專利名稱：一種原位聯(lián)合檢測miRNA的表達與細胞凋亡的方法
一種原位聯(lián)合檢測miRNA的表達與細胞凋亡的方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及miRNA原位檢測方法的改進。特別是一種原位聯(lián)合檢測miRNA的 表達與細胞凋亡的熒光原位雜交檢測方法。背景技術(shù)：
近年來研究發(fā)現(xiàn)， 一類新的微RNA(microRNA或miRNA)是指長度約21 25 nt的某些特殊的小型非編碼RNA,這些miRNA能夠識別特定的目標 mRNA，并通過完全或者不完全互補的方式與其3'非翻譯區(qū)結(jié)合，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平 通過促進靶mRNA的降解和/或抑制翻譯過程而發(fā)揮負調(diào)控基因表達的作用。據(jù)推 測人類近30%的基因表達受到miRNA的精確調(diào)節(jié)。目前已經(jīng)確定的miRNA有300 多種，根據(jù)miRNA數(shù)據(jù)庫Sanger的推測，其總量可能超過1000個，占據(jù)人基因組 的3%。由于miRNA在生物體內(nèi)廣泛存在并且對其下游靶基因調(diào)控非常準確，因此， miRNA的研究已經(jīng)成為了腫瘤、發(fā)育、干細胞等領(lǐng)域中新的熱點。MiRNA平均長度只有22bp，通過常規(guī)方法檢測比較困難。近年來開發(fā)的 miRNA real-time PCR和Northern blot解決了關(guān)于miRNA的擴增檢測；但是miRNA 的亞細胞定位，以及miRNA和靶mRNA作用的機制等研究層次上，上述實驗方法 所能夠提供的信息就顯得十分有限。同時部分miRNA的表達與細胞凋亡的關(guān)系十 分密切，因此原位聯(lián)合檢測小RNA的表達與細胞凋亡的劑盒及其檢測方法需要建■、,:
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種原位聯(lián)合檢測miRNA與細 胞凋亡的檢測方法，該方法無放射、無污染、使用方便。本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的方案公開了一種原位聯(lián)合檢測小RNA的表 達與細胞凋亡方法，其特征在于所述方法包括將根據(jù)miRNA成熟體堿基序列設(shè) 計的RNA探針進行鎖定核酸修飾(LNA， locked nuclear acid modification)，制 成LNA修飾的miRNA特異性探針；在特異性探針3'末端標記地高辛，得到LNA修 飾的miRNA特異性探針液；通過免疫反應(yīng)放大miRNA表達信號；最后通過熒光標記的親和素(Avidin)來實現(xiàn)原位檢測miRNA的表達。所述miRNA原位表達檢測后，通過TUNEL法檢測原位細胞凋亡。從而可以同 步檢測miRNA的表達與細胞凋亡。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明將miRNA的原位表達情況轉(zhuǎn)化為可見熒光信 號；同時能夠原位聯(lián)合檢測miRNA的表達與細胞凋亡情況；達到直觀、良好的原 位檢測效果，填補了miRNA原位熒光檢測領(lǐng)域的應(yīng)用空白。
圖1為活細胞miRNA原位雜交結(jié)果； 圖2為石蠟切片miRNA原位雜交結(jié)果； 圖3為MiR-21原位雜交和TUNEL法檢測細胞凋亡。 以下結(jié)合本發(fā)明的實施例參照附圖進行詳細敘述。
具體實施方式以下所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式
，但本發(fā)明的保護范圍并不局限 于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到 的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng) 該以權(quán)利要求的保護范圍為準。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一、 LNA-miRNA探針的制備1. 化學合成所需要檢測的miRNA反義RNA探針；2. 將上述合成的探針與絕對過量的地高辛在液相環(huán)境雜交過夜，通過層析，透析 手段除去過量的地高辛和沒有參與反應(yīng)的RNA探針。將所得溶液標記為雜交 探針液。二、 原位雜交反應(yīng)系統(tǒng)的制備1. 胃蛋白酶制成10x貯存液備用，得溶液A;2. 40。/。去離子甲酰胺，10。/。硫酸葡聚糖,lxDenhardt液，4xSSC, 1 g/L tRNA， 1 g/L 熱變性鮭魚精子DNA，混合均勻溶液得溶液B;3. 山羊血清白蛋白配制成濃度為20%溶液，得到溶液C;4. 將生物素活化之后，與鼠抗地高辛結(jié)合標記，得溶液D;5. 將親和素活化之后，與Indodicarbocyanine (Cy3)結(jié)合標記，得溶液E。 三、原位雜交所需其他試劑/緩沖液的制備1. 原位雜交用磷酸鹽緩沖液(PBS):A液Na2HP04 28.4g, Na2HP04H20 31.61g, Na2HP04.2H20 35.6g， Na2HP04.7H20 53.63g, Na2HP04.12H20 71.64g,加雙蒸水到1000ml;B液NaH2P04 24.0g, NaH2P04-H20 27.6g， NaH2P04'2H20 31.21g，加雙蒸水 到1000ml;按照81: 19比例分別取相應(yīng)容積A、 B液混合，并加入相當于混合液容積的雙 蒸水，混合均勻。按照1%。濃度加入焦碳酸二乙酯(DEPC)，充分混均勻，靜置 過夜備用；2. DEPC處理雙蒸水雙蒸水按照P/。。濃度加入焦碳酸二乙酯(DEPC)，充分混均勻，靜置過夜備用；3. 固定液4%多聚甲醛(PFA)/原位雜交用PBS溶液將4g多聚甲醛粉末溶于0.1MPBS溶液中制得；4. 1%PFA/0.1 MPBS溶液 將lg多聚甲醛粉末溶于0.1MPBS溶液中制得；5. 3%檸檬酸溶液 將0.3g擰檬酸溶于10mlDEPC處理水，充分混合均勻備用；6. 0.1。/。Tritoon-100/原位雜交用PBS溶液將lmlTritoon-100加入100ml原位雜交用PBS溶液，混合均勻備用；7. SSC緩沖溶液2xSSC:取NaCl 17.53g;擰檬酸鈉8.82g;加水至1000ml，用10mol/L NaOH調(diào)PH至7.0;0.5xSSC:取2xSSC溶液50ml，加DEPC處理雙蒸水至200ml;0.2xSSC :取2xSSC溶液20ml，加DEPC處理雙蒸水至200ml。 四、凋亡原位檢測TUNEL凋亡檢測試劑盒(Roche公司，瑞士)； 洗滌液0.01 MPBS ( pH7.4);封閉液3% 11202/甲醇；固定液4X多聚甲醛溶于PBS (pH7.4)，新鮮配制； 透膜液0.1% Triton X-IOO，溶于0.1%檸檬酸鈉，新鮮配制； TUNEL標記液1管與2管按照1: 9混合后冰浴待用。具體檢測實例h 檢測試劑和建立過程一、 雜交探針的制備1. 試劑化學合成反義RNA寡聚核苷酸(上海吉瑪產(chǎn)品)；地高辛(Sigma產(chǎn)品)；2. 儀器雜交爐(Bio-Rad產(chǎn)品);層析柱(Millipore產(chǎn)品)。3. 方法化學合成寡聚核苷酸探針與絕對過量的地高辛在液相環(huán)境雜交過夜，通過層 析，透析手段除去過量的地高辛和沒有參與反應(yīng)的RNA探針。將所得溶液標記為 雜交探針液。二、 miRNA原位雜交反應(yīng)體系制備1. 試劑胃蛋白酶、去離子甲酰胺、硫酸葡聚糖、Denhardt液，山羊血清白蛋白，生 物素，親和素，鼠抗地高辛抗體，Indodicarbocyanine (Sigma產(chǎn)品)；tRNA、熱 變性鮭魚精子DNA (SMDNA產(chǎn)品)。2. 儀器雜交爐(Bio-Rad產(chǎn)品)。 3.方法1) 40%去離子甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，lxDenhardt液，4xSSC， 1 g/L tRNA， 1 g/L熱變性鮭魚精子DNA，混合均勻雜交制得溶液B;2) 山羊血清白蛋白配制成濃度為20%溶液，得到溶液C;3) 將生物素活化之后，與鼠抗地高辛結(jié)合標記，得溶液D;4) 將親和素活化之后，與Indodicarbocyanine (Cy3)結(jié)合標記，得溶液E。 三活細胞miRNA原位檢測1. 常規(guī)細胞培養(yǎng)、爬片制備；2. 細胞的固定4n/。PFA/原位雜交用PBS溶液室溫固定30min，蒸餾水充分水洗；3.30%過氧化氫1份加50份甲醇混合，室溫處理30min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶， 蒸餾水充分水洗；4.3%檸檬酸稀釋的濃縮型胃蛋白酶(lml 3%檸檬酸加上2滴溶液A，混勻)， 37'C或者室溫孵育10min。原為雜交用PBS溶液洗3x5min， DEPC處理雙蒸水 洗一次；5.37。C預(yù)熱的0.P/c) Triton.X -100/原位雜交用？88溶液孵育301^11，原位雜交用 PBS充分洗滌；6. ly。PFA/原位雜交用PBS溶液室溫固定10min， DEPC處理雙蒸水洗滌3次；7. 每張細胞加上40^U溶液B，38'C孵育4小時，吸走多余液體，不洗；8. 每張切片加上4(HU雜交探針液，加在細胞上，38'C雜交過夜；9.37°C預(yù)熱的2xSSC溶液洗滌2xl0min， 37°C預(yù)熱的0.5xSSC溶液洗滌 lxl5min， 37'C預(yù)熱的0.2xSSC溶液洗滌lxl5min;10. 滴加溶液C， 37'C孵育30min，甩去多余液體，不洗；11. 滴加溶液D, 37'C孵宵60min，原位雜交用PBS洗滌4x5min;12. 滴加溶液E， 37'C避光孵育2小時，原位雜交用PBS充分洗滌；13. Hochest33258溶液復(fù)染細胞核，原位雜交用PBS充分洗滌；14. 抗淬滅劑封片，準備鏡檢；15. FV-1000激光共聚焦顯微鏡觀察。檢測結(jié)果圖片見附圖l所示。圖片說明Cy3陽性雜交熒光信號彌散地分布于 U251細胞胞核，直觀表示了小RNA在細胞爬片上的亞細胞定位情況。四、凋亡原位檢測TUNEL凋亡檢測試劑盒(Roche公司，瑞士)洗滌液0.01 MPBS ( pH7.4)。封閉液3% H202/甲醇。固定液4X多聚甲醛溶于PBS (pH7.4),新鮮配制。 透膜液0.1% TritonX-100,溶于0.1%檸檬酸鈉，新鮮配制。 TUNEL標記液1管與2管按照1: 9混合后冰浴待用。 凋亡原位檢測方法為，接上述步驟三、活細胞miRNA原位檢測歩驟12: 玻片在0.01MPBS (pH7.4)緩沖液中浸浴5分鐘x2次； 加標記液20-25pl，濕盒內(nèi)37'C孵育60分鐘后4'C過夜； PBS (pH7.4)輕搖洗5分鐘x3次，室溫；Hochest33258溶液復(fù)染細胞核，原位雜交用PBS充分洗滌；抗淬滅劑封片； FV-1000激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。具體檢測實例2一、石蠟切片miRNA原位檢測1. 多聚賴氨酸處理載玻片；2. 常規(guī)石蠟切片制備；6-8^1;3. 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；4. 30%過氧化氫1份加10份蒸餾水混合，室溫處理10min，滅活內(nèi)源性過氧化物 酶；5. 暴露探針特異性結(jié)合miRNA的片段3%檸檬酸稀釋的濃縮型胃蛋白酶(lml 3%檸檬酸加上2滴溶液A，混勻)，37T:或者室溫孵育3 30min。原為雜交 用PBS洗3x5min， DEPC處理雙蒸水洗一次；6. 37'C預(yù)熱的0.1。/。 Triton X-100/原位雜交用PBS溶液孵育30min，原位雜交用 PBS充分洗滌；7. 1。/。PFA/原位雜交用PBS溶液室溫固定10min, DEPC處理雙蒸水洗滌3次；8. 預(yù)雜交每張切片加上4(Hil溶液B，加在切片上，42"C孵育4小時，吸走多 余液體，不洗；9. 每張切片加上40pl雜交探針液，加在切片上，42。C雜交過夜；10. 37。C預(yù)熱的2xSSC溶液洗滌2x5min， 37。C預(yù)熱的0.5xSSC溶液洗滌lxl5min， 37X:預(yù)熱的0.2xSSC溶液洗滌lxl5min;11. 滴加溶液C， 37。C封閉30min，甩去多余液體，不洗；12. 滴加溶液D， 37'C封閉60min，原位雜交用PBS洗滌4x5min;13. 滴加溶液E， 37t避光孵育2小時，原位雜交用PBS充分洗滌；14. Hochest33258溶液復(fù)染細胞核，原位雜交用PBS充分洗滌；15. 抗淬滅劑封片，準備鏡檢；16. FV-1000激光共聚焦顯微鏡觀察。檢測結(jié)果圖片見附圖2。圖片說明Cy3陽性雜交熒光信號彌散地分布于腫瘤細 胞胞漿。二、凋亡原位檢測接上述歩驟一、石蠟切片miRNA原位檢測歩驟13后 玻片在0.01MPBS (pH7.4)緩沖液中浸浴5分鐘x2次； 加標記液25pl，濕盒內(nèi)37'C孵育60分鐘后4'C過夜， M PBS (pH7.4)輕搖洗5分鐘x3次，室溫；Hochest33258溶液復(fù)染細胞核，原位雜交用PBS充分洗滌；抗淬滅劑封片； FV-1000激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。檢測結(jié)果圖片見附圖3。圖片說明小RNA的表達與細胞凋亡有直接的關(guān)系，二 者的陽性信號在石蠟切片上具有明顯差異性的亞細胞定位表現(xiàn)。
權(quán)利要求
1、一種原位聯(lián)合檢測miRNA的表達的方法，其特征在于所述方法包括將根據(jù)miRNA成熟體堿基序列設(shè)計的RNA探針進行鎖定核酸(LNA)修飾，制成LNA修飾的miRNA特異性探針；在特異性探針3’末端標記地高辛，得到LNA修飾的miRNA特異性探針液；通過免疫反應(yīng)放大miRNA表達信號；最后通過熒光標記的親和素實現(xiàn)原位檢測miRNA的表達。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述miRNA原位表達檢測后，通 過TUNEL法檢測原位細胞凋亡。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于包括如下主要組分LNA修飾 miRNA特異性探針液，生物素化鼠抗地高辛與親和素-熒光標記系統(tǒng)LNA修飾的 miRNA特異性探針液由化學合成miRNA反義RNA寡核苷酸，純化后作為探針；所 述合成的探針再與過量的地高辛在液相環(huán)境雜交過夜，通過層析，透析手段除i^ 過量的地高辛和沒有參與反應(yīng)的RNA探針，所得溶液標記為雜交探針液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述方法的miRNA原位雜交反應(yīng) 體系為a) 胃蛋白酶制成10x貯存液，得溶液A;b) 40。/。去離子甲酰胺，10。/o硫酸葡聚糖，lxDenhardt液，4xSSC, 1 g/L tRNA， 1 g/L熱變性鮭魚精子DNA，混合均勻溶液得溶液B:c) 山羊血清白蛋白配制成濃度為20%溶液，得到溶液C;d) 將生物素活化之后，與鼠抗地高辛結(jié)合標記，得溶液D;e) 將親和素活化之后，與Indodicarbocyanine (Cy3)結(jié)合標記，得溶液E。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種原位聯(lián)合檢測小RNA(miRNA)的表達與細胞凋亡的熒光原位雜交檢測方法。該方法包括LNA修飾miRNA特異性探針的合成、對探針標記地高辛、純化、生物素化鼠抗地高辛與親和素-熒光標記系統(tǒng)的構(gòu)造等基本步驟。可同時原位聯(lián)合檢測小RNA的表達與細胞凋亡。本發(fā)明的檢測方法將miRNA的表達情況轉(zhuǎn)化為可見熒光信號，達到良好的原位檢測效果，填補了miRNA原位熒光檢測領(lǐng)域的應(yīng)用空白。
文檔編號C12Q1/68GK101240345SQ200810052368
公開日2008年8月13日 申請日期2008年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月4日 公開號200810052368.發(fā)明者旋 周, 康春生, 浦佩玉 申請人:天津醫(yī)科大學總醫(yī)院