ( + ) -Exendin-4重組 質(zhì)粒；圖B 1.以pET-32a(+)-Exendin-4質(zhì)粒為模板，PCR擴增結(jié)果；M. DNA Marker o
圖4重組Exendin—4預(yù)表達(dá)及產(chǎn)量計算。融合蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)表達(dá)時間 延長而增加，6小時表達(dá)量最多，達(dá)細(xì)菌全蛋白含量15%。 1:誘導(dǎo)前，2:誘導(dǎo) lh， 3:誘導(dǎo)2h， 4:誘導(dǎo)3h, 5:誘導(dǎo)4h， 6:誘導(dǎo)5h， 7:誘導(dǎo)6h; M:蛋 白質(zhì)Marker 。
圖5是不同Exendin-4用量對糖尿病小鼠血糖濃度變化的影響。A、 B、 C 組分別腹腔注射100ul 0.7 ug/kg、 7ug/kg、 35ug/kg Exendin-4;對照組腹腔注射 生理鹽水(D組)。1.用藥前；2.用藥后lh; 3.用藥后4h。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作詳細(xì)說明。 1.Exendin-4基因的改造
Exendin-4多肽含39個氨基酸殘基，GeneBank的登錄編號是AAB22006， 其mRNA序列登錄編號是HSU77613。
根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，將原來39個密碼子的70% (27個密碼子的堿
5基組成)進(jìn)行了改造，使Exendin-4基因適應(yīng)大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)，改造后的 Exendin-4高效表達(dá)的基因序列如SEQ IDNo.l。
采用人工合成的方法，合成Exendin-4基因，將其保存在質(zhì)粒中。然后采用 PCR方法，對Exendin-4基因進(jìn)一步修飾在其5'端加上限制性內(nèi)切酶Kpn I (GGTACC)位點；在KpnI位點后添加編碼腸激酶識別位點(DDDDK)的核 酸序列GACGACGACGACAAG,使腸激酶識別位點的核酸序列與Exendin-4基 因緊密相連，并完全按照三聯(lián)密碼編碼，無移碼突變；另外，在Exendin-4基因 3'端添加兩個相連的終止密碼子TGATAA和限制性內(nèi)切酶NcoI (CCATGG)。 PCR引物設(shè)計如下
正向引物5'GGTACCGACGACGACGACAAGC 3'
反向引物5'CCATGGTTATCAAGATGGTGGCG 3'。
2. 重組Exendin-4表達(dá)載體的構(gòu)建
2.1克隆載體pMD19-T-Exendin-4的構(gòu)建
利用PCR擴增改造后的Exendin-4，純化后與pMD19-T載體連接，構(gòu)建克 隆載體pMD19-T-Exendin-4，將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ToplO中，利用氨芐抗 性和藍(lán)白斑菌落篩選，挑選陽性克隆，測序鑒定并保種。
2.2高效表達(dá)載體pET-32a (+) - Exendin-4的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Nco I雙酶切pMD19-T-Exendin-4質(zhì)粒，1%瓊脂 糖電泳分離后，利用DV805A膠回收試劑盒(寶生物)回收目的片斷；同時也 用相同的限制性內(nèi)切酶消化表達(dá)載體質(zhì)粒pET-32a(+)，利用DV807A試劑盒(寶 生物)回收載體pET-32a (+)大片段，將二者連接即重組Exendin-4表達(dá)載體 pET國32a (+) - Exendin-4 (簡寫為pET-32aE4),將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO中。 利用氨芐抗性和藍(lán)白斑挑選陽性克隆，測序鑒定并保種。培養(yǎng)含pET-32aE4的 菌株，利用堿性一SDS裂解法制備pET-32aE4質(zhì)粒。將表達(dá)載體pET-32aE4轉(zhuǎn) 化入不同的大腸桿菌工程菌BL21(DE3)pLYS中。
3. 獲得Exendin-4
預(yù)表達(dá)試驗表明BL21(DE3)pLYS—pET-32aE4為高產(chǎn)菌株。當(dāng)菌液濃度達(dá) OD600-0.6時，lmMIPTG在30oC， 220rpm誘導(dǎo)6小時，SDS-PAGE分析表明 重組Exendin—4產(chǎn)量最高，達(dá)細(xì)菌總蛋白的15%。純化后，每克菌體可獲得 6.44mg純度為98X的重組Exendin—4。腸激酶消化后每克菌體可獲得1.2mg純 度99%以上的天然結(jié)構(gòu)Exendin-4。4. Exendin-4降糖活性測定
取IO周齡，體重41.07±0.5(^糖尿病小鼠81:8^^-111+/+1^ "(11)〃小鼠(南 京大學(xué)國家遺傳工程小鼠資源庫)，斷食2小時，尾部取血。然后分別腹腔注射 100ul Exendin-4，用量分別為0.7 ug/kg小鼠(A組)、7ug/kg小鼠(B組)和35ug/kg 小鼠(C組)；對照組腹腔注射生理鹽水(D組)。注射后lh及4 h尾部取血， 用試劑盒(上海榮盛生物技術(shù)公司)測定血糖濃度。結(jié)果表明Exendin-4用量為 0.7pg/kg時，糖腹腔注射lh后血糖降低15.79%， 4h后血糖降低達(dá)40.08%; Exendin-4用量為7ug/kg時，注射后lh和4h血糖分別降低23.8%和51.93% (圖 5 )，降糖效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于國內(nèi)同類產(chǎn)品的功能(Protein Expression and Purification, 2005， 41: 259—265; BiotechnolLett, 2008， 30:651-656;專禾!j: 2005100440823.8; 200410062650.5)，也優(yōu)于美國Amylin公司化學(xué)合成的Exendin-4 (DIABETES, 1999, 48:1026-1034))。
本發(fā)明中涉及的質(zhì)粒制備、感受態(tài)細(xì)胞制備、轉(zhuǎn)化及凝膠電泳等均按照《分 子克隆》操作步驟進(jìn)行。
限制性內(nèi)切酶消化、DNA的回收與純化均按寶生物公司的使用說明進(jìn)行操作。<no>河甫農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120> Exendin-4高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建方法 <160> 1
<170> Patentln Version 3. 3
〈210〉 1 <211〉 117 <212> ■ 〈213〉人工序列
〈220>
〈221〉 misc—feature
<222〉 (1)…(117) 〈223〉大腸桿菌嗜性
〈400> 1
acggtgaag gtactttcac ctctgacctg tctaaacaga tggaagaaga agctgttcgt 60 ctgttcatcg aatggctgaa aaacggtggt ccgtcttctg gtgctccgcc accatct 11權(quán)利要求
1.一種Exendin-4高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于它是按以下步驟進(jìn)行的(1)Exendin-4基因的改造將Genebank中登錄編號為AAB22006的Exendin-4基因改造為具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的Exendin-4基因；人工合成Exendin-4基因，采用PCR方法，以5′GGTACCGACGACGACGACAAGC 3′為正向引物，以5′CCATGGTTATCAAGATGGTGGCG 3′為反向引物，在Exendin-4基因5′端加上限制性內(nèi)切酶Kpn I位點；在Kpn I位點后添加編碼腸激酶識別位點DDDDK的核酸序列GACGACGACGACAAG，使腸激酶識別位點的核酸序列與Exendin-4基因緊密相連；在Exendin-4基因3′端添加兩個相連的終止密碼子TGATAA和限制性內(nèi)切酶Nco I(CCATGG)位點；(2)克隆載體pMD19-T-Exendin-4的構(gòu)建利用PCR擴增的改造后的Exendin-4，純化后與pMD19-T載體連接，構(gòu)建克隆載體pMD19-T-Exendin-4；(3)高效表達(dá)載體pET-32a(+)-Exendin-4的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Nco I雙酶切pMD19-T-Exendin-4質(zhì)粒，回收目的片斷；用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Nco I消化表達(dá)載體質(zhì)粒pET-32a(+)，回收載體pET-32a(+)大片段，將二者連接即重組Exendin-4表達(dá)載體pET-32a(+)-Exendin-4；將表達(dá)載體pET-32a(+)-Exendin-4轉(zhuǎn)化入大腸桿菌工程菌BL21(DE3)pLYS中，得到Exendin-4高產(chǎn)工程菌株BL21(DE3)pLYS-pET-32a(+)-Exendin-4。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。具體涉及Exendin-4目的基因的改造和表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)Gene Bank中登錄的Exendin-4的氨基酸序列，結(jié)合大腸桿菌的密碼子偏嗜性，對原有基因70％的密碼子進(jìn)行改造，使其能在大腸桿菌中高效表達(dá)；添加合適的酶切位點和腸激酶位點，構(gòu)建合適的表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入不同的大腸桿菌工程菌，篩選高效表達(dá)Exendin-4的菌株。
文檔編號C12N1/21GK101586104SQ200810049810
公開日2009年11月25日 申請日期2008年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月19日
發(fā)明者孟凡榮, 王小純, 祖向陽 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)