專利名稱：用于隱孢子蟲種屬與藍(lán)氏賈第蟲檢測(cè)的多重懸浮芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)檢測(cè)芯片，具體涉及一種用于隱孢子蟲種屬與藍(lán)氏賈 第蟲檢測(cè)的多重懸浮芯片，還涉及該芯片的制備方法，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隱孢子蟲(O，topraWww WW.)包括微小隱孢子蟲(C.pamw7)、安氏隱孢子 蟲(C.flwferww')、貝氏隱孢子蟲(C.6ot7，')、火雞隱孢子蟲(C.we/eflgr/^fo)、人源隱孢 子蟲(C./ww/m;y)及豬隱孢子蟲CPo/r/"e 07/7to印on'cftwn)，是一種危害廣泛的人獸共患 寄生蟲原蟲病，可造成哺乳動(dòng)物尤其是反芻動(dòng)物和人的嚴(yán)重腹瀉。
藍(lán)氏賈第蟲(G/aWa/amM" Stiles,1915)是一種世界范圍分布的人獸共患原蟲，它 可引起人或動(dòng)物的藍(lán)氏賈第蟲病，主要癥狀是腹瀉。
隱孢子蟲與藍(lán)氏賈第蟲同屬水源性呈爆發(fā)性廣泛流行的原蟲，病理反應(yīng)均為嚴(yán)重 腹瀉。因此，開(kāi)發(fā)一種特異靈敏的隱孢子蟲屬、微小隱孢子蟲種及藍(lán)氏賈第蟲的多重 檢測(cè)方法己經(jīng)是迫在眉睫。
隱孢子蟲病與賈第蟲病的現(xiàn)行診斷方法主要有病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷及分子生物 學(xué)診斷三大類。病原學(xué)診斷多通過(guò)糞便顯微鏡檢及改良的抗酸染色法檢查，此法費(fèi)時(shí) 費(fèi)力且檢出率低下。免疫學(xué)診斷有間接血凝試驗(yàn)(IHA)、免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、酶聯(lián) 免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、單克隆抗體(McAb)等方法，然這些免疫學(xué)方法特異性和敏 感性都也較低。PCR技術(shù)是一種特異敏感直觀的檢測(cè)方法，其特異性檢測(cè)可以通過(guò)分析 屬特異及種特異的診斷序列，設(shè)計(jì)屬和種特異引物，其敏感性可通過(guò)優(yōu)化擴(kuò)增條件來(lái) 提高，最后通過(guò)電泳分析直接觀察擴(kuò)增結(jié)果。但是，PCR存在著較高的假陽(yáng)性機(jī)率，其 敏感性也有所欠缺，
目前尚未有用于檢測(cè)隱孢子蟲及藍(lán)氏賈第蟲的懸浮芯片的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)一種用于隱孢子蟲種屬與藍(lán)氏賈第蟲檢測(cè)的多重懸浮芯片，可以同時(shí) 檢測(cè)隱孢子蟲與藍(lán)氏賈第蟲。本發(fā)明還公開(kāi)了上述芯片的制備方法，適用工業(yè)化生產(chǎn)。 本發(fā)明的懸浮芯片.-
包括診斷引物和與微球耦聯(lián)的特異性寡聚核苷酸探針，其中寡聚核苷酸探針序列 為隱孢子蟲種或?qū)偬禺惢蛸Z第蟲種特異性的基因中的一段序列。
隱孢子蟲種特異診斷序列 一段指狀U1核內(nèi)小分子核糖核蛋白基因，NCBI中比對(duì) 僅為人源和微小隱孢子蟲所共有，同源性均為100%，符合種特異檢測(cè)研究標(biāo)準(zhǔn)。
隱孢子蟲屬特異診斷序列18SrRNA基因(此基因?yàn)殡[孢子蟲的各個(gè)種所共有且是 種間基因變異最小的一段基因)序列中保守的部分，在NCBI中比對(duì)為多個(gè)隱孢子蟲種 共有，且同源性大于98%，符合屬特異檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。
賈第蟲種特異診斷序列beta-giardin，該序列經(jīng)國(guó)外重多學(xué)者驗(yàn)證具有良好的 種特異性，是常用的賈第蟲基因分型和鑒別診斷基因。根據(jù)以上屬特異和種特異診斷 序列設(shè)計(jì)特異性診斷引物及探針如下
隱孢子蟲種特異引物H及探針ProH:
HF: 5'- Biotin-TAAGAAGCCACCAAGAAGGCG-3' HR: 5' -TCAATAGGCTTAAATGGGTTCGGGA-3
ProH探針序列5， - NH2-(CH2)12-CTTTCGGACCTCTTCCTCATC-3' 隱孢子蟲屬特異引物C及探針ProC:
CF: 5， -ATTGGAGGTTGTTCCTTACTCCT-3，
CR: 5' - Biotin-AGCCGCCCATAGAATCAAGAA-3'
ProC探針序列5' - NH2-(CH2)I2-ACTCACCAGGTCCAGACATAG-3' 藍(lán)賈第蟲種特異引物G及探針Pl"0G:
GF: 5， -TACGCTCACCCAGACGATG -3'
GR: 5， - Biotin-TCGGCGGACTTCTTGACCT-3，
ProG探針序列5， - NH廠(CH2)12-CAGCAACATGAACCAGCG-3' 以上三段寡聚核苷酸探針序列均在5'進(jìn)行NH2-(CH2)u修飾。H上游引物、C與G的 下游引物均用Biotin標(biāo)記，上述引物可擴(kuò)增包含上述探針序列的三段特異的診斷序列。 本發(fā)明懸浮芯片的制備方法，包括以下步驟
1、 制備寡聚核苷酸探針；
2、 用純水稀釋氨基修飾的探針；3、 將儲(chǔ)備的微球振蕩，然后轉(zhuǎn)移到棕色EP管中；
4、 離心收集微球，加入MES液進(jìn)行振蕩；
5、 向懸浮微球中加入上述探針，并振蕩；
6、 在微球溶液中加入新配制的lOmg/ml EDC,振蕩；然后進(jìn)行溫育；
7、 再次向微球溶液中加入新配置的10mg/ml EDC，振蕩，然后進(jìn)行溫育；
8、 向微球溶液中加0. 02% Tween-20，離心收集微球；
9、 用0. 1% SDS重懸微球，離心收集微球；用TE懸浮微球；
10、 用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算微球的個(gè)數(shù)，2—8。C，避光保存。
原理每一種色標(biāo)微球可通過(guò)羧基，與特定的分析物質(zhì)(寡核苷酸探針、抗原、 抗體等)共價(jià)結(jié)合。將標(biāo)記生物探針的微球與待測(cè)物進(jìn)行特異性的結(jié)合，再和帶有第 三種熒光素的報(bào)告分子反應(yīng)，在一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可同時(shí)對(duì)一個(gè)樣本中的100種不同目的 分子進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)后，采用96孔板進(jìn)行進(jìn)樣。檢測(cè)儀自動(dòng)將反應(yīng)液吸起加入蠕動(dòng)泵， 泵入一個(gè)微細(xì)管中，在鞘液的作用下，單排分布的微球單個(gè)通過(guò)檢測(cè)通道。檢測(cè)通道 中設(shè)有兩個(gè)激光探頭， 一個(gè)探頭可發(fā)射635nm波長(zhǎng)的激光，可激發(fā)標(biāo)記微球的兩種熒 光素，從而識(shí)別不同的色標(biāo)微球，進(jìn)行定性檢測(cè)；另一激光探頭可激發(fā)報(bào)告分子的熒 光素，通過(guò)測(cè)定微球所帶報(bào)告分子熒光信號(hào)的強(qiáng)度，可進(jìn)行定量檢測(cè)。因此，懸浮芯 片可進(jìn)行定性定量檢測(cè)目標(biāo)分子。當(dāng)樣本中含有目的分子，目的分子與特定的微球所 帶的探針吸附在一起時(shí)，兩道激光所激發(fā)的熒光均可被檢測(cè)到；若樣本中不含目的分 子，則僅能檢測(cè)到微球所帶的熒光。通過(guò)數(shù)字信號(hào)處理器與計(jì)算機(jī)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)軟件，分 析兩道激光所激發(fā)熒光的波長(zhǎng)和信號(hào)強(qiáng)度，從而判斷待檢樣本中幾種至數(shù)十種檢測(cè)目 標(biāo)物，并通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，對(duì)檢測(cè)物進(jìn)行定量分析。自動(dòng)加樣器依次將不同樣 本加入蠕動(dòng)泵中，樣本之間用一小段氣柱分隔開(kāi)，這樣在連續(xù)分析過(guò)程中不但可以區(qū) 分不同樣本，可還以防止樣本間的污染。
本發(fā)明懸浮芯片檢測(cè)隱孢子蟲是通過(guò)以下方法進(jìn)行的
根據(jù)隱孢子蟲及藍(lán)氏賈第蟲種屬特異性基因設(shè)計(jì)并合成用于PCR擴(kuò)增的特異性引 物，并對(duì)其中一條引物進(jìn)行Biotin修飾；按常規(guī)方法制備待檢樣本基因組DNA作為模 板，使用上述特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)使PCR產(chǎn)物帶上Biotin修飾；將PCR產(chǎn) 物與制備的懸浮芯片雜交，也就是與耦聯(lián)在微球上的探針進(jìn)行雜交，對(duì)雜交懸浮芯片 進(jìn)行鏈霉親和素化藻紅蛋白標(biāo)記，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)。為了克服PCR假陽(yáng)性，本發(fā)明采用了獨(dú)特的UNG—Taq酶體系。具體方法是PCR反 應(yīng)體系中，將dTTP量減半，由dUTP替代，并加入0. 05U的UNG (尿嘧啶DNA糖苷酶)。 PCR產(chǎn)物中被摻入一定量的dUTP， UNG通過(guò)打斷核酸鏈上dUTP上的糖苷鍵，使含dUTP 的核酸不能作為模板被識(shí)別。在運(yùn)行PCR程序之前先37'C溫育5min，使UNG充分消化 PCR產(chǎn)物，94'C模板變性時(shí)，UNG失活，進(jìn)行正常PCR反應(yīng)。
本發(fā)明與其它蛋白質(zhì)和核酸檢測(cè)方法相比較，具有的積極效果在于結(jié)合了多重 PCR技術(shù)與液相雜交技術(shù)，能有效的消除假陽(yáng)性，在保證精準(zhǔn)特異性的同時(shí)，其敏感性 比普通的PCR技術(shù)提高10-1000倍?？梢酝瑫r(shí)對(duì)隱孢子蟲屬、微小隱孢子蟲及藍(lán)氏賈 第蟲等水源性的兩種原蟲進(jìn)行鑒定和檢測(cè)，具有高特異性、高靈敏度、快速、低成本 易于推廣等特點(diǎn)。
本懸浮芯片
1、 應(yīng)用范圍廣微球表面的羧基可與核酸探針和蛋白分子耦聯(lián)，能對(duì)目的核酸和 蛋白分子進(jìn)行定性定量研究；
2、 敏感性高以微球作為反應(yīng)載體，增加了反應(yīng)物接觸面積；每個(gè)微球表面帶有
約108個(gè)羧基位點(diǎn)，以共價(jià)鍵方式耦聯(lián)寡核苷酸探針、抗體或抗原，探針密度高，產(chǎn) 生的信號(hào)強(qiáng)；使用熒光檢測(cè)，放大了反應(yīng)信號(hào)，敏感性大大提高。
3、 重復(fù)性好所進(jìn)行的生物反應(yīng)是在液相環(huán)境中進(jìn)行的，利于保持核酸、蛋白等 生物分子天然構(gòu)象，克服了傳統(tǒng)芯片空間效應(yīng)的影響，也更利于探針和被檢物質(zhì)的反 應(yīng)，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性；
4、 信噪比低在微細(xì)管中對(duì)單個(gè)微球進(jìn)行檢測(cè)，不存在本底影響檢測(cè)的問(wèn)題，無(wú) 需洗脫去除本底；
5、 高通量可以同時(shí)對(duì)同一樣本中的多重不同目的分子進(jìn)行定性定量分析，即提 高了檢測(cè)信息通量，又節(jié)約了樣本用量；
6、 快速高效大大提高了反應(yīng)速度和檢測(cè)速度。由于所進(jìn)行的生物反應(yīng)是在液相
環(huán)境中進(jìn)行的，雜交僅需15分鐘即可完成，提高了反應(yīng)速度；在35—60分鐘內(nèi)，可 對(duì)96個(gè)不同樣本分別同時(shí)進(jìn)行多達(dá)100種指標(biāo)的檢測(cè)；利用96孔板和自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)， 可連續(xù)進(jìn)行n X 96個(gè)樣品的檢測(cè)。
7、 成本低制備過(guò)程無(wú)需特殊設(shè)備，只進(jìn)行羧基與氨基間的脫水成肽反應(yīng)即可， 簡(jiǎn)單易行；由于是液體儲(chǔ)存方式， 一次制備可多次使用，平均每個(gè)指標(biāo)檢測(cè)成本僅需2. 5 — 5. 0元；
8、易于標(biāo)準(zhǔn)化基于上述特點(diǎn)，使得該技術(shù)能夠做到標(biāo)準(zhǔn)化，易于試劑盒的研制
和推廣。目前，懸浮芯片是美國(guó)FDA唯一批準(zhǔn)用于臨床診斷(自身免疫病檢測(cè)和人類
白細(xì)胞抗原分型)的生物芯片。


圖1為三重PCR引物(H、 C和G)濃度配比摸索Lanel-6:三引物各濃度配比梯度為0. 5/0. 5/0. 5 u M、 0. 6/0. 5/0. 4 u M、 0. 7/0. 4/0. 4 u M、 0. 6/0. 4/0. 5 P M、 0. 8/0. 3/0. 4 u M、 0. 8/0. 4/0. 3 P M。由上圖可見(jiàn)，兩引物濃度配比為0. 7/0. 6/0. 7 4 M時(shí)就能發(fā)揮最佳擴(kuò)增效果。
圖2為單個(gè)特異引物對(duì)單個(gè)模板擴(kuò)增Lanel-11: DL2000 Marker、牛微小隱孢子蟲、羊微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、貝氏隱孢子 蟲、豬隱孢子蟲、人源賈第蟲、犬源賈第蟲、雞艾美爾球蟲、弓形蟲、毛滴蟲、陰性對(duì)照。 G引物
Lanel-11: DL2000 Marker、人源賈第蟲、犬源賈第蟲、牛微小隱孢子蟲、羊微小隱孢子蟲、 安氏隱孢子蟲、貝氏隱孢子蟲、豬隱孢子蟲、雞艾美爾球蟲、弓形蟲、毛滴蟲、陰性對(duì)照。 圖3為三重引物對(duì)單個(gè)模板進(jìn)行擴(kuò)增Lanel，2-14: DL2000 Marker、牛微小隱孢子蟲、羊微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、貝氏隱孢 子蟲、豬隱孢子蟲、人源賈第蟲、犬源賈第蟲、雞艾美爾球蟲、鼠艾美爾球蟲、弓形蟲、毛滴蟲、 陰性對(duì)照。
圖4為三重懸浮芯片體系特異性檢測(cè)結(jié)果制Lanel-13: TE buffer對(duì)照、陰性對(duì)照、牛微小隱孢子蟲、羊微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、 貝氏隱孢子蟲、豬隱孢子蟲、人源賈第蟲、犬源賈第蟲、雞艾美爾球蟲、鼠艾美爾球蟲、弓形蟲、 毛滴蟲。
圖5為單個(gè)引物敏感性試驗(yàn)圖； 圖6為三重PCR敏感性試驗(yàn)?zāi)０鍧舛忍荻仍O(shè)為100ng、 10 ng、 1 ng、 0.1 ng、 0.01 ng、 0.001 ng、 0.0001 ng。由上圖 可見(jiàn)H、 C、 G引物最低檢測(cè)閾值分別為H(10pg)、 C(lpg)和G(lpg),完全符合敏感性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。 圖7為三重懸浮芯片體系敏感性試驗(yàn)制模板濃度梯度設(shè)為100ng、 10ng、 lng、 100pg、 10pg、 lpg、 100fg、 10fg、 lfg。由上圖可見(jiàn) 懸浮探針ProH、 ProC、 ProG引物最低檢測(cè)閾值分別為H(lfg)、 C (lf g)和G (lf g),比普通的三重PCR敏感性提升了 1000倍，完全符合敏感性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式
為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明在隱孢子蟲和藍(lán)氏賈第蟲檢測(cè)中的應(yīng)用，特舉以下較佳實(shí)施 例進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明的應(yīng)用并不限于實(shí)施例。 實(shí)施例1
引物的設(shè)計(jì)和合成
一、 材料分子生物學(xué)軟件Primer Premier 5.0、 DNAMAN、 oligo 6. 0及NCBI網(wǎng) 絡(luò)資源。
二、 方法結(jié)果-
1、 序列獲得通過(guò)對(duì)隱孢子蟲及藍(lán)氏賈第蟲進(jìn)行全基因組分析，選取其相應(yīng)的種 屬特異性檢測(cè)基因作為靶序列，并從GenBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得此基因序列，登錄號(hào) 分別為XM—626719、 X64340、 X85958。
2、 設(shè)計(jì)引物在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找隱孢子蟲所有有效種的序列，將序列用DNAMAN 軟件進(jìn)行分析比對(duì)，找出基因保守區(qū)部分，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)屬特異 引物，并用oligo 6.0進(jìn)行分析驗(yàn)證。隱孢子蟲種特異及賈第蟲種特異引物直接從特 異的診斷序列中設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)方法同屬特異引物設(shè)計(jì)相同，相關(guān)參數(shù)為Tm值55.(TC — 65.0。C, GC值40.0X—60. 0%， PCR產(chǎn)物大小為100bp—500bp，引物大小22士3bp;
3、 引物選擇將軟件輸出的引物進(jìn)行適當(dāng)?shù)氖謩?dòng)調(diào)節(jié)，增加或減少幾個(gè)堿基，保 證上下游引物Tm差異在有效的范圍之內(nèi)或接近。然后在GenBank進(jìn)行在線Blast比對(duì)， 選取特異性高的引物，并根據(jù)引物與探針之間Dimer形成機(jī)率的高低將其中的一條進(jìn) 行5'末端Biotin標(biāo)記，擴(kuò)增片段大小分別為為424bp、 223bp和267bp。
4、 引物合成上海生工合成引物服、CF、 GF，大連TakaRa合成Biotin標(biāo)記的引 物HF、 CR、 GR。
實(shí)施例2
探針的設(shè)計(jì)和合成
一、材料分子生物學(xué)軟件Primer Premier 5.0、 oligo 6.0及NCBI網(wǎng)絡(luò)資源。二、方法結(jié)果
1) 序列獲得在上述擴(kuò)增片段非引物區(qū)設(shè)計(jì)探針；
2) 設(shè)計(jì)探針采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)探針，探針長(zhǎng)度根據(jù)Luminex 公司推介的長(zhǎng)度18bp-22bp選定Hybridization Probes命令，根據(jù)引物與探 針之間Dimer形成情況在Anti-sense或sense鏈上設(shè)計(jì)探針，參數(shù)同實(shí)施例
3) 探針選擇將軟件輸出的探針進(jìn)行適當(dāng)?shù)氖謩?dòng)調(diào)節(jié)，增加或減少幾個(gè)堿基，然 后在GenBank進(jìn)行在線Blast比對(duì)，選取特異性高的探針，在5'末端進(jìn)行 NH2-(CH丄2修飾，選定的探針序列為ProH、 ProC、 ProG;
4) 探針合成大連TakaRa合成上述探針。
實(shí)施例3
懸浮芯片的制備方法
--、材料合成好的探針、帶光譜地址的微球、棕色避光EP管、2-(N-嗎啉代)乙 磺酸、l-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亞胺、高速離心機(jī)。
二、方法結(jié)果
1、 用純水稀釋氨基修飾的探針到lmM(lnanomole/^l);
2、 將儲(chǔ)備的微球振蕩20 sec;
3、 取20(^1微球轉(zhuǎn)移到棕色EP管中；
4、 收集微球，8000g，離心l-2min;
5、 棄上清，加入50^1 0.1 MMES(2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid' 2墨(N-嗎啉 代)乙磺酸)液pH4.5，振蕩20sec;
6、 向懸浮微球中加入2^illmM的探針，振蕩20sec;
7、 準(zhǔn)備新鮮的10mg/ml EDC ( l-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride, l-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亞胺)，用dH20;
8、 向微球溶液中加入2.5^1新配置的10mg/mlEDC，振蕩；
9、 在室溫黑暗條件下溫育30min;
10、 再次準(zhǔn)備新鮮的10mg/mlEDC，用dH20;
11、 向微球溶液中加入2.5pl新配置的10mg/mlEDC，振蕩；
12、 在室溫黑暗條件下溫育30min;13、 向微球溶液中加1.0mL0.02%Tween-20;
14、 8000Xg離心l一2min，收集微球；
15、 棄上清，用1.0mL0.1%SDS重懸微球；
16、 8000Xg離心l一2min，收集微球；
17、 用100jilTE， pH=8.0，懸浮微球，
18、 用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算微球的個(gè)數(shù)
19、 將微球2 — 8'C，避光保存?zhèn)溆谩?實(shí)施例4
三重浮芯片快速檢測(cè)隱孢子蟲及藍(lán)氏賈第蟲方法
一、 材料
裂解液、蛋白酶K、酚-氯仿-異戊醇、NaAc(pH5.2)、 75°/。乙醇、TaKaRa ExTaq酶、 TaKaRadNTPs、合成好的引物與探針、BiometraPCR儀、已經(jīng)耦聯(lián)好的帶光譜地址的 微球、TMAC雜交液、96孔濾板、鏈霉親和素化藻紅蛋白、Luminex液相芯片檢測(cè)系統(tǒng)。
二、 方法結(jié)果
1、 用自配裂解液(NaCl 100mM、 Tris-HCl(pH 7.5) 20mM、 EDTA25mM、 SDS 2%
(w/v)和蛋白酶K0.1 ii g/u l)裂解后用酚-氯仿-異戊醇抽提冷乙醇沉淀法提取總核酸。
2、 PCR擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)條件如下
表格2三重PCR反應(yīng)體系
組份加入體積
10 x PCR Buffer (含MgC12)2 pi
dGTP、 dCTP、 dATP (2.5mmo1)各1.6 W
dTTP、 dUTP (2.5 ,ol)各O.一
HF、 CF、 GF Q同ol/L)0.6/0.7/0.6 |J
HR、 CR、 GR (1同ol/L)0.6/0.7/0.6 )ul
Taq DNA Polymerase (5U/(_il)0，
Uracil-DNA Glycosylase (1,)0.05 ^
所提樣本基因組DNA1 piddH204.35 pi
Total20 pi
PCR反應(yīng)程序?yàn)?br> ' 94。C5min
94。C 30sec
59°C 40sec
72 。C 30sec Goto 2 30times
、72°C延伸lOmin。
3、三對(duì)引物各自及三重PCR體系條件的摸索1)三對(duì)引物各自濃度的優(yōu)化設(shè)置引物在體系的終濃度梯度為0.5iiM、 luM、
1.5yM、 2yM、 2.5wM、 3uM。，用此區(qū)間的引物嘗試都得到相應(yīng)的擴(kuò)增，其中當(dāng)引物 量為lOpmol (引物的貯存濃度為20pmol/" 1,取0.5ul)終濃度為0. 5 pmol/"l時(shí) 效果最佳。
2) 三對(duì)引物各自退火溫度的優(yōu)化設(shè)置引物的退火溫度分別為47flC、 49flC、 52nC、 54°C、 56°C、 59')C、 61eC、 63nC，在梯度PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果在59"C時(shí)三對(duì)引物都 有最優(yōu)化的擴(kuò)增。
3) 三對(duì)引物各自dNTPs濃度的優(yōu)化設(shè)置每種dNTPs (each)濃度梯度為50uM、 100 uM、 250 uM、 350 nM、 400yM。，在這個(gè)濃度段里都得到不錯(cuò)的擴(kuò)增，其中在濃度 為250uM (each)時(shí)三對(duì)引物均有最佳擴(kuò)增。
4) 三對(duì)引物各自Mg2+濃度的優(yōu)化設(shè)置Mg2+終濃度梯度為lnM、 1.5 nM、 2 nM、 3 nM、 4 nM、 5 nM，其中濃度在1. 5 mM時(shí)三對(duì)引物均有最佳擴(kuò)增。
5) 三對(duì)引物最佳酶濃度的摸索設(shè)置酶濃度梯度為0.5U、 1U、 2U、 3U、 4U，兩 引物在此濃度段時(shí)均有不錯(cuò)的擴(kuò)增，但在2U時(shí)三對(duì)引物均得到最優(yōu)化的擴(kuò)增。
6) 三重PCR體系條件的摸索三重PCR體系的Mg'+終濃度為3mM, dNTPs(each)的 終濃度為500nM,酶濃度為2U，退火溫度為59"C,引物H、 C、 G的濃度梯度設(shè)為 0. 5/0. 5/0. 5uM、 0. 6/0. 5/0. 4nM、 0. 7/0. 4/0. 4 ti M、 0. 6/0. 4/0. 5 y M、 0.8/0.3/0.4 UM、 0. 8/0. 4/0. 3 t: M。三對(duì)引物濃度配比為0.7/0.6/0.7uM時(shí)就能發(fā)揮最佳擴(kuò)增效 果(見(jiàn)附圖1)。
雜交雜交液組成33.3^1 1.5XTMAC (tetramethylammonium chloride,氯化四甲 銨)，5)il上述PCR產(chǎn)物，加入實(shí)施例三制備的5000個(gè)與探針耦聯(lián)的微球，1XTE將體積補(bǔ)充到50)^1。將雜交液在95°0變性4min， 52'C雜交15min以上。
檢測(cè)將上述雜交后的溶液全部轉(zhuǎn)移到96孔濾板中，真空過(guò)濾收集微球，用2pg/ml S-R-PE(Streptavidin-R-phycoerythrin,鏈霉親和素化藻紅蛋白)重懸微球，置52 。C 1 Omin ， Luminex檢領(lǐng)[l 。
實(shí)施例5
懸浮芯片的特異性鑒定和靈敏度檢測(cè)
一、 材料
牛微小隱孢子蟲、羊微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、貝氏隱孢子蟲、豬隱孢子蟲、 人源賈第蟲、犬源賈第蟲、柔嫩艾美爾球蟲、尼氏艾美爾球蟲、剛地弓形蟲、陰道毛 滴蟲總基因組。
二、 方法結(jié)果
1、三重懸浮芯片特異性試驗(yàn)
1) 用本發(fā)明的特異性引物分別對(duì)所有基因組單個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，取牛微小隱孢子蟲、 羊微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、貝氏隱孢子蟲、豬隱孢子蟲、人源賈第蟲、犬源賈
第蟲、柔嫩艾美爾球蟲、剛地弓形蟲、陰道毛滴蟲等10個(gè)樣本的DNA為模板，用建立 的擴(kuò)增體系分別對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果如下(見(jiàn)附圖2):
a) 隱孢子蟲種特異引物H只能對(duì)能感染人的兩種進(jìn)行擴(kuò)增；
b) 隱孢子蟲屬特異引物C對(duì)所有的隱孢子蟲種基因組都能有效擴(kuò)增；
c) 藍(lán)氏賈第蟲種特異引物G能對(duì)能感染人的兩種進(jìn)行擴(kuò)增。
2) 用本發(fā)明的三對(duì)特異引物H、 C和G—起對(duì)所有基因組單個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，取牛微 小隱孢子蟲、羊微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、貝氏隱孢子蟲、豬隱孢子蟲、人源賈 第蟲、犬源賈第蟲、柔嫩艾美爾球蟲、尼氏艾美爾球蟲、剛地弓形蟲、陰道毛滴蟲等 ll個(gè)樣本的DNA為模板，用建立的擴(kuò)增體系分別對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。 檢測(cè)結(jié)果如下(見(jiàn)附圖3):
a) 能感染人的牛與羊微小隱孢子蟲在屬特異和種特異處都得到有效擴(kuò)增；
b) 安氏、貝氏和豬隱孢子蟲只在屬特異處得到有效擴(kuò)增；
c) 人源和犬源賈第蟲在賈第蟲種特異處得到有效擴(kuò)增；
d) 其它的對(duì)照均沒(méi)有擴(kuò)增。
3) 用本發(fā)明的特異探針ProH、 ProC和ProG與以上三重PCR單個(gè)檢測(cè)核酸的產(chǎn)物進(jìn)行雜交通過(guò)Lumiriex檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下(見(jiàn)附圖4):
Luminex公司推介的陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為樣品值熒光值大于2倍的陰性對(duì)照值。在我 們的三重懸浮芯片檢測(cè)中，ProH、 ProC和ProG分部在其特異檢測(cè)樣品中讀取的熒光值 均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2倍陰性和空白對(duì)照值值，同時(shí)通過(guò)控制引物探針的量，不斷摸索體系反 應(yīng)條件使得陰性和空白對(duì)照值均控制在50以下，這就更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)刈C實(shí)了檢測(cè)的特異性。
2、三重懸浮芯片靈敏度試驗(yàn)
1) 用本發(fā)明的特異性引物分別對(duì)所有基因組單個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，模板定量后倍比稀釋，
核酸含量依次為100ng、 10ng、 lng、 100pg、 10pg、 lpg。檢測(cè)結(jié)果如下(見(jiàn)附圖5):
a) 隱孢子蟲種特異性引物H檢測(cè)閾值為10ng;
b) 隱孢子蟲屬特異性引物C檢測(cè)閾值為lng;
c) 藍(lán)氏賈第蟲種特異引物G檢測(cè)閾值為lng;
2) 用本發(fā)明的三對(duì)特異性引物同時(shí)對(duì)兩種模板進(jìn)行檢測(cè)，模板定量后倍比稀釋， 核酸含量依次為100ng、 10ng、 lng、 100pg、 10pg、 lpg。檢測(cè)結(jié)果如下(見(jiàn)附圖6):
如單個(gè)檢測(cè)一樣，三重體系中隱孢子蟲種特異性引物H檢測(cè)閾值為10ng，隱孢子 蟲屬特異性引物C檢測(cè)閾值為lng，藍(lán)氏賈第蟲種特異引物G檢測(cè)閾值為lng。
3) 用本發(fā)明的三重懸浮芯片同時(shí)對(duì)兩種模板進(jìn)行檢測(cè)，模板定量后倍比稀釋，核 酸含量依次為100ng、 10ng、 lng、 100pg、 10pg、 lpg、 100fg、 10fg、 lfg。檢測(cè)結(jié)
果如下(見(jiàn)附圖7):
Luminex公司推介的陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為檢測(cè)樣品的熒光值大于2倍的陰性對(duì)照值。 在三重懸浮芯片的敏感性的試驗(yàn)中，ProH、 ProC和ProG在含lfg核酸的模板中的熒光 值均大于2倍的陰性對(duì)照值，且陰性對(duì)照值均控制在50以下。比單純的三重PCR檢測(cè) 體系敏感性提高了 1000倍。
綜上所述，三重懸浮芯片體系實(shí)現(xiàn)了良好的特異性檢測(cè)，同時(shí)又將敏感性提升了 1000倍。因此，將三重懸浮芯片體系用于隱孢子蟲和藍(lán)氏賈第蟲的檢測(cè)有不可比擬的 優(yōu)點(diǎn)。
權(quán)利要求
1、一種用于隱孢子蟲種屬與藍(lán)氏賈第蟲檢測(cè)的多重懸浮芯片，包括診斷微球和與此微球耦聯(lián)的特異性寡聚核苷酸探針，其中，寡聚核苷酸探針序列為隱孢子蟲種或?qū)偬禺惢蛸Z第蟲種特異性的基因中的序列；隱孢子蟲種特異診斷序列指狀U1核內(nèi)小分子核糖核蛋白基因，NCBI中比對(duì)僅為人源和微小隱孢子蟲所共有，同源性均為100％，符合種特異檢測(cè)研究標(biāo)準(zhǔn)；隱孢子蟲屬特異診斷序列18SrRNA基因序列中保守的部分，在NCBI中比對(duì)為多個(gè)隱孢子蟲種共有，且同源性大于98％，符合屬特異檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)；賈第蟲種特異診斷序列beta-giardin。
2、 權(quán)利要求l所述的懸浮芯片，其特征在于以上屬特異和種特異診斷序列設(shè)計(jì)特異性診斷引物及探針如下隱孢子蟲種特異引物H及探針ProH-HF: 5，- Biotin-TAAGAAGCCACCAAGAAGGCG-3'服5' -TCAATAGGCTTAAATGGGTTCGGGA-3ProH探針序列5， - NH,廣(CH丄::-CTTTCGGACCTCTTCCTCATC-3，隱孢子蟲屬特異引物C及探針ProC:CF: 5， -ATTGGAGGTTGTTCCTTACTCCT-3，CR: 5， - Biotin-AGCCGCCCATAGAATCAAGAA-3'ProC探針序列5， - NH廠(CH》KfACTCACCAGGTCCAGACATAG-3，藍(lán)賈第蟲種特異引物G及探針ProG:GF: 5， -TACGCTCACCCAGACGATG -3，GR: 5' - Biotin-TCGGCGGACTTCTTGACCT-3'ProG探針序列5， - NH2-(CH2)12-CAGCAACATGAACCAGCG-3，以上三段寡聚核苷酸探針序列均在5'進(jìn)行NH2-(CH丄2修飾；H上游引物、C與G的下游引物均用Biotin標(biāo)記，上述引物可擴(kuò)增包含上述探針序列的三段特異的診斷序列。
3、權(quán)利要求l所述懸浮芯片的制備方法，包括以下步驟1) 制備寡聚核苷酸探針；2) 用純水稀釋氨基修飾的探針；3) 將儲(chǔ)備的微球振蕩，然后轉(zhuǎn)移到棕色EP管中；4) 離心收集微球，加入MES液進(jìn)行振蕩；5) 向懸浮微球中加入上述探針，并振蕩；6) 在微球溶液中加入新配制的10mg/ml EDC，振蕩；然后進(jìn)行溫育；7) 再次向微球溶液中加入新配置的10mg/ml EDC，振蕩，然后進(jìn)行溫育.8) 向微球溶液中加0.02% Tween-20，離心收集微球；9) 用O. 1% SDS重懸微球，離心收集微球；用TE懸浮微球；10) 用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算微球的個(gè)數(shù)，2—8t:，避光保存。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于隱孢子蟲種屬與藍(lán)氏賈第蟲檢測(cè)的多重懸浮芯片，包括診斷引物和與微球耦聯(lián)的特異性寡聚核苷酸探針，其中，寡聚核苷酸探針序列為隱孢子蟲種或?qū)偬禺惢蛸Z第蟲種特異性的基因中的序列。結(jié)合了多重PCR技術(shù)與液相雜交技術(shù)，能有效的消除假陽(yáng)性，在保證精準(zhǔn)特異性的同時(shí)，其敏感性比普通的PCR技術(shù)提高10-1000倍?？梢酝瑫r(shí)對(duì)隱孢子蟲屬、微小隱孢子蟲及藍(lán)氏賈第蟲等水源性的兩種原蟲進(jìn)行鑒定和檢測(cè)，具有高特異性、高靈敏度、快速、低成本易于推廣等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101440396SQ200810051728
公開(kāi)日2009年5月27日 申請(qǐng)日期2008年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日
發(fā)明者宮鵬濤, 楠 張, 張西臣, 巍 李, 李建華, 李淑紅 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)