專利名稱：基于分子印跡的fish－in－net固定化酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于無(wú)機(jī)化學(xué)、物理化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種利用"網(wǎng)中 魚(yú)(fish-in-net)"的方法制備的基于分子印跡的固定化酶，極大的保持了酶的活 性。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，固定化酶在生物工程、醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境、藥學(xué)、化學(xué)分析等方面 的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。酶的固定化就是通過(guò)化學(xué)或物理的處理方法，使原來(lái)水溶性 的酶與固態(tài)的水不溶性支持物相結(jié)合，使酶束縛或限制于一定的區(qū)域內(nèi)，仍能進(jìn) 行特有的催化反應(yīng)、并可回收重復(fù)利用的一類技術(shù)。固定化方法有物理吸附、交 聯(lián)、共價(jià)結(jié)合及包埋等方法。固定化酶的載體分為無(wú)機(jī)載體和有機(jī)載體。由于酶 易與有機(jī)聚合物發(fā)生化學(xué)作用，因此目前應(yīng)用較為廣泛。但用有機(jī)載體作為固定
骨架的酶的負(fù)載量小，化學(xué)穩(wěn)定性差，高分子親水性差。無(wú)機(jī)載體在物理性質(zhì)方 面比有機(jī)載體更加有優(yōu)勢(shì)，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，固定化骨架的機(jī)械強(qiáng)度高，抗微生物侵蝕， 熱穩(wěn)定性好，對(duì)有機(jī)溶劑有很好的耐受力，使用壽命長(zhǎng)，可以再生利用。
采用無(wú)機(jī)硅或/和金屬氧化物材料作為固定化的骨架，更有其優(yōu)越性。首先， 易于將酶與底物、產(chǎn)物分開(kāi)，方便后續(xù)的分離純化，而且可以連續(xù)生產(chǎn)，酶的回
收率高，可反復(fù)使用；其次，酶的穩(wěn)定性和最適溫度改變，最適PH值改變；第
三，有些固定化酶，增加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量，適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。 固定化酶同樣存在著缺點(diǎn)，1)酶處于固定化材料的外表面時(shí)，酶容易受到
環(huán)境因素的影響，進(jìn)而半衰期較短；2)酶處于固定化材料內(nèi)部時(shí)，由于固定化 材料內(nèi)部的空間較小且往往存在固定化材料與酶表面基團(tuán)的相互作用，酶難于保 持其催化活性構(gòu)象，進(jìn)而催化活力大大下降；上述兩種情況下，固定化的酶一旦 失去了活性，就只能依靠加入新的固定化酶來(lái)彌補(bǔ)催化能力的損失。這些問(wèn)題， 我們己經(jīng)通過(guò)專利200510017112.9給予解決。但是，在實(shí)際操作中仍存在下述 問(wèn)題沒(méi)有得到較好的解決(1)有機(jī)溶劑的變性作用；(2)有機(jī)、無(wú)機(jī)粒子對(duì) 酶活性中心和構(gòu)象進(jìn)攻，影響酶的活性和功能。本專利中的新方法，是使用目的 固定化材料底物或底物類似物、產(chǎn)物或產(chǎn)物類似物、中間過(guò)渡代謝產(chǎn)物來(lái)穩(wěn)定酶。 起兩方面作用(1)保護(hù)酶催化活性中心，不易受外界有機(jī)、無(wú)機(jī)粒子進(jìn)攻；(2) 占領(lǐng)可溶劑化表面(水化層)，減少溶劑對(duì)酶構(gòu)象的影響。而且存在于酶表面的 糖類物是飽和的小分子物質(zhì)，是作為酶的底物或底物類似物、產(chǎn)物或產(chǎn)物類似物、中間過(guò)渡態(tài)代謝產(chǎn)物，可以完全的進(jìn)出無(wú)機(jī)外殼上孔道，對(duì)催化反應(yīng)不會(huì)造成污 染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決由于有機(jī)溶劑對(duì)酶的影響和有機(jī)、無(wú)機(jī)粒子對(duì)酶活性中 心和構(gòu)象進(jìn)攻，所造成的酶不能保持其催化活性構(gòu)象和酶的催化活力下降問(wèn)題，
從而提供一種基于分子印跡的fish-in-net固定化酶。
作為印跡分子的糖類物質(zhì)，不僅能保持酶的活性中心，不易受外界有機(jī)、無(wú) 機(jī)粒子進(jìn)攻，占領(lǐng)可溶劑化表面(水化層)，減少溶劑對(duì)酶構(gòu)象的影響，且作為 酶的底物或底物類似物、產(chǎn)物或產(chǎn)物類似物、中間過(guò)渡代謝產(chǎn)物，可以完全的進(jìn) 出無(wú)機(jī)外殼上孔道，對(duì)催化反應(yīng)不會(huì)造成污染。
本發(fā)明方法的生物材料固載技術(shù)是，以硅或/和金屬氧化物的可溶性鹽為原 料，以表面活性劑為模板劑，后形成溶膠，具體各物質(zhì)的摩爾配料比見(jiàn)專利 200510017112.9。我們將上述所形成的溶膠稱作前驅(qū)體。糖相關(guān)的酶、酶系及 酶制劑和酶的印跡分子混合均勻，摩爾配料比為1: 1，前驅(qū)體與上述酶的摩爾 配料比為1: 0.03，前驅(qū)體與上述混合物組裝成無(wú)機(jī)一生物反應(yīng)器。
上述的與糖相關(guān)的酶包括糖水解酶、糖異構(gòu)酶、糖合成酶、糖基化酶等。其 中糖水解酶包括蔗糖酶、半乳糖苷酶、乳糖酶、麥芽糖水解酶、纖維二糖水解酶、 半乳糖水解酶；糖異構(gòu)酶包括葡萄糖異構(gòu)酶、木糖異構(gòu)酶、甘露糖異構(gòu)酶；糖合 成酶包括麥芽糖合成酶、葡聚糖合成酶、蔗糖合成酶、淀粉合成酶等。
上述的酶的印跡分子包括酶的底物或底物類似物、產(chǎn)物或產(chǎn)物類似物、中間 過(guò)渡代謝產(chǎn)物。其中所述酶的糖類小分子物質(zhì)包括寡糖，如果糖、葡萄糖、半乳 糖、乳糖、核糖、麥芽糖、蔗糖、纖維二糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖等。
本發(fā)明方法在制備分子篩的同時(shí)利用表面活性劑的自組裝縮聚以及和生物 材料的之間的協(xié)同作用，使得生物材料外表面為無(wú)機(jī)外殼，從而形成了催化活性 中心為酶、酶系及酶制劑的無(wú)機(jī)一生物反應(yīng)器。同時(shí)，由于酶在與前驅(qū)體混合之 前，酶先與穩(wěn)定酶構(gòu)象的糖類物質(zhì)混合，使酶的活性構(gòu)象得以保持，不易受外界 有機(jī)、無(wú)機(jī)粒子的進(jìn)攻，替代了酶外表面的水化位點(diǎn)，減少溶劑對(duì)酶構(gòu)象的影響， 并且存在其表面的是飽和的小分子物質(zhì)，是作為酶的底物或底物類似物、產(chǎn)物或 產(chǎn)物類似物、中間過(guò)渡代謝產(chǎn)物，可以完全的進(jìn)出無(wú)機(jī)外殼上孔道，對(duì)催化反應(yīng) 不會(huì)造成污染，使酶的活性較其它方法的固定化酶活大為的提高。
在最佳的條件下，本方法制備的固定化酶的穩(wěn)定性高，可以反復(fù)使用10次 以上，并且較其它方法的固定化酶活大為的提高，幾乎保持了初始固載酶的活性。本發(fā)明方法提供的工藝制備固定化酶過(guò)程，是將無(wú)機(jī)材料，表面活性劑，酶 (酶系或酶制劑)，小分子糖類似物構(gòu)建在一起的溶膠體系，通過(guò)能夠穩(wěn)定所述 酶的糖類小分子物質(zhì)誘導(dǎo)出酶的活性構(gòu)象，并且使其以大比例將酶包圍，形成水 化層，替代其水化位點(diǎn)，對(duì)其形成保護(hù)，后進(jìn)行固定化，能夠使固定化的酶保持 活性構(gòu)象，在無(wú)機(jī)外殼內(nèi)發(fā)揮催化作用時(shí)不受空間位阻和外界刺激環(huán)境的影響， 提高了酶活性構(gòu)象的穩(wěn)定性，同時(shí)也使固定化酶的機(jī)械強(qiáng)度增加，酶的催化效率 提高，拓寬了酶的應(yīng)用范圍。
催化活性中心是與糖相關(guān)酶、酶系及酶制劑，穩(wěn)定糖相關(guān)酶、酶系及酶制劑 的關(guān)鍵在于在制備固定化體系的過(guò)程中加入了穩(wěn)定酶的小分子的糖類物質(zhì)。
基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，是由如下方法制備參照我們申請(qǐng)的 專利200510017112.9所述的技術(shù)和方法合成無(wú)機(jī)骨架，它的殼為無(wú)機(jī)材料，催 化活性中心(催化材料)是與糖相關(guān)的酶、酶系及酶制劑，且在酶和酶系固定化 中加入酶的印跡分子，用以保護(hù)酶的活性中心的化學(xué)結(jié)構(gòu)和幾何構(gòu)象。
進(jìn)一步地，上述催化材料的物種來(lái)源可以是植物，動(dòng)物，微生物，人工合成 和/或半合成物。上述酶可以是天然酶，突變酶，改造酶，或是人工模擬酶類。 其中的酶包括糖水解酶、糖異構(gòu)酶、糖合成酶、糖基化酶等。 糖水解酶包括蔗糖酶、半乳糖苷酶、乳糖酶、麥芽糖水解酶、纖維二糖水解 酶、半乳糖水解酶；
糖異構(gòu)酶包括葡萄糖異構(gòu)酶、木糖異構(gòu)酶、甘露糖異構(gòu)酶； 糖合成酶包括麥芽糖合成酶、葡聚糖合成酶、蔗糖合成酶、淀粉合成酶等。 酶的印跡分子包括酶的底物或底物類似物、產(chǎn)物或產(chǎn)物類似物、中間過(guò)渡代 謝產(chǎn)物。
進(jìn)一步的，酶的印跡分子，可以是一種糖類物質(zhì)，也可以是幾種糖類物質(zhì)混 合物。
再進(jìn)一步地，酶的印跡分子包括寡糖，如果糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、核 糖、麥芽糖、蔗糖、纖維二糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖等。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:
無(wú)機(jī)骨架的合成
以TEOS (正硅酸乙酯)做硅源，以P123做表面活性劑(模板劑)。合成 介孔硅結(jié)構(gòu)的配料Si02/表面活性劑/CH3CH20H/H20/乳糖酶質(zhì)量比值為1:
1.46: 15: 1.5: 0.3。首先，將p123溶于乙醇中，然后向其中加入硅源。待此溶于攪拌完全后， 向其中滴加HCL (鹽酸)使其充分水解，使pH在6-8。然后將此混合體系在室 溫下強(qiáng)力攪拌4-10小時(shí)。裝入真空裝置中攪拌的同時(shí)抽真空12-72小時(shí)，直到 溶液成透明粘稠的溶膠為止，制備成前驅(qū)體。
催化活性中心樣品的制備
乳糖與乳糖酶的質(zhì)量比為10: 1,將所用的乳糖酶做初步的純化，然后使乳 糖酶與乳糖混合，在4'C在攪拌2小時(shí)，真空旋干成為糊狀。將其與前驅(qū)體混合, 在4"C下溫和攪拌繼續(xù)真空條件下反應(yīng)4-100小時(shí)。最后樣品用醇/水多次洗滌 而得包埋乳糖酶的無(wú)機(jī)一生物反應(yīng)器。經(jīng)檢測(cè)乳糖酶的活性與游離酶相比略有下 降，但酶的穩(wěn)定性提高，且較其它方法的固定化酶活的提高，在使用10次后， 酶活力為初始固定酶活力的90%。
權(quán)利要求
1、基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，其由如下方法制備合成無(wú)機(jī)骨架，它的殼為無(wú)機(jī)材料，催化活性中心是與糖相關(guān)的酶、酶系及酶制劑，且在酶和酶系固定化中加入酶的印跡分子，用以保護(hù)酶的活性中心的化學(xué)結(jié)構(gòu)和幾何構(gòu)象。
2、 如權(quán)利要求1所述的基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，其特征在于 上述催化活性中心的物種來(lái)源是植物、動(dòng)物、微生物、人工合成和/或半合 成物。
3、 如權(quán)利要求1所述的基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，其特征在于 酶是天然酶、突變酶、改造酶或是人工模擬酶類。
4、 如權(quán)利要求3所述的基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，其特征在于 酶包括糖水解酶、糖異構(gòu)酶、糖合成酶或糖基化酶。
5、 如權(quán)利要求書(shū)4所述的基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，其特征在于 糖水解酶包括蔗糖酶、半乳糖苷酶、乳糖酶、麥芽糖水解酶、纖維二糖水 解酶、半乳糖水解酶；糖異構(gòu)酶包括葡萄糖異構(gòu)酶、木糖異構(gòu)酶、甘露糖 異構(gòu)酶；糖合成酶包括麥芽糖合成酶、葡聚糖合成酶、蔗糖合成酶、淀粉 合成酶。
6、 如權(quán)利要求書(shū)1所述的基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，其特征在于 酶的印跡分子包括酶的底物或底物類似物、產(chǎn)物或產(chǎn)物類似物、中間過(guò)渡 代謝產(chǎn)物。
7、 如權(quán)利要求書(shū)6所述的基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，其特征在于 酶的印跡分子是一種糖類物質(zhì)，或是幾種糖類物質(zhì)混合物。
8、 如權(quán)利要求書(shū)7所述的基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，其特征在于 酶的印跡分子為糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、核糖、麥芽糖、蔗糖、纖維 二糖、木糖、阿拉伯糖或甘露糖。
全文摘要
本方法是基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，屬于無(wú)機(jī)化學(xué)、物理化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域。以硅或/和金屬氧化物的可溶性鹽為原料，以表面活性劑為模板劑后形成溶膠，使在印跡分子保護(hù)下的酶與溶膠組裝成無(wú)機(jī)-生物反應(yīng)器。殼為無(wú)機(jī)材料，催化活性中心是與糖相關(guān)的酶、酶系及酶制劑，印跡分子是酶的底物和/或產(chǎn)物中的糖類小分子。由于傳統(tǒng)固定化酶酶活保持差，本方法在酶、酶系及酶制劑固定化中加入了酶的印跡分子，該印跡分子在固定化進(jìn)程中從兩個(gè)方面穩(wěn)定目地催化體系1)類似于印跡分子的作用，保護(hù)酶的活性中心的構(gòu)象及催化活性；2)替代了酶外表面的水化位點(diǎn)，降低了固定化中出現(xiàn)的有機(jī)介質(zhì)對(duì)酶的變性作用，極大保持了酶活性。
文檔編號(hào)C12N11/14GK101434947SQ200810051590
公開(kāi)日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日
發(fā)明者明 呂, 吳卓夫, 揚(yáng) 李, 李正強(qiáng), 牛學(xué)頓 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)