專利名稱:雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達(dá)發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于微生物酶制劑領(lǐng)域,特別涉及一種雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表 達(dá)發(fā)酵工藝。
背景技術(shù):
漆酶是一種含銅的多酚氧化酶(p-diphenol oxidase, EC 1.10.3.2),是木質(zhì)素降解酶系的主 要成分之一。自然界中諸如雜色云芝Cbr/o^^ ^i^ico7or等白腐菌均能分泌漆酶。白腐 菌是目前最重要的漆酶產(chǎn)生菌,但白腐菌生長周期長、酶活低,不利于工業(yè)化生產(chǎn)。目前, 國內(nèi)主要圍繞如何提高白腐菌漆酶的產(chǎn)量而開展研究,采用菌種篩選和改造,培養(yǎng)方式及 培養(yǎng)條件優(yōu)化來達(dá)到利用微生物生產(chǎn)漆酶的目的。
近年來,有關(guān)漆酶的研究越來越受到國際上的重視,由于漆酶能降解木質(zhì)素,而且能 降解多種有毒化合物,所以漆酶在食品工業(yè)、造紙工業(yè)、保護(hù)環(huán)境及其他領(lǐng)域具有很大的 研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力。因此研究漆酶的異源表達(dá)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。隨著分子生物學(xué)技 術(shù)的發(fā)展, 一些漆酶基因已經(jīng)從木質(zhì)素降解菌中隆并進(jìn)行了性質(zhì)分析,為實(shí)現(xiàn)漆酶基因 的異源表達(dá)奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。19卯年Kojima首次將Con7ow Wa"/m的漆酶基因進(jìn) 行了克隆并在酉良酒酵母Sacc/wra附;;cey cewv她e中表達(dá)(Kojima Y, TsukudaY, KawaiY." a/. Cloning, sequence analysis, and expression of ligninolytic phenoloxidase genes of the white-rot basidiomycete Co〃'o/ws /2frsw加[J]. Journal of Biological Chemistry, 1990, 265: 15224-15230 (白腐菌CoWo/m /z/^Wm漆酶基因的克隆,序列分析和表達(dá),生物化學(xué)雜志))。 2003年Liu等利用P/c/z/apastor^表達(dá)了 Fo/we "g"oras的漆酶(Liu W, Chao Y, Liu S. a/. Molecular cloning and characterization of a laccase gene from the basidiomycete Fowe //gwoyws and expression in ZVcW"Applied Microbiology and Biotechnology. 2003, 63: 174-181 (白腐菌Fowe //gmmAS漆酶基因的特性和分子克隆及在巴斯德畢赤酵母戶/c/z/fl /7"ston's中 表達(dá),應(yīng)用微生物和生物技術(shù)))。
白腐菌漆酶為胞外蛋白,它是由一系列同工酶組成的,典型的分子量在60-80kDa。雜 色云芝是一種典型的木材白腐菌,對(duì)木質(zhì)素的降解能力較強(qiáng)。雜色云芝在液體培養(yǎng)基中產(chǎn) 生的漆酶同工酶主要是Lccl 。利用甲醇畢赤酵母(戶/c/z/a附"/^"0//0^對(duì)雜色云芝漆酶Lccl 進(jìn)行了異源表達(dá)構(gòu)建基因工程菌己有報(bào)道(郭梅,白東清,蒲軍,杜連祥,路福平.去自身 信號(hào)肽漆酶基因的克隆及轉(zhuǎn)化甲醇畢赤酵母,2005年全國工業(yè)微生物年會(huì)論文,200'5.4: 66-70。)(郭梅,蒲軍,杜連祥,路福平,白東清.雜色云芝漆酶基因(Lccl)的克隆及 在甲醇畢赤酵母中的表達(dá),菌物學(xué)報(bào),2005, 24 (2): 221-226)。
甲醇畢赤酵母(i^/z/awe^^o/ZcY^PMADlG,是一種新型外源基因表達(dá)系統(tǒng),異源蛋 白的表達(dá)僅需少量甲醇作為誘導(dǎo)劑。甲醇畢赤酵母PMAD16高密度發(fā)酵時(shí)培養(yǎng)基的組成以及發(fā)酵條件直接影響菌體的生長和外源基因的表達(dá)。PMAD16可以甲醇為唯一碳源生長, 因此利用甲醇畢赤酵母表達(dá)外源蛋白時(shí),往往需要生長培養(yǎng)基與誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基分丌,通 常采用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基誘導(dǎo)法,先用葡萄糖為碳源的BMDY培養(yǎng)基增殖酵母,再離心收集 菌體,然后重懸在含甲醇的BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)外源基因的表達(dá),這種表達(dá)方法本研究也 有報(bào)道,(郭梅,路福平,蒲軍,白東清,杜連祥.雜色云芝漆酶基因在甲醇畢赤酵母中表 達(dá)條件研究,食品研究與開發(fā),2006, 27 (4): 82-84),但這種方式操作繁瑣,浪費(fèi)培養(yǎng)基, 同時(shí)增加了染菌機(jī)會(huì),尤其在用發(fā)酵罐大量培養(yǎng)酵母生產(chǎn)外源蛋白時(shí)極為不利,不適宜工 業(yè)化生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足,提供一種雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異
源表達(dá)發(fā)酵工藝,本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下
雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達(dá)發(fā)酵工藝,包括如下歩驟
(1) 準(zhǔn)備菌株和培養(yǎng)基
菌株基因工程菌甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-Zcc7;
發(fā)酵培養(yǎng)基15 30g/L蛋白胨,5 30g/L葡萄糖,5 20g/L酵母粉,10 25g/L酵母氮 源,3 X 10-4~7X l(T4g/L生物素,0.1 0.6mmol/L的Cu2+,用pH為4.0~7.0的濃度為100mmol/L 的磷酸鹽緩沖液配制;
(2) 基因工程菌生長培養(yǎng)
將活化的菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-丄"/接種在經(jīng)滅菌的所述發(fā)酵培養(yǎng)基 中,在溫度25 3rC下,振蕩或攪拌培養(yǎng)15-36h;
(3) 基因工程菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)
間歇或流加含3X1(T4~7X10—4g/L生物素的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),使甲醇終體積濃度為 0.2~2.0%,溫度15 30。C,誘導(dǎo)時(shí)間96 216h,得到雜色云芝重組漆酶。
優(yōu)選的是所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為20 25g/L蛋白胨,10 20g/L葡萄糖,10 15g/L酵母 粉,15~23g/L酵母氮源,4xlO-4 6X10-4g/L生物素,0.2~0.4mmol/L的Cu2+,用pH為5~7 的濃度為10Ommol/L的磷酸鹽緩沖液配制。
所述的012+為硫酸銅或氯化銅中的離子。
所述歩驟(2)為將活化的菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-i:cc7接種在經(jīng)滅菌 的所述發(fā)酵培養(yǎng)基中,在溫度28 3(TC下,振蕩或攪拌培養(yǎng)20-30h;
所述步驟(3)為間歇或流加含5X10^6X10—、/L生物素的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),使 甲醇終體積濃度為0.5~1.3%,溫度18 25。C,誘導(dǎo)時(shí)間108~156h。
本發(fā)明的一種雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達(dá)發(fā)酵工藝,不需更換培養(yǎng)基, 進(jìn)行直接誘導(dǎo)培養(yǎng)。確定了發(fā)酵工藝參數(shù),建立了一種操作簡(jiǎn)便、工藝簡(jiǎn)單、污染率低、 成本低、發(fā)酵周期短、漆酶表達(dá)量高的發(fā)酵工藝。本發(fā)明為漆酶規(guī)?;a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一歩說明。實(shí)施例1
一種雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達(dá)發(fā)酵工藝,包括如下歩驟
(1) 準(zhǔn)備菌株和培養(yǎng)基
菌株基因工程菌甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-Zc";由天津農(nóng)學(xué)院的實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建 并保存(附有天津農(nóng)學(xué)院提供的證明);
發(fā)酵培養(yǎng)基20g/L蛋白胨,10g/L葡萄糖,10g/L酵母粉,13.4g/L酵母氮源(YNB), 4xl(T4g/L生物素,0.2mmol/L的Cu2+ (硫酸銅),用pH為6.5的100mmol/L的磷酸鹽緩沖 液配制;
(2) 基因工程菌生長培養(yǎng) 從固體斜面上取少量活化的菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-丄cc7接種在經(jīng)滅菌
的所述發(fā)酵培養(yǎng)基中,裝液量10%,培養(yǎng)溫度3(TC,振蕩培養(yǎng)20h; G)基因工程菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)
間歇加含5X1(TVL生物素的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),每隔24h加一次,使甲醇終體積濃 度為0.8%,誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度2(TC,誘導(dǎo)時(shí)間108h,過濾分離得到雜色云芝重組漆酶(粗制 劑)。再經(jīng)分離與純化得到純化雜色云芝重組漆酶。
本發(fā)明的一種雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達(dá)發(fā)酵工藝,使發(fā)酵液中漆酶酶 活可達(dá)4500U/L (丁香醛連氮法)。
雜色云芝重組漆酶粗制劑,可直接應(yīng)用于染料脫色、降解有毒污染物、紙槳漂白等, 也可再進(jìn)行分離純化得到純化漆酶,擴(kuò)大漆酶的應(yīng)用范圍。 漆酶活力測(cè)定
按照Galliano的測(cè)定方法進(jìn)行(Galliano H, Gas Q Seris J L. Lignin degradation by 及/g/f/o/7o/"M51 Zigwoswi1 involves synergistic action of two enzyme: MnP and Laccase. Enzyme and Microbial Technology, 1991, 13: 478~482 (及/gitfo/ onw Z/gmwMS猛過氧4七 物酶和漆酶降解木質(zhì)素的協(xié)作增效作用,酶和微生物技術(shù)))。3.5mL反應(yīng)混合液中, 含0.2mL0.5mmol/L的丁香醛連氮液,1.5mL 50mmol/L磷酸緩沖液(pH5.8)和1.8mL 適當(dāng)稀釋的酶液,25'C反應(yīng)5min后,于525nm處測(cè)定吸光度。 一個(gè)酶活單位定義為 在25"條件下每分鐘使1 ix mol的底物轉(zhuǎn)化所需的酶量。(丁香醛連氮的摩爾消光系數(shù) s 525=65000M"1. cm—')。
實(shí)施例2
一種雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達(dá)發(fā)酵工藝,包括如下步驟 (1)準(zhǔn)備菌株和培養(yǎng)基
菌株基因工程菌甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETocA-丄c";由天津農(nóng)學(xué)院的實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建 并保存;
發(fā)酵培養(yǎng)基15g/L蛋白胨,30g/L葡萄糖,5g/L酵母粉,15g/L酵母氮源(YNB), 3xlCT4 g/L生物素,0.2mmol/L的Cu2+ (氯化銅),用pH為4.0的100mmol/L的磷酸鹽緩沖液配 制;(2)基因工程菌生長培養(yǎng)
從固體斜面上取少量活化的菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-丄cc7接種在經(jīng)滅菌 的所述發(fā)酵培養(yǎng)基中,裝液量40%,培養(yǎng)溫度28'C、攪拌培養(yǎng)24h; G)基因工程菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)
流加含6Xl(^g/L生物素的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),使甲醇終體積濃度為0.2%,誘導(dǎo)培養(yǎng) 溫度15°C,誘導(dǎo)時(shí)間216h,過濾分離得到雜色云芝重組漆酶(粗制劑)。再經(jīng)分離與純化 得到純化雜色云芝重組漆酶。 實(shí)施例3
一種雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達(dá)發(fā)酵工藝,包括如下步驟
(1) 準(zhǔn)備菌株和培養(yǎng)基
菌株基因工程菌甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETctA-丄cc7;由天津農(nóng)學(xué)院的實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建 并保存;
發(fā)酵培養(yǎng)基25g/L蛋白胨,15g/L葡萄糖,10g/L酵母粉,10g/L酵母氮源(YNB), 6xl(T4g/L生物素,0.4mmol/L的Cu2+ (硫酸銅),用pH為7.0的100mmol/L的磷酸鹽緩沖 液配制;
(2) 基因工程菌生長培養(yǎng) 從固體斜面上取少量活化菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-丄cc7接種在經(jīng)滅菌的
所述發(fā)酵培養(yǎng)基中,裝液量30%,培養(yǎng)溫度31"C,攪拌培養(yǎng)15h;
(3) 基因工程菌詢誘導(dǎo)培養(yǎng) 間歇加含3Xl(^g/L生物素的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),每隔24h加一次,使甲醇終體積濃
度為1.3%,誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度30°C,誘導(dǎo)時(shí)間96h,過濾分離得到雜色云芝重組漆酶(粗制劑)。
再經(jīng)分離與純化得到純化雜色云芝重組漆酶。
實(shí)施例4
一種雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達(dá)發(fā)酵工藝,包括如下步驟
(1) 準(zhǔn)備菌株和培養(yǎng)基
菌株基因工程菌甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-丄c";由天津農(nóng)學(xué)院的實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建 并保存;
發(fā)酵培養(yǎng)基30g/L蛋白胨,5g/L葡萄糖,15g/L酵母粉,25g/L酵母氮源(YNB), 7xl0"4 g/L生物素,0.1mmol/L的Cu2+ (氯化銅),用pH為7.0的100mmol/L的磷酸鹽緩沖液配 制;
(2) 基因工程菌生長培養(yǎng) 從固體斜面上取少量活化菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-丄c"接種在經(jīng)滅菌的
所述發(fā)酵培養(yǎng)基中,裝液量20%,培養(yǎng)溫度25'C,攪拌培養(yǎng)36h;
(3) 基因工程菌的誘導(dǎo)培養(yǎng) 流加7X1(TVL生物素的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),使甲醇終體積濃度為2.0%,誘導(dǎo)培養(yǎng)溫
度18°C,誘導(dǎo)時(shí)間156h,過濾分離得到雜色云芝重組漆酶(粗制劑)。再經(jīng)分離與純化得到純化雜色云芝重組漆酶。 實(shí)施例5
一種雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達(dá)發(fā)酵工藝,包括如下步驟
(1) 準(zhǔn)備菌株和培養(yǎng)基
菌株基因工程菌甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-Zcc7;由本研究天津農(nóng)學(xué)院的實(shí)驗(yàn) 室并保存;
, 發(fā)酵培養(yǎng)基22g/L蛋白胨,20g/L葡萄糖,20g/L酵母粉,23g/L酵母氮源(YNB), 5xlO'4g/L生物素,0.6mmol/L的Cu2+ (氯化銅),用pH為5.0的10Ommol/L的磷酸鹽緩沖 液配制;
(2) 基因工程菌生長培養(yǎng) 從固體斜面上取少量活化菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETccA-Zc"接種在經(jīng)滅菌的
所述發(fā)酵培養(yǎng)基中,裝液量20%,培養(yǎng)溫度25'C,攪拌培養(yǎng)30h;
(3) 基因工程菌的誘導(dǎo)培養(yǎng) 流加7X10— /L生物素的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),使甲醇終體積濃度為0.5%,誘導(dǎo)培養(yǎng)溫
度25。C,誘導(dǎo)時(shí)間156h,過濾分離得到雜色云芝重組漆酶(粗制劑)。再經(jīng)分離與純化得 到純化雜色云芝重組漆酶。
權(quán)利要求
1. 雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達(dá)發(fā)酵工藝,其特征是包括如下步驟(1)準(zhǔn)備菌株和培養(yǎng)基菌株基因工程菌甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETαA-Lcc1;發(fā)酵培養(yǎng)基15~30g/L蛋白胨,5~30g/L葡萄糖,5~20g/L酵母粉,10~25g/L酵母氮源,3×10-4~7×10-4g/L生物素,0.1~0.6mmol/L的Cu2+,用pH為4.0~7.0的濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖液配制;(2)基因工程菌生長培養(yǎng)將活化的菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETαA-Lcc1接種在經(jīng)滅菌的所述發(fā)酵培養(yǎng)基中,在溫度25~31℃下,振蕩或攪拌培養(yǎng)15-36h;(3)基因工程菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)間歇或流加含3×10-4~7×10-4g/L生物素的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),使甲醇終體積濃度為0.2~2.0%,溫度15~30℃,誘導(dǎo)時(shí)間96~216h,得到雜色云芝重組漆酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達(dá)發(fā)酵工藝,其特征在于 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為20 25g/L蛋白胨,10 20g/L葡萄糖,10~15g/L酵母粉,15~23g/L酵 母氮源,4xlO-4 6X l(T4g/L生物素,0.2~0.4mmol/L的Cu2+,用pH為5~7的濃度為100mmol/L 的磷酸鹽緩沖液配制。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達(dá)發(fā)酵工藝,其特征 在于所述的Cu^為硫酸銅或氯化銅中的離子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達(dá)發(fā)酵工藝,其特征在于 所述步驟(2)為將活化的菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-丄cd接種在經(jīng)滅菌的所 述發(fā)酵培養(yǎng)基中,在溫度28 30'C下,振蕩或攪拌培養(yǎng)20-30h;
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達(dá)發(fā)酵工藝,其特征在于 所述歩驟(3)為間歇或流加含5X10、6X104g/L生物素的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),使甲醇 終體積濃度為0.5~1.3%,溫度18 25。C,誘導(dǎo)時(shí)間108 156h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雜色云芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達(dá)發(fā)酵工藝,步驟為(1)準(zhǔn)備基因工程菌甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETαA-Lcc1和發(fā)酵培養(yǎng)基;(2)將活化的菌株接種在經(jīng)滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中,在25~31℃,振蕩或攪拌培養(yǎng)15-36h;(3)間歇或流加含生物素的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),使甲醇終體積濃度為0.2~2.0%,溫度15~30℃,誘導(dǎo)時(shí)間96~216h,得到雜色云芝重組漆酶,本發(fā)明的工藝,不需更換培養(yǎng)基,進(jìn)行直接誘導(dǎo)培養(yǎng),確定了發(fā)酵工藝參數(shù),建立了一種操作簡(jiǎn)便、污染率低、成本低、發(fā)酵周期短、漆酶表達(dá)量高的發(fā)酵工藝。
文檔編號(hào)C12N9/04GK101544964SQ20081005252
公開日2009年9月30日 申請(qǐng)日期2008年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月26日
發(fā)明者李托平, 鵬 梁, 娜 王, 白東清, 軍 蒲, 路福平, 梅 郭 申請(qǐng)人:天津農(nóng)學(xué)院