專利名稱：：特異干擾豬瘟病毒基因組序列及高效治療豬瘟病毒感染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供一種特異干擾豬瘟病毒基因組序列，同時(shí)還公開(kāi)了高效治療豬瘟病毒感染的方法，涉及治療豬瘟病毒感染的藥物，屬于生物制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及的豬瘟病毒以下簡(jiǎn)寫(xiě)CSFV。目前，為了防止豬瘟病毒感染的一般采用被動(dòng)免疫(注射高免血清)和主動(dòng)免疫方法，但是仍然不能完全防治豬瘟流行。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)首次報(bào)道于1998年，是近兩年才逐漸發(fā)展起來(lái)的一種全新的技術(shù)，RNAi從一發(fā)現(xiàn)開(kāi)始就受到病毒學(xué)研究者的高度重視，被認(rèn)為是抗病毒感染的最有效方法之一并被用于病毒學(xué)研究領(lǐng)域。應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制病毒增殖的關(guān)鍵是獲得高效、特異的干擾小RNA(siRNA)序列。經(jīng)檢索應(yīng)用RNA干擾法生產(chǎn)治療豬瘟病毒感染的藥物未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種特異干擾豬瘟病毒基因組序列，用于T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，得到了高效、特異抑制豬瘟病毒的干擾RNA分子，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明還提供了利用該基因組序列生產(chǎn)的生物制劑，對(duì)CSFV的抑制效率高達(dá)到95.1-99.0%，在敏感動(dòng)物體內(nèi)能明顯阻止CSFV的感染，使動(dòng)物免于發(fā)病和死亡。本發(fā)明的特異干擾豬瘟病毒基因組序列如下AAGGATAGGTAGGGTGACAGGTAGTGACGGA;AAGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACC。本發(fā)明的豬瘟病毒基因組上序列制成的生物制劑可通過(guò)兩種方法實(shí)現(xiàn)方法一包括以下步驟合成所述序列的siRNA分子的正義鏈和反義鏈模板DNA和T7脂A聚合酶結(jié)合序列，利用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄設(shè)計(jì)合成siRNA分子，得到體外轉(zhuǎn)錄生成的siRNA分子豬瘟治療生物制劑。方法二包括以下步驟按照pSilencer3.1H1HygroshRNA載體使用方法，合成針對(duì)根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬瘟病毒基因組上序列的能生成shRNA分子的質(zhì)粒，得到豬瘟治療生物制劑。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)所選豬瘟病毒基因組上序列，利用RNA干擾技術(shù)設(shè)計(jì)合成RNA干擾分子后，這些RNA干擾分子能特異、高效抑制豬瘟病毒增殖從而對(duì)豬瘟病毒感染有明顯治療作用，對(duì)CSFV的抑制效率高達(dá)到95.1-99.0%，在敏感動(dòng)物體內(nèi)能明顯阻止CSFV的感染，使動(dòng)物免于發(fā)病和死亡。1.選擇干擾RNA分子作用的序列利用RNA干擾技術(shù)設(shè)計(jì)合成RNA干擾分子后，這些RNA干擾分子能特異、高效抑制豬瘟病毒增殖從而對(duì)豬瘟病毒感染有明顯治療作用。在豬瘟病毒基因組序列中的保守區(qū)域，根據(jù)具有AA-N29特征的31nt序列，進(jìn)行同源性和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，選擇豬瘟病毒基因組上的以下2個(gè)干擾RNA分子作用序列表1干擾RNA分子作用序列及其位置針對(duì)基因siRNA分子干擾序列位置*命名『AAGGATAGGTAGGGTGACAGGTAGTGACGGA721-751Nl『AAGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACC820-850N2*:位置相對(duì)與參考毒株shimen，GenBank登錄號(hào)AF092448。2.根據(jù)上述的干擾RNA分子作用序列Nl、N2制成豬瘟治療生物制劑可以通過(guò)以下兩種方法制得1)體外合成siRNA分子生物制劑根據(jù)干擾RNA分子作用的序列Nl、N2分別合成編碼siRNA分子的正義鏈和反義鏈模板DNA和T7RNA聚合酶結(jié)合序列，并確定對(duì)照序列為Nl序列的反向序列。利用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄設(shè)計(jì)合成siRNA分子，得到體外轉(zhuǎn)錄生成的siRNA分子豬瘟治療生物制劑。序列如下T7RNA聚合酶結(jié)合序列GGATCCTAATACGACTCACTATANl正義鏈模板序列AATCCGTCACTACCTGTCACCCTACCTATCCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCNl反義鏈模板序列AAGGATAGGTAGGGTGACAGGTAGTGACGGATATAGTGAGTCGTATTAGGATCCN2正義鏈模板序列AATTTCCCGTGGCTAATCCACTTCAGGGTTCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCN2反義鏈模板序列AAGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC對(duì)照的正義鏈模板序列AACCTATCCATCCCACTGTCCATCACTGCCTTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC對(duì)照的反義鏈模板序列AAAGGCAGTGATGGACAGTGGGATGGATAGGTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC將上述合成的DNA序列用無(wú)DNA酶、無(wú)RNA酶的水分別稀釋為100pmol/L，用PCR方法將它們分別合成為雙鏈DNA序列。2)質(zhì)粒表達(dá)shRNA干擾分子的生物制劑根據(jù)pSilencer3.1H1Hygro(Ambion)shRNA載體設(shè)計(jì)要求，設(shè)計(jì)用于表達(dá)shRNA干擾的DNA序列，設(shè)計(jì)策略見(jiàn)圖3。合成針對(duì)豬瘟病毒基因組上序列的能生成shRNA分子的質(zhì)粒，得到豬瘟治療生物制劑。為了提高序列正確退火成為雙鏈DNA分子的效率，設(shè)計(jì)為用DNA聚合酶合成的PCR策略，將表達(dá)目的shRNA序列的DNA序列拆分為兩段部分互補(bǔ)配對(duì)的序列，然后用VNTI3.0輔助分析，使拆分的兩段序列之間的互補(bǔ)配對(duì)堿基為21-23bp，而各拆分序列自身配對(duì)堿基少于10bp，以提高PCR合成雙鏈模板DNA的效率。表2合成各個(gè)shRNA模板DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>通過(guò)以下檢測(cè)方法證明本發(fā)明制劑具有抑制豬瘟病毒增殖的作用:例l體外合成的siRNA抑制豬瘟病毒增殖①計(jì)數(shù)PK-15細(xì)胞，用含10%小牛血清、0.3%谷氨酰胺、無(wú)抗生素的MEM營(yíng)養(yǎng)液以1.0X107孔傳代于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37°C5XC02培養(yǎng)24h，使貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)滿度約為30%-50%，吸去營(yíng)養(yǎng)液，用無(wú)血清無(wú)抗生素的MEM營(yíng)養(yǎng)液洗滌單層細(xì)胞3次，加入450uL無(wú)血清無(wú)抗生素的MEM備用。②用X-tremeGenesiRNATransfectionReagent(Roche)將合成的si腿分子轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，具體方法為分別于無(wú)核酸酶的離心管中加入無(wú)血清無(wú)抗生素的MEM營(yíng)養(yǎng)液47.5"L、X-tremeGenesi腿TransfectionReagent2.0"L,輕輕混勻，室溫靜置3-5min,取另一無(wú)核酸酶的離心管，加入無(wú)血清無(wú)抗生素的MEM營(yíng)養(yǎng)液48.0PL，siRNA分子(shNl+shN2，體積比1:1或sh對(duì)照)2.0uL，輕輕混合均勻，室溫靜置3-5min，混合上述兩個(gè)離心管中溶液，室溫靜置15-20min，使脂質(zhì)體和siRNA形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，然后分別加入PK-15細(xì)胞單層中，輕輕混勻，37t:孵育4-6h，用無(wú)血清無(wú)抗生素的MEM洗滌轉(zhuǎn)染細(xì)胞，換用含2%小牛血清的MEM營(yíng)養(yǎng)液于37°C，5%0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h，用5.0Xl(fTCID5。的豬瘟病毒Shimen株感染轉(zhuǎn)染了si脂A的細(xì)胞，感染后培養(yǎng)72h，用間接免疫熒光試驗(yàn)、Real-timePCR和病毒的半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)測(cè)定等方法檢測(cè)豬瘟病毒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的增殖，測(cè)定siRNA對(duì)豬瘟病毒感染增殖過(guò)程中病毒基因表達(dá)的抑制作用。表1間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞被感染情況結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>轉(zhuǎn)染siRNA的PK-15細(xì)胞感染豬瘟病毒后，間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，未轉(zhuǎn)染的PK-15細(xì)胞和轉(zhuǎn)染si對(duì)照的PK-15細(xì)胞，感染豬瘟病毒72h后，幾乎所有的細(xì)胞均能被熒光抗體染色，細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，轉(zhuǎn)染豬瘟病毒特異的siRNA(siNl+siN2)的細(xì)胞感染豬瘟病毒后，只有極少的細(xì)胞能被熒光抗體染色，出現(xiàn)熒光的細(xì)胞不到全部細(xì)胞的0.5%。表2Real-timePCR方法檢測(cè)病毒基因組增殖情況<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA分子的細(xì)胞感染病毒后72h,細(xì)胞總RNA中的豬瘟病毒基因組RNA拷貝數(shù)為5.95Xl(fcopies/5ng總RNA，而siNl+siN2轉(zhuǎn)染細(xì)胞的豬瘟病毒基因組RNA拷貝數(shù)為3.97X104copies/5ng總RNA，為轉(zhuǎn)染si對(duì)照細(xì)胞的1/15，表明導(dǎo)入細(xì)胞的豬瘟病毒特異的si認(rèn)A分子抑制了病毒在感染細(xì)胞中的增殖。回收Real-timePCR產(chǎn)物，進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明Real-timePCR擴(kuò)增片段為豬瘟病毒Shimen株NS5B基因片段，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果具有高度的特異性。表3測(cè)定細(xì)胞中病毒的半數(shù)細(xì)胞感染量(TCIDs。)增減情況<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染對(duì)照Si對(duì)照的細(xì)胞感染豬瘟病毒后，病毒能有效地在細(xì)胞中增殖，顯示出較高的感染滴度，感染后60h的TCID5。測(cè)定結(jié)果為1X10425'與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞感染豬瘟病毒后60h的相當(dāng)，表明轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染過(guò)程對(duì)細(xì)胞支持豬瘟病毒的增殖能力有效較小，而轉(zhuǎn)染豬瘟病毒siRNA分子(siNl+siN2)的細(xì)胞感染豬瘟病毒后，TCIDs。較低，病毒感染后60h，siNl、siN2、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的TCID5。與si對(duì)照的感染滴度相比，其TCID5為1/55倍，表明siNl+siN2有效地抑制了豬瘟病毒的增殖。例2.表達(dá)的shRNA抑制豬瘟病毒增殖用含有10%小牛血清、不含抗生素的MEM營(yíng)養(yǎng)液傳代PK-15細(xì)胞于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔5.0X1(V細(xì)胞/500uL個(gè)，37°C，5%002培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20-24h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)滿度達(dá)到90-95%，用Lipofectamine2000(Invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，(每孔細(xì)胞)方法為①取0.8yg質(zhì)粒(shNl+shN2，質(zhì)量比1:1)DNA加入50yL無(wú)血清無(wú)抗生素的MEM中，混勻。②取2.0uLLipofectamine2000加入50PL無(wú)血清無(wú)抗生素的MEM中，輕輕混勻，于室溫靜置5min。③將稀釋的質(zhì)粒DNA加入稀釋的Lipofectamine2000中，輕輕混勻后于室溫靜置20min，以形成DNA-Lipofectamine2000復(fù)合體。將形成的DNA-Lipofectamine2000加入到上述準(zhǔn)備的中，輕輕混勻，置于37"5%0)2培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染4-6h，換用含有2%小牛血清和抗生素的MEM，37°C5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用°◎抗生素抗性篩選將轉(zhuǎn)染了shRNA表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞，按優(yōu)化確定的傳代細(xì)胞滿度，用含10X血清的MEM傳代于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(同時(shí)傳代相同滿度的未轉(zhuǎn)染的PK-15細(xì)胞作為加壓的正常對(duì)照細(xì)胞)，培養(yǎng)24h后，換用含有殺細(xì)胞濃度的相應(yīng)抗生素(hygromicinB)、含有2X血清的MEM，37。C培養(yǎng)，殺死未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細(xì)胞。其間每隔3d換用含抗生素的新鮮營(yíng)養(yǎng)液，直至對(duì)照細(xì)胞完全死亡，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞長(zhǎng)出細(xì)胞集落。換用含有50%殺細(xì)胞濃度的相應(yīng)抗生素繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞集落長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔后，擴(kuò)大培養(yǎng)篩選所得細(xì)胞備用。⑥表達(dá)的shRNA抑制豬瘟病毒的效果檢測(cè)篩選得到的有抗生素抗性的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用無(wú)抗生素(hygromicinB)的MEM傳代于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)20-24h后，用1X102TCID5。的豬瘟病毒Shimen株感染，病毒感染后培養(yǎng)72h，用間接免疫熒光、Real-timePCR、病毒的半數(shù)細(xì)胞感染量(TCIDS,>)測(cè)定等方法檢測(cè)豬瘟病毒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的增殖，測(cè)定siRNA對(duì)豬瘟病毒感染增殖過(guò)程中病毒基因表達(dá)的抑制作用。表4間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞被感染情況<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞被感染情況結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的shRNA分子抑制了病毒感染細(xì)胞。表5Real-timePCR方法檢測(cè)基因組RNA拷貝數(shù)測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注抑制率-(對(duì)照分子數(shù)一shRNA樣品分子數(shù))/對(duì)照分子數(shù)X100X，計(jì)算shRNA抑制病毒基因組復(fù)制的效率，表中抑制倍數(shù)為對(duì)照/shRNA的值一l。Real-timePCR方法檢測(cè)基因組RNA拷貝數(shù)測(cè)定結(jié)果表明豬瘟病毒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的基因組復(fù)制受到了高效的抑制。表6穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞感染豬瘟病毒后不同時(shí)間tcid5。測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染sh對(duì)照的細(xì)胞，在豬瘟病毒感染后，其感染滴度增加迅速，在感染后48-60h達(dá)到高峰，體現(xiàn)了豬瘟病毒在PK-15細(xì)胞中增殖時(shí)其感染滴度的變化特點(diǎn)，而與對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染豬瘟病毒特異的shRNA表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞，豬瘟病毒的感染滴度增加速度慢，且比對(duì)照細(xì)胞的感染滴度低得多，在對(duì)照細(xì)胞的感染滴度達(dá)到高峰(48-60h)時(shí)，轉(zhuǎn)染豬瘟病毒特異的shRNA表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞的感染滴度仍然保持在較低的水平，且呈現(xiàn)出較為平滑的增長(zhǎng)趨勢(shì)，表明質(zhì)粒表達(dá)的豬瘟病毒特異的shRNA使豬瘟病毒的成熟的感染性的病毒粒子的組裝過(guò)程受到了抑制，且抑制作用能持續(xù)較長(zhǎng)的時(shí)間，轉(zhuǎn)染豬瘟病毒特異的shRNA表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞感染病毒后即使在感染滴度最高的時(shí)間(72-96h)，其感染滴度仍比對(duì)照低一個(gè)數(shù)量級(jí)。檢測(cè)結(jié)果表明，在感染后60h，按sh對(duì)照/shRNA—l計(jì)算抑制倍數(shù)，則shNl抑制豬瘟病毒TCIDs(,的倍數(shù)分別為71.1倍，即使在shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞TCID,;。較高的96h，仍然對(duì)病毒具有4-10倍的抑制效率。例3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平①購(gòu)進(jìn)35只日本大耳白家兔，進(jìn)行編號(hào)，飼養(yǎng)觀察7d，測(cè)定家兔正?；A(chǔ)體溫每天測(cè)定兩次，將編號(hào)的家兔用SPSS軟件進(jìn)行隨機(jī)分組，每組8只，分組及注射見(jiàn)表3。表3實(shí)驗(yàn)家兔分組<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)驗(yàn)家兔分組后，按上表的所示的注射劑量，分別注射轉(zhuǎn)錄獲得的siRNA(s皿+siN2，質(zhì)量比1:l)和shRNA(shNl+shN2，質(zhì)量比1:l)表達(dá)質(zhì)粒，其中質(zhì)粒在攻毒前24h注射，注射部位為頸部皮下，siRNA與攻毒同時(shí)注射，為靜脈注射。②HCLV攻毒及體溫測(cè)定注射shRNA表達(dá)質(zhì)粒和siRNA的家兔，通過(guò)靜脈注射50XID5。的豬瘟兔化弱毒株，注射后24h內(nèi)每12h測(cè)量2次體溫，24h后每間隔6h測(cè)定家兔體溫，直到家兔體溫恢復(fù)到正常體溫值。表7各組家兔的平均體溫rc)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>如表所示，在體外轉(zhuǎn)錄的siRNA實(shí)驗(yàn)組si對(duì)照、siNl+siN2兩個(gè)組中，注射轉(zhuǎn)錄的si對(duì)照組的家兔首次升溫超過(guò)基礎(chǔ)體溫的0.5'C的時(shí)間是在30h，之后動(dòng)物持續(xù)出現(xiàn)高熱，且能持續(xù)6個(gè)溫次(36h)至攻毒后60h，而實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)發(fā)熱時(shí)間的明顯比對(duì)照組延遲，siNl+siN2組的時(shí)間在攻毒后48h，比對(duì)照組的發(fā)熱時(shí)間延遲了12h，且發(fā)熱溫次只有3個(gè),且發(fā)熱期的平均體溫均低于對(duì)照組。在注射shRNA表達(dá)質(zhì)粒的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，注射sh對(duì)照表達(dá)質(zhì)粒的家兔發(fā)熱的時(shí)間出現(xiàn)在36h，持續(xù)時(shí)間為36h，而實(shí)驗(yàn)組shNl+shN2的發(fā)熱時(shí)間在54h，比對(duì)照組延遲了18h，持續(xù)時(shí)間為18h(3個(gè)溫次)。從表中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，注射豬瘟病毒特異干擾RNA的實(shí)驗(yàn)組均表現(xiàn)出發(fā)熱時(shí)間延遲，發(fā)熱平均溫度比對(duì)照組略低，且發(fā)熱持續(xù)時(shí)間比對(duì)照組大大縮短的特點(diǎn)，表明豬瘟病毒特異的干擾RNA延遲了豬瘟兔化弱毒株在家兔體內(nèi)的增殖，推遲了使家兔出現(xiàn)高熱反應(yīng)所需的病毒量。從圖2中的家兔體溫變化趨勢(shì)圖中可以看出，實(shí)驗(yàn)組的體溫上升速度明顯比對(duì)照組慢，出現(xiàn)持續(xù)高熱的時(shí)間比對(duì)照組的短，且溫度較對(duì)照組低。③抑制病毒增殖測(cè)定恢復(fù)到正常體溫的家兔，在6h內(nèi)捕殺，無(wú)菌采集家兔脾臟和腸系膜淋巴結(jié)，用Real-timePCR、病毒的半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID5。)測(cè)定等方法檢測(cè)豬瘟病毒在家兔體內(nèi)中的增殖，測(cè)定siRNA分子對(duì)豬瘟病毒感染增殖過(guò)程中病毒基因表達(dá)的抑制作用。在用50XID5。的豬瘟病毒兔化弱毒株攻毒后測(cè)定家兔的體溫，提取家兔脾臟總RNA，用Real-timePCR檢測(cè)病毒基因組增殖情況，結(jié)果顯示見(jiàn)表8。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結(jié)果表明，si對(duì)照,siNl+siN2，sh對(duì)照，shNl+shN2注射組所對(duì)應(yīng)的HCLV的ID50分別為1X10383，1X10"。，1X103.92，1X10313，對(duì)照組si對(duì)照的ID5。是siNl+siN2的4.22倍，sh對(duì)照的105。是shNl+shN2的6.18倍。測(cè)定結(jié)果表明注射轉(zhuǎn)錄的siRNA和shRNA表達(dá)質(zhì)粒均有效地抑制了豬瘟兔化弱毒株在家兔體內(nèi)的增殖。本發(fā)明的積極效果在于應(yīng)用RNA干擾法生產(chǎn)治療豬瘟病毒感染的生物制劑，得到了高效、特異抑制豬瘟病毒的干擾RNA分子，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明還提供了利用該方法生產(chǎn)的生物制劑，對(duì)CSFV的抑制效率高達(dá)到95.1-99.0°/。，在敏感動(dòng)物體內(nèi)能明顯阻止CSFV的感染，使動(dòng)物免于發(fā)病和死亡。圖1為本發(fā)明體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA分子示意圖。圖2家兔攻毒后的體溫曲線。圖3為本發(fā)明shRNA分子的示意圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1siRNA設(shè)計(jì)分析GenBank中己發(fā)表的豬瘟病毒基因組序列，選擇基因組中保守的區(qū)域，根據(jù)RNAi技術(shù)的要求，尋找具有AA-Nw特征的31nt序列，進(jìn)行BlastN和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，根據(jù)BlastN分析結(jié)果，用VNTI3.0軟件分析它們的(G+CH、Tm值、內(nèi)部發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)等理化參數(shù)，選擇(G+CH較低的序列，設(shè)計(jì)了針對(duì)豬瘟病毒N^基因的2個(gè)siRNA分子干擾序列。所設(shè)計(jì)的序列及其在豬瘟病毒基因組中的位置如表10所示表IOsiRNA分子干擾序列及其位置針對(duì)基因siRNA序列位置'命名『AAGGATAGGTAGGGTGACAGGTAGTGACGGA721-751Nl『AAGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACC820-850N2*:位置相對(duì)與參考毒株shimen，GenBank登錄號(hào)AF092448。實(shí)施例2體外合成siRNA:按T7RiboMAXExpressRNAiSystem(Promega)說(shuō)明書(shū)設(shè)計(jì)合成實(shí)施例1中選定的2個(gè)片段的siRNA分子的DNA序列和T7RNA聚合酶結(jié)合序列，并確定對(duì)照序列為Nl序列的反向序列，參見(jiàn)附圖l;分別合成轉(zhuǎn)錄各個(gè)siRNA分子的正義鏈和反義鏈的模板DNA，序列如下T7RNA聚合酶結(jié)合序列GGATCCTAATACGACTCACTATANl正義鏈模板序列AATCCGTCACTACCTGTCACCCTACCTATCCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCNl反義鏈模板序列AAGGATAGGTAGGGTGACAGGTAGTGACGGATATAGTGAGTCGTATTAGGATCCN2正義鏈模板序列MTTTCCCGTGGCTAATCCACTTCAGGGTTCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCN2反義鏈模板序列AAGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC對(duì)照的正義鏈模板序列AACCTATCCATCCCACTGTCCATCACTGCCTTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC對(duì)照的反義鏈模板序列AAAGGCAGTGATGGACAGTGGGATGGATAGGTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC具體步驟為將上述合成的DNA用無(wú)DNA酶、無(wú)RNA酶的水分別稀釋為100pmol/L，按下面步驟分別合成3個(gè)siRNA分子。用PCR方法將它們分別合成為雙鏈DNA，在潔凈的無(wú)DNA酶、無(wú)RNA酶的PCR管中加入稀釋的T7RNA聚合酶結(jié)合序列DNA5.0PL，分別加入上述3個(gè)用來(lái)轉(zhuǎn)錄成siRNA分子的的正義鏈和反義鏈DNA5.0uL，lOXpfuDNApolymerasebuffer5.0yL，10mmol/LdNTP1.0"L，水33.8uL，置于PCR儀95。C變性2min，加入pfuDNApolymerase0.2uL(1U)，再于95。C變性30s,56。C退火30s，72。C延伸10s,5個(gè)循環(huán)后，72i:后延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后，加入經(jīng)DEPC處理并高壓滅菌的3mol/L醋酸鈉(pH5.2)5.0uL，然后加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后于-20。C放置10min，12000r/min離心10min，棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，沉淀于室溫干燥10min，加入無(wú)DNA酶、無(wú)RNA酶的水50yL充分溶解沉淀，聚丙稀酰胺凝膠電泳檢查模板DNA制備結(jié)果。轉(zhuǎn)錄方法按T7RiboMAXExpressRNAiSystem說(shuō)明書(shū)進(jìn)行體在潔凈的無(wú)DNA酶、無(wú)RNA酶的PCR管中依次加入上述制備的模板DNA4.0uL，RiboMAXExpressT72XBuffer10.OuL，Nuclease-FreeWater4.OuL,EnzymeMix,T7Express2.OiiL，然后置于37。C反應(yīng)1h;加入無(wú)RNA酶的DNA酶LOuL(lU)，37°C30min;混合相應(yīng)的siRNA正義和反義鏈轉(zhuǎn)錄物，7(TC保溫10min，緩慢降溫至室溫；加入l/10體積的3mol/L醋酸鈉(pH5.2)，加入等體積的異丙醇，混勻后冰浴5min，13000r/min離心10min，小心吸去上清液，500wL70%乙醇洗滌沉淀，沉淀于室溫干燥10-15min，加入100uL水充分溶解沉淀，電泳檢查，測(cè)定含量后分裝為0.3pg/uL，-80。C保存?zhèn)溆?。得到體外合成的siRNA豬瘟治療生物制劑，其堿基序列見(jiàn)表11。表11體外合成的siRNA豬瘟治療生物制劑及對(duì)照siRNA分子<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例3質(zhì)粒表達(dá)shRNA分子的設(shè)計(jì)方法根據(jù)pSilencer3.1H1Hygro(Ambion)shRNA載體設(shè)計(jì)要求，設(shè)計(jì)用于表達(dá)shRNA的DNA序列，設(shè)計(jì)策略見(jiàn)表12。為了提高序列正確退火成為雙鏈DNA分子的效率，設(shè)計(jì)為用DNA聚合酶合成的PCR策略，將表達(dá)目的shRNA序列的DNA序列拆分為兩段部分互補(bǔ)配對(duì)的序列，然后用VNTI3.0輔助分析，使拆分的兩段序列之間的互補(bǔ)配對(duì)堿基為21-23bp，而各拆分序列自身配對(duì)堿基少于10bp，以提高PCR合成雙鏈模板DNA的效率。設(shè)計(jì)合成的各個(gè)shRNA模板DNA序列如表12:表12生成shRNA分子的模板DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>具體步驟如下:按下面步驟分別合成3個(gè)生成shRNA分子的質(zhì)粒，將合成的DNA稀釋為100umol/L，用PCR方法將它們分別合成為雙鏈DNA，方法為取稀釋的DNA5.0uL，加入10XpfuDNApolymerasebuffer5.0uL，10,ol/LdNTP1.0yL，水33.8yL，置于PCR儀95。C變性2min，加入pfuDNApolymerase0,2uL(1U)，再于95°C30s，56。C30s，72。C10s，5個(gè)循環(huán)后，72°C后延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后，加入3mol/L醋酸鈉(pH5.2)5.0，然后加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后于-20。C放置10min，12000r/min離心10min，棄去上清液，用1000uL70%乙醇洗滌沉淀，棄去上清液，沉淀于室溫干燥10min，加入50"L水充分溶解沉淀，-S(TC保存?zhèn)溆?。用^a/z//1和//i'/^III雙酶切表達(dá)shRNA的DNA插入片段，酶切消化結(jié)束后于70'C保溫15min滅活內(nèi)切酶，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后分別將它們克隆到pSilencer3.1H1Hygro載體的fe/n/ZI和ffi/7dl1位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)轉(zhuǎn)化菌落用31H1FP(GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG)和31H1RP(GCGGATAACAATTTCACACAGG)為引物進(jìn)行PCR快速鑒定，對(duì)PCR陽(yáng)性克隆小量提取質(zhì)粒，通過(guò)測(cè)序確定重組質(zhì)粒中的插入片段的正確性。得到的質(zhì)粒表達(dá)的shRNA分子能抑制豬瘟病毒增殖，表達(dá)shRNA分子的pSilencer3.1H1Hygro載體在5rfl和歷y7offl酶切位點(diǎn)間插入序列見(jiàn)表13。表13表達(dá)shRNA分子的pSilencer3.1H1Hygro載體在5a/zz^1和歷/oin酶切位點(diǎn)間插入序列<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求1、一種豬瘟病毒基因組上序列，利用RNA干擾技術(shù)設(shè)計(jì)合成RNA干擾分子后，這些RNA干擾分子能特異、高效抑制豬瘟病毒增殖從而對(duì)豬瘟病毒感染有明顯治療作用AAGGATAGGTAGGGTGACAGGTAGTGACGGA；AAGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACC。2、權(quán)利要求1所述的序列在制備抗豬瘟病毒生物制劑中的應(yīng)用。3、權(quán)利要求1所述的豬瘟病毒基因組上序列制成的生物制劑方法，包括以下步驟按照T7、T3或SP6RNA聚合酶使用方法，合成權(quán)利要求1所述序列的RNA千擾分子的正義鏈和反義鏈模板DNA和T7、T3或SP6RNA聚合酶結(jié)合序列，利用相應(yīng)的聚合酶體外轉(zhuǎn)錄設(shè)計(jì)合成RNA干擾分子，得到體外轉(zhuǎn)錄生成的RNA干擾分子豬瘟治療生物制劑。4、權(quán)利要求1所述的豬瘟病毒基因組上序列制成的生物制劑方法，包括以下步驟按照含HI或U6啟動(dòng)子體外轉(zhuǎn)錄載體使用方法，合成針對(duì)根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬瘟病毒基因組上序列的能生成shRNA分子的質(zhì)粒，得到豬瘟治療生物制劑。全文摘要本發(fā)明提供一種特異干擾豬瘟病毒基因組序列，同時(shí)還公開(kāi)了高效治療豬瘟病毒感染的方法，涉及治療豬瘟病毒感染的藥物，通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)豬瘟病毒不同基因的特異RNA干擾分子的DNA模板序列，利用T7、T3或SP6RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和含H1或U6啟動(dòng)子體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，得到了高效、特異抑制豬瘟病毒的干擾RNA分子，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明還提供了利用該方法生產(chǎn)的生物制劑，對(duì)CSFV的抑制效率高達(dá)到95.1-99.0％，在敏感動(dòng)物體內(nèi)能明顯阻止CSFV的感染，使動(dòng)物免于發(fā)病和死亡。文檔編號(hào)C12N15/63GK101407809SQ20081005142公開(kāi)日2009年4月15日申請(qǐng)日期2008年11月14日優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日發(fā)明者史子學(xué),徐興然,涂長(zhǎng)春申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所