專利名稱：一種微生物活菌數(shù)快速檢測方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種微生物活菌快速檢測方法。本發(fā)明涉及一種通過美蘭染色的方法，將微 生物活菌與死菌加以區(qū)分，通過生物顯微鏡鏡檢的方法快速檢測微生物活菌數(shù)量。本發(fā)明方 法適合各種生物學、醫(yī)藥、食品以及其它各種物品中微生物活菌數(shù)量的快速檢測。
背景技術(shù)：
微生物活菌數(shù)的快速、準確的檢測，是生物學界、醫(yī)藥界、食品界需要亟待解決的突出 的問題。目前通用的微生物數(shù)的檢測大都按國家食品衛(wèi)生標準規(guī)定方法，采用標準平皿計數(shù) 法檢測菌落總數(shù)。
對于微生物數(shù)的檢測國內(nèi)外均有不少的檢測方法，主要的和使用的最多的方法為標準平 皿培養(yǎng)計數(shù)法，還有直接染色還原計數(shù)法、旋轉(zhuǎn)平板計數(shù)方法、疏水性柵格濾膜法、測試片 法、直接外熒光濾過技術(shù)、全平器計數(shù)法、最近似數(shù)測定法、微菌落技術(shù)、放射測量法、阻 抗檢測法、電位及電流分析法、ATP生物發(fā)光法、接觸酶測量儀、微量量熱法等。
按國家食品衛(wèi)生標準方法規(guī)定，采用標準平皿計數(shù)法測定菌落總數(shù):.，培養(yǎng)時間多采用
48h，需要制備培養(yǎng)基、清洗消毒試驗器材等大量的準備及收尾工作，操作繁瑣費時。此法 具有準確、可靠等優(yōu)點。但是此法培養(yǎng)時間較長，因此這種通用的方法具有配制過程復雜， 檢測周期過長，成本高等缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種微生物活菌數(shù)快速檢測方法，以克服現(xiàn)有檢測方法配制過程 復雜，檢測周期過長，成本高等缺點。
本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的 一種微生物活菌數(shù)快速檢測方法，包括以下步驟
a) 樣品的選擇檢測樣品分為固體樣品和液體樣品；
b) 采樣樣品的制備通過無菌操作取一定量溶液樣品進行離心處理后，取上清液，再 以更高的速度離心處理，棄去上清液，用移液器取出底部少量溶液；
C)微生物活菌數(shù)的檢測將移液器取出的底部溶液，涂在載玻片上，經(jīng)干燥固定，用 美蘭染色，沖洗后用生物顯微鏡鏡檢，記錄被美蘭染色且呈現(xiàn)空心狀態(tài)的圖像的個數(shù)來計數(shù) 微生物數(shù)量。
所述的固體樣品，通過放于盛有生理鹽水或/和蛋白胨水溶液的滅菌玻璃瓶內(nèi)，瓶內(nèi)預 置玻璃珠，經(jīng)充分振搖或研磨做成均勻溶液，然后，按與溶液樣品同樣的處理方式進行離心 處理。
所述的溶液樣品例行處理以(500 3000)r/min的速度離心處理(1 5):;nin,取(80 90:'%的上清液，再以(10000 14000) r/min的速度離心處理(3~8) min，棄去上清液，用移 液器取出底部少量溶液。
所述的固體樣品，以無菌操作取(20~30) g樣品，放于含有(50~100) ml生理鹽水的 滅菌玻璃瓶內(nèi)，瓶內(nèi)預置玻璃珠，經(jīng)充分振搖或研磨做成均勻溶液。
使用本發(fā)明方法可以快速檢測樣品中的維生物活菌數(shù)量。本發(fā)明微生物活菌數(shù)量檢測是 通過生物顯微鏡鏡檢定量樣品中被美蘭染色且呈現(xiàn)空心狀態(tài)的微生物數(shù)量快速檢測微生物 活菌數(shù)量的。本發(fā)明微生物活菌數(shù)量檢測是通過對樣品的預處理去除雜質(zhì)分離出微生物，進 行濃縮、將濃縮后的定量的樣品涂在載波片上，通過美蘭染色，通過生物顯微鏡鏡檢涂有定 量樣品的載玻片上的被美蘭染色且呈現(xiàn)空心狀態(tài)的圖像的個數(shù)來計數(shù)微生物數(shù)量。本發(fā)明方 法適合各種生物學界、醫(yī)藥界、食品界以及其它各種物品中微生物大腸菌群的快速檢測。
本發(fā)明涉及一種微生物活菌數(shù)快速檢測方法，是采用離心或Z和蛋白質(zhì)沉淀的方法對樣 品進行預處理，去除雜質(zhì)分離微生物，采用離心的方法將除雜后含有微生物樣品進行濃縮， 將濃縮后的定量的樣品涂在載玻片上，待干進行美蘭染色，小心清洗，通過生物顯微鏡鏡檢 涂有定量樣品的載玻片上的被美蘭染色且呈現(xiàn)空心狀態(tài)的圖像個數(shù)來計數(shù)微生物數(shù)量。
采用本發(fā)明的一種微生物活菌數(shù)快速檢測方法，通過生物顯微鏡鏡檢涂有定量樣品的載 玻片上的被美蘭染色且呈現(xiàn)空心狀態(tài)的圖像個數(shù)來計數(shù)微生物數(shù)量，其原理如下
美蘭是一種弱氧化劑，氧化態(tài)呈藍色，還原態(tài)呈無色?；畹奈⑸锛毎蛐玛惔x的 不斷進行，具有一定的還原能力，能將進入細胞的美蘭還原，而細胞核不被染色，細胞膜呈 現(xiàn)藍色。因此，美蘭染色后活菌呈現(xiàn)空心狀態(tài)藍色，而死菌呈現(xiàn)實心的藍色，以此來區(qū)分微 生物活菌和死菌。通過生物顯微鏡鏡檢計數(shù)被美蘭染色且呈現(xiàn)空心狀態(tài)的圖像個數(shù)來計數(shù)微 生物數(shù)量。
采用本發(fā)明的一種微生物活菌數(shù)快速檢測方法，通過生物顯微鏡鏡檢涂有定量樣品的載 玻片上的被美蘭染色且呈現(xiàn)空心狀態(tài)的圖像個數(shù)來計數(shù)微生物數(shù)量，其方法如下
(1) 樣品的選擇
檢測樣品分為固體樣品和液體樣品。
固態(tài)樣品如糖果類、焙烤類、非發(fā)酵性豆制品類、膨化食品類、肉灌腸類。 液體樣品如液態(tài)乳制品類、果蔬汁類、飲料類、飲用水類。
(2) 采樣樣品的制備
① 固體樣品
以無菌操作取25g(ml)樣品，放于含有55ml蛋白胨水溶液的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預置適 當數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖或研磨做成均勻溶液。取溶液lml，以500r/min 3000r/min 的速度離心處理2min，取上清液0.8 ml，再以10000r/min 14000r./min的速度離心處理5rain， 棄去上清液，用移液器取出底部5ul溶液。
② 液體樣品
以無菌操作取lml樣品，以500r/min 3000r/min的速度離心處理2min,取上:青液0..8 ml，再以10000r/min 14000r/min的速度離心處理5min，棄去上清液，用移液器取出底部5 u:l 溶液。
③液態(tài)乳制品
以無菌操作取lml樣品，加入單寧等蛋白質(zhì)沉淀劑，以500r/min 3000r/min的速度離 心處理2min，取上清液0.8 ml，再以10000r/min 14000r/min的速度離心處理5min，棄去 上清液，用移液器取出底部5ul溶液。
(3)微生物活菌數(shù)的檢測
將移液器取出的底部5 ul溶液，涂在載玻片上，經(jīng)干燥固定，用美蘭染色2min，沖洗 后用生物顯微鏡鏡檢。記錄被美蘭染色且呈現(xiàn)空心狀態(tài)的圖像的個數(shù)來計數(shù)微生物數(shù)量。 檢測結(jié)果見表1。表1為本專利方法與平皿培養(yǎng)計數(shù)法檢測結(jié)果比較。
表1
本專利方法/平
本專利方法檢測結(jié)果平皿培養(yǎng)計數(shù)法皿培養(yǎng)計數(shù)法
110999217850001. 40:12
21399361230001. 1377
315722126001. 2478
4373430C01.2447
5213918001, 1883
65434601.1804
74933701. 3324
81391141, 2193
990741. 2162
104739L 2051
1130251. 2000
平均值
2339


圖1是顯微鏡鏡檢時被美蘭染色呈現(xiàn)空心狀態(tài)的微生物活菌圖像；
圖2是樣本平皿培養(yǎng)計數(shù)法與本專利方法微生物活菌數(shù)檢測結(jié)果的比較(曲線1為平皿 培養(yǎng)計數(shù)法，曲線2為本專利方法)；
圖3是微生物數(shù)從0到45000時的微生物檢測結(jié)果(曲線1為平皿培養(yǎng)計數(shù)法，曲線2 為本專利方法)；
圖4是微生物數(shù)從0到14000時的微生物檢測結(jié)果(曲線1為平皿培養(yǎng)計數(shù)法，曲線2 為本專利方法)；
圖5是對數(shù)坐標時微生物活菌數(shù)檢測結(jié)果對比(曲線1為平皿培養(yǎng)計數(shù)法，曲線2為本 專利方法)。
具體實施例方式
以下通過實施例的具體描述對本發(fā)明作進一步詳細說明。實施例1 液態(tài)食品樣品
以無菌操作分別取2個樣本，每個樣本取溶液lml，以500r/min 3000r/min的速度離心 處理2min，取上清液0.8 ml，再以10()00r/min 14000r/min的速度離心處理5min,棄去上 清液，用移液器取出底部5ul溶液。
將用移液器取出的底部5ul溶液的2個樣本，分別涂在2個載玻片上，經(jīng)千燥固定，用 美蘭染色2min，沖洗后用生物顯微鏡鏡檢。記錄被美蘭染色且呈現(xiàn)空心狀態(tài)的圖像個數(shù)來 計數(shù)微生物數(shù)量。將2個載波片上的樣本記錄的微生物數(shù)量相加得到液體樣品微生物活菌總 數(shù)。
實施例2 液態(tài)乳制品樣品
以無菌操作取7個樣本，每個樣本取溶液lml，加入單寧等蛋白沉淀劑，以500:r/min 3000r/min的速度離心處理2min，取上清液0.8 ml，再以10000r/min 14000r/min的速度離 心處理5min，棄去上清液，用移液器取出底部5ul溶液。
將用移液器取出的底部5ul溶液的7個樣本，分別涂在7個載玻片上，經(jīng)-P燥固定，用 美蘭染色2min，沖洗后用生物顯微鏡鏡檢。記錄被美蘭染色且i現(xiàn)空心狀態(tài)的圖像個數(shù)來 計數(shù)微生物數(shù)量。將7個載波片上的樣本記錄的微生物數(shù)量相加得到液態(tài)乳制品樣品微生物 活菌總數(shù)。
實施例3
固體類樣品
以無菌操作取25g(ml)樣品，放于含有55ml生理鹽水的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預置適當數(shù) 量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖或研磨做成均勻溶液。在溶液中分別取10個樣本，每個樣本取溶 液lml，以500r/min 3000r/min的速度離心處理2min,取上清液0.8ml，再以10000r/min 14000r/min的速度離心處理5min，棄去上清液，用移液器取出底部5 ul溶液'，
將用移液器取出的底部5ul溶液的10個樣本，分別涂在10個載玻片，經(jīng)干燥固定，用 美蘭染色2min，沖洗后用生物顯微鏡鏡檢。記錄被美蘭染色且且現(xiàn)空心狀態(tài)的圖像的個數(shù) 來計數(shù)微生物數(shù)量。將IO個載波片上的樣本記錄的微生物數(shù)量相加得到固體樣品微生物活 菌總數(shù)。
權(quán)利要求
1、一種微生物活菌數(shù)快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟a)樣品的選擇檢測樣品分為固體樣品和液體樣品；b)采樣樣品的制備通過無菌操作取一定量溶液樣品進行離心處理后，取上清液，再以更高的速度離心處理，棄去上清液，用移液器取出底部少量溶液；c)微生物活菌數(shù)的檢測將移液器取出的底部溶液，涂在載玻片上，經(jīng)干燥固定，用美蘭染色，沖洗后用生物顯微鏡鏡檢，記錄被美蘭染色且呈現(xiàn)空心狀態(tài)的圖像的個數(shù)來計數(shù)微生物數(shù)量。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物活菌數(shù)快速檢測方法，其特征在于所述的固體樣 品，通過放于盛有生理鹽水或/和蛋白胨水溶液的滅菌玻璃瓶內(nèi)，瓶內(nèi)預置玻璃珠，經(jīng)充分 振搖或研磨做成均勻溶液，然后，按與溶液樣品同樣的處理方式進行離心處理。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種微生物活菌數(shù)快速檢測方法，其特征在于所述的溶 液樣品例行處理以(500 3000) r/min的速度離心處理(1 5) min,取(80 90) %的上 清液，再以(10000 14000) r/min的速度離心處理(3~8) min，棄去上清液，用移液器取 出底部少量溶液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種微生物活菌數(shù)快速檢測方法，其特征在于所述的固 體樣品，以無菌操作取(20~30) g樣品，放于含有(50~100) ml生理鹽水的滅菌玻璃瓶內(nèi)， 瓶內(nèi)預置玻璃珠，經(jīng)充分振搖或研磨做成均勻溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物活菌數(shù)快速檢測方法。本發(fā)明微生物活菌數(shù)量檢測是通過對樣品的預處理去除雜質(zhì)分離出微生物，進行濃縮、將濃縮后的定量的樣品涂在載波片上，通過美蘭染色，通過生物顯微鏡鏡檢涂有定量樣品的載玻片上的被美蘭染色且呈現(xiàn)空心狀態(tài)的圖像的個數(shù)來計數(shù)微生物數(shù)量。本發(fā)明方法適合各種生物學界、醫(yī)藥界、食品界以及各種物品中微生物大腸菌群的快速檢測。
文檔編號C12Q1/02GK101413872SQ20081005134
公開日2009年4月22日 申請日期2008年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月27日
發(fā)明者殷涌光 申請人:吉林大學