專利名稱：：高溫耐酸性α-淀粉酶的突變株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其是一種高溫耐酸性a-淀粉酶的突變株及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：a-淀粉酶(a-1，4-glucan-glucanhydrolaseEC3.2.1.1)又稱為液化型淀粉酶，它能從淀粉分子的內(nèi)部任意切開ct-l，4鍵，產(chǎn)生分子量比較小的麥芽糖糊精。淀粉在ct-淀粉酶的作用下，分子迅速降解，粘度下降，即完成液化。a-淀粉酶具有相當(dāng)大的商業(yè)價值，廣泛應(yīng)用于淀粉深加工工業(yè)、酒精工業(yè)、啤酒工業(yè)、擰檬酸工業(yè)、味精及淀粉糖化工業(yè)、制藥工業(yè)及紡織業(yè)。a-淀粉酶可由微生物發(fā)酵產(chǎn)生，也可由植物、動物提取。目前工業(yè)生產(chǎn)上大都以微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)a-淀粉酶?？莶輻U菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽抱桿菌、米曲霉、黑曲霉等都是有實用價值的a-淀粉酶產(chǎn)生菌，其中地衣芽孢桿菌生產(chǎn)的a-淀粉酶因具有熱穩(wěn)定性而被優(yōu)選使用。耐髙溫a-淀粉酶由于具有相當(dāng)高的熱穩(wěn)定性，因此被廣泛應(yīng)用于啤酒、酒精、制藥及食品等行業(yè)，是目前工業(yè)上用途最廣泛的一種酶。但是，近年來隨著淀粉原料深加工行業(yè)的發(fā)展，要求酶制劑行業(yè)需要不斷更新和完善酶的種類以滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。對于淀粉糖化工業(yè)，目前工業(yè)上常采用雙酶法水解淀粉制糖，自然pH為4.0-5.0的淀粉漿需經(jīng)液化和糖化兩個過程處理，即先加淀粉酶液化，再加糖化酶糖化來生產(chǎn)葡萄糖.但是由于目前市售的淀粉酶最適pH為6.5-9.0，而糖化酶的最適pH為4.5左右，因此淀粉漿需先加堿調(diào)整PH進(jìn)行液化，液化液還需再加酸調(diào)整pH才能用于糖化，反復(fù)調(diào)節(jié)pH不僅使工藝變得繁瑣增加生產(chǎn)成本，引入外源離于，加重離交負(fù)擔(dān)，而且調(diào)節(jié)不當(dāng)還會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，使葡萄糖收率降低。在我國傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酸度不斷增加，pH下降，使酶的活性降低，淀粉水解不徹底，原料大約有12%不能被利用；而在酒精行業(yè)中，由于廢水的回填，使得原料液pH值降為4.0-5.0，也不適合a-淀粉酶的作用。味精行業(yè)對淀粉水解糖液的質(zhì)量要求卜分嚴(yán)格，加工工藝的pfl—般為4.6-4.8。為了給淀粉原料的深加工提供更好的條件，開創(chuàng)新的酶法工藝，提高收得率、降低消耗、提高產(chǎn)品質(zhì)量、增加效益，特別對于節(jié)約工業(yè)用糧，滿足一些在酸性條件下進(jìn)行淀粉原料液化工藝的要求，開發(fā)一種耐酸的高溫a-淀粉酶就勢在必行。早在1963年，H本的研究者YasujiMinoda等人就發(fā)現(xiàn)可以用真菌生產(chǎn)耐酸性a-淀粉酶，以后歐洲、美國、韓國、中國等國家都對耐酸性a-淀粉酶進(jìn)行了研究，其屮得到的產(chǎn)耐酸性a-淀粉酶的微生物大多為芽孢桿菌和曲霉。1994年，日本宮崎大學(xué)的高崎幸義教授從土壤中分離到一株地衣芽孢桿菌，所產(chǎn)的a-淀粉酶最適pfl為5.0，最適溫度為90'C。另外，日本科學(xué)家今中忠行選育出一株耐酸性的a-淀粉酶產(chǎn)生菌/yr0C0CCMSA，該菌株所產(chǎn)的a-淀粉酶最適pH為5.0,在pH5.0時最適反應(yīng)溫度為lOOC。運用基因工程手段，構(gòu)建耐高溫耐酸性a-淀粉酶生產(chǎn)菌，是目前各閨研究者最常用的一種育種方法。歐洲的研究者采用基因技術(shù)改造fec^7i/s"'c力em'/br啦's來生產(chǎn)耐熱性的耐酸性a-淀粉酶。在原有天然菌株的DNA序列中將N188位的天冬氨酸殘基用其它任何一種氨基酸取代，并使在N15或N197位的蛋氨酸殘基缺失，得到的高產(chǎn)菌株所生產(chǎn)的a-淀粉酶適用的液化pH值可以降低到5.0，且在100-1IOIC時活性不變。在我國，20世紀(jì)70年代時已有人用力砂e/^77t/s/w'ger進(jìn)行酸性a-淀粉酶的發(fā)酵研究，但未取得進(jìn)展。90年代時，中科院微生物研究所研究了嗜熱真菌7Zer邁o/^ces7a/w/^77osi/s對a-淀粉酶的生產(chǎn)，該酶的最適溫度和pH分別為65"和5.0，其耐熱性較差。目前商品化應(yīng)用的真菌月SjDe7^/77tfsary幼e和i4s/e/^77^ASairafflKr/的a—淀粉酶PH范圍為5-6，但不耐髙溫。江南大學(xué)從淀粉加工廠的酸性土壤中篩選到的5aw7hsWearof力er歷o/w7/ws,能夠產(chǎn)生兩種酸性a-淀粉酶，其最適pH分別為4.5和5.0，最適溫度為601C，可以應(yīng)用于一定條件下的酒糟利用和處理?？梢钥闯?，目前國內(nèi)酸性a-淀粉酶的最適溫度都低于7piC，由于超過7(TC進(jìn)行水解反應(yīng)時酶活就會大量損失，因此不能適應(yīng)我國酒精、淀粉糖化等淀粉深加工行業(yè)工藝的要求。為了給淀粉原料的深加工提供更好的條件，需要開創(chuàng)新的酶法工藝；特別是為了節(jié)約工業(yè)用糧，就需要運用基因i程手段，獲得既耐酸又耐高溫的a-淀粉酶的高效表達(dá)，以顯著提高經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高溫耐酸性a-淀粉酶的突變株及其構(gòu)建方法。本發(fā)明是將經(jīng)過體外定點突變改造后獲得的耐髙溫及耐酸同時兼顧的a-淀粉酶突變基因經(jīng)過與出發(fā)菌株地衣芽孢桿菌的基因組DNA同源重組后整合到其基因組上，使高溫耐酸性a-淀粉酶獲得了同源高效表達(dá)。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種高溫耐酸性a-淀粉酶的突變株，是將出發(fā)菌株地衣芽孢桿菌耐高溫a-淀粉酶基因經(jīng)體外Leul34—Arg和Ser320—Ala突變后所獲得的高溫耐酸性a-淀粉酶基因取代原始耐高溫a-淀粉酶基因后得到的突變株。而且，所述的出發(fā)菌株地衣芽孢桿菌在中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心CTCC保藏，保藏號10181。一種髙溫耐酸性a-淀粉酶的突變株的構(gòu)建方法，其構(gòu)建方法包括如下歩驟(1).構(gòu)建打靶載體pUC-afl^-a/zy^Km-:以地衣芽孢桿菌基因組DNA為模板，各設(shè)計兩對特異的PCR引物，擴(kuò)增耐高溫ci-淀粉酶的上游、下游同源性核苷酸片段，得到兩個同源性核苷酸片段，將上游片段、卡那霉素抗性基因、下游片段定向連接入載體中，構(gòu)建得到打靶載體pUC-a/zy^-az/T^KnT;(2).構(gòu)建打靶載體pUC-a/^d以含高溫耐酸性a-淀粉酶基因的重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計特異的PCR引物，擴(kuò)增高溫耐酸性a-淀粉酶基因，將該片段連入載體中，構(gòu)建得到打靶載體pUC-a//"(3).獲得地衣芽孢桿菌耐高溫a-淀粉酶基因缺失株利用打靶載體pUC-a/zy^-a^iH(nf轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌原始出發(fā)菌株，同源重組其宿主細(xì)胞基因組DNA，卡那抗性基因取代基因組DNA中部分耐高溫a-淀粉酶基因，獲得地衣芽孢桿菌耐高溫a-淀粉酶基因缺失株；(4).獲得高溫耐酸性a-淀粉酶基因突變株利用打靶載體pUC-afflj^/轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌耐高溫a-淀粉酶基因缺失株，同源重組其宿主細(xì)胞基因組DNA，高溫耐酸性a-淀粉酶基因帶有兩個突變位點的部分基因取代缺失株基因組中卡那抗性基因，獲得地衣芽孢桿菌高溫耐酸性a-淀粉酶基因突變株。而且，所述步驟(l)的耐高溫a-淀粉酶的上游、下游同源性核苷酸片段分別為372bp和350bp。而且，所述歩驟(l)、(2)中連接基因片段的載體為pUC19;所述步驟(3)、(4)中卡那抗性基因來自于枯草芽孢桿菌p冊980質(zhì)粒，大小為1112bp;所述步驟(2)中含高溫耐酸性a-淀粉酶基因的重組質(zhì)粒為pBEC。而且，所述步驟(3)的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞為地衣芽孢桿菌細(xì)胞；所述步驟(4)的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞為地衣芽孢桿菌耐高溫a-淀粉麵基因缺失株細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是本發(fā)明利用同源重組技術(shù)，將經(jīng)過體外定點突變后獲得的高溫耐酸性a-淀粉酶基因整合到出發(fā)菌株地衣芽孢桿菌基因組DNA上，取代原有的耐高溫a-淀粉酶基因，獲得了耐高溫及耐酸同時兼顧的a-淀粉酶的高效表達(dá)。該酶最適溫度為951C，最適pH為4.5,在溫度40"C-95iC，？114.0-6.5之間時，酶活較穩(wěn)定，說明該酶具有良好的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性。本發(fā)明開創(chuàng)了新的酶法工藝，節(jié)約了工業(yè)用糧，給淀粉原料的深加工提供了更好的條件，更適用于工業(yè)化的生產(chǎn)和應(yīng)用，不僅具有重要的經(jīng)濟(jì)效益，也具有明顯的社會效"^i-o圖l是本發(fā)明a/By厶湖y么KnT的PCR擴(kuò)增電泳閣2是本發(fā)明打靶載體pLiC-^zy^-a/^^KnT構(gòu)建示意圖3是本發(fā)明湖yd的l)CR擴(kuò)增電泳圖4是本發(fā)明打靶載體pUC-湖y^構(gòu)建示意圖5是本發(fā)明突變a-淀粉酶對照原始a-淀粉酶最適pH示意圖6是本發(fā)明突變a-淀粉酶對照原始a-淀粉酶PH穩(wěn)定性示意圖7是本發(fā)明突變a-淀粉酶對照原始a-淀粉酶DE值變化曲線示意圖；圖8是本發(fā)明突變a-淀粉酶對照原始a-淀粉酶透光率變化曲線示意圖。具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明將已經(jīng)獲得的高溫耐酸性a-淀粉酶(a-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá).食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(10):33-36.耐酸耐高溫的a-淀粉酶及其制備方法，專利申請?zhí)?00510013865.2)，為了提高從地衣芽孢桿菌(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，CICC,保藏號，10181)中分離出的耐高溫a-淀粉酶的耐酸穩(wěn)定性，將該基因成熟肽134位的L-亮氨酸變?yōu)長-精氨酸、其320位的L-絲氨酸變?yōu)長-丙氨酸所獲得的突變基因；將該基因利用同源重組的方法整合到出發(fā)菌株地衣芽孢桿菌基因組DNA中，取代原有的耐高溫a-淀粉酶基因，實現(xiàn)高溫耐酸性a-淀粉酶的同源髙效表達(dá)。該a-淀粉酶突變株產(chǎn)酶活力高，在保持其熱穩(wěn)定性的同時，具有了良好的酸穩(wěn)定性，適用于工業(yè)化的生產(chǎn)和應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計了3對上下游引物，按照圖1所示以pUC19為載體，將耐高溫a-淀粉酶基因的上游372bp、下游350bp的片段與卡那霉素抗性基因進(jìn)行連接，構(gòu)建打靶載體pUC-aay^-a/^^KnT，與出發(fā)菌株地衣芽孢桿菌進(jìn)行同源重組，篩選卡那霉素抗性、氨芐青霉素敏感的地衣芽孢桿菌耐高溫a-淀粉酶基因缺失株。按照圖2所示以pUC19為載體，與高溫耐酸性a-淀粉酶基因進(jìn)行連接，構(gòu)建打耙載體pUC-a^c/,與獲得的基因敲除突變株進(jìn)行同源重組，篩選卡那霉素及氨芐青霉素敏感的地衣芽孢桿菌髙溫耐酸性a-淀粉酶基因突變株。本發(fā)明獲得的突變株所產(chǎn)的a-淀粉酶在pH4.5時，具有良好的酸穩(wěn)定性。一、打耙載體pUC-afl7y7-azy^"Kmr的構(gòu)建從地衣芽孢桿菌(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,CICC，保藏號10181)中分離出耐高溫a-淀粉酶基因，設(shè)計如下引物(引物委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)上游引物F1:5，-CCCAAGCTTGCAAATCTTAATGGGACGCT-3,下游引物R1:5，-CGCGGATCCGTCAGCGGGATCGACTTCAA-3'上游引物F2:5，-CGGGGTACCACGGGACGAMGGAGACTC-3，下游引物R2:5，-CCGGAATTCTCTTTGMCATAAATTGAAACCG-3,上游引物F3:5，-CGCGGATCCGCCGATGAAGATGGATTTTC-3，下游引物R3:5，-CGGGGTACCGCACACCCTTTATTCCGTTA-3'1.PCR擴(kuò)增按以下次序，將各成分在滅菌薄壁離心管內(nèi)混合，反應(yīng)組分加入量10XProbestbuffer5叱dNTP(2.5raol/L)4nL上游引物F1U0pmo]AiL)4ML下游引物R1U0pmol/MU4叱DNA模板'Probest高保真DNA聚合酶0.5叱ddH2031.5JJL總體積50叱擴(kuò)增條件95t:3min，l個循環(huán)；30s，30s，72。C60s，30個循環(huán)；72°C10min，l個循環(huán)。其中上游引物F15'端含〃jV3dlII酶切位點，下游引物R15'端含萬arfn酶切位點。以地衣芽孢桿菌耐高溫o-淀粉酶基因為模板，引物F1和R為引物，在上述體系和條件下進(jìn)行PCR1擴(kuò)增，得到該基因上游372bp的DNA片段朋!r厶(2).PCR2按以下次序，將各成分在滅菌薄壁離心管內(nèi)混合，反應(yīng)組分加入量10XProbestbuffer5MidNTP(2.5mol/L)4叱上游引物F2(10pmo]./ML)4叱下游引物R2(10pmol/叱)4叱DNA模板1HLProbest高保真DNA聚合酶0.5MLddH2031.5ML總體積50ML擴(kuò)增條件95"3min，l個循環(huán)；94"30s，53X:30s，72"60s,30個循環(huán)；72"10min，l個循環(huán)。其中上游引物F25'端含,/wI酶切位點，下游引物R25'端含fcoRI酶切位點。以地衣芽孢桿菌耐高溫a-淀粉酶基因為模板，引物F2和R2為引物，在上述體系和條件下進(jìn)行PCR2擴(kuò)增，得到該基因下游350bp的DNA片段朋7/么(3).PCR3按以下次序，將各成分在滅菌薄壁離心管內(nèi)混合，反應(yīng)組分加入量10XProbestbuffer5MLdNTP(2.5mol/L)4叱上游引物F3(10praol/ML)化L下游引物R3(10pmolAiL)扭LDNA模板1PLProbest高保真DNA聚合酶0.5MLddH2031.5HL總體積50Mi擴(kuò)增條件95"C3min，l個循環(huán)；94匸30s,53"30s，72°C60s，30個循環(huán)；72。C20min,l個循環(huán)。其中上游引物F35'端含ifeflHI酶切位點，下游引物R35'端含A^M酶切位點。以枯草芽孢桿菌pWB980質(zhì)粒為模板，引物F3和R3為引物，在上述體系和條件下進(jìn)行PCR3擴(kuò)增，得到編碼卡那抗性基因1112bp的DNA片段KnT。將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約370bp，350bp，1112bp處出現(xiàn)特異性條帶，結(jié)果如圖l所示，其大小與目的基因片段a/zy^，，y么KnT完全吻合。2.構(gòu)建打靶載體pUC-柳/7-;My^4CnT如圖2，構(gòu)建過程如下().將PCR擴(kuò)增得到的目的基因a/z^分別用歷Vxiin和5aflHI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒(改試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)純化。(2).將pUC19質(zhì)粒(該質(zhì)粒購自TAKARA公司)經(jīng)〃i/3dni和/feflHI雙酶切、純化后與第(l)步的純化產(chǎn)物通過連接試劑盒(該試劑盒購自TAKARA公司)在12t:的條件下連接12h，得到重組質(zhì)粒pUC-a^厶(3).將10叱的pUC-a/^7電轉(zhuǎn)化40^大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含氨芐青霉素(100Mg/mL)的IPTG、X-gal的LA平板上，從藍(lán)白選擇平板上挑選驗證正確的的陽性轉(zhuǎn)化子pUC-azy^，經(jīng)/T/M7l和&oRI歡酶切、切膠純化后回收。(4).將湖^邀A5Ml和^boRI雙酶切、純化后與第(3)步的回收產(chǎn)物通過連接試劑盒在12t:的條件下連接12h,得到重組質(zhì)粒pUC-a/z^-aflr么(5).將10叱的pUC-afly^-aay灘轉(zhuǎn)化40ML大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含氨節(jié)青霉素(100Mg/mL)的IPTG、X-gal的LA平板上，從藍(lán)白選擇平板上挑選驗證正確的陽性轉(zhuǎn)化子pUC-a/^7-aay《，經(jīng)Mn和A^7l雙酶切、切膠純化后回收。(6).將Knf經(jīng)Mn和A^7l雙酶切、純化后與第(5)步的回收產(chǎn)物通過連接試劑盒在121C的條件下連接12h，得到重組質(zhì)粒pUC-aay^-aay^"Knf。(7).將10ML的pUC-afl7//-affly^"Knf電轉(zhuǎn)化40ML大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞,涂布在含氨節(jié)青霉素(100Mg/mL)的IPTG、X-gal的LA平板上，從藍(lán)白選擇平板上挑選驗證正確的陽性轉(zhuǎn)化子pUC-柳y/-aay^"KnT，得到打耙載體pUC-柳y7-afly^"KnT。二、打靶載體pUC-afly^/的構(gòu)建1.PCR擴(kuò)增按以下次序，將各成分在滅菌薄壁離心管內(nèi)混合，反應(yīng)組分加入量10XProbestbuffer5MLd證(2.5mol/L)4nL上游引物F1(10pmoJAiU下游引物K2(10pmol/叱)4W,DNA模板1HLProbest高保真DNA聚合酶0.5叱ddH2031.5ML總體積50化擴(kuò)增條件95"C3min，l個循環(huán)；94°C30s,63^30s，72°C60s，30個循環(huán)；72°C10min，l個循環(huán)。其中上游引物F15，端含W/xinT酶切位點，下游引物R25，端含fcoRI酶切位點。以地衣芽孢桿菌高溫耐酸性a-淀粉酶基因為模板，引物F1和R1為引物，在上述體系和條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到該基因1449bp的DNA片段湖7/A將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1500bp處出現(xiàn)特異性條帶，結(jié)果如圖3所示，其大小與目的基因片段湖vo完全吻合。2.構(gòu)建打靶載體pUC-aay^如圖4，構(gòu)建過程如下(1).將PCR擴(kuò)增得到的目的基因柳/紛別用///]111和￡6'凍1雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)DMA純化試劑盒純化。(2).將01^19質(zhì)粒經(jīng)///^111和/^^1雙酶切、純化后與第(l)步的純化產(chǎn)物通過連接試劑盒在12C的條件下連接12h，得到重組質(zhì)粒pUC-a/ff.^/。(3).將10ML的pUC-3ffi[Kfl電轉(zhuǎn)化40ML大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含氨節(jié)青霉素(100Mg/mU的IPTG、X-gal的UV平板上，從藍(lán)白選擇平板上挑選驗證正確的陽性轉(zhuǎn)化子pUC-aayW，得到打靶載體pUC-azy^/。三、利用打靶載體pUC-a^^KnT同源重組地衣芽孢桿菌，獲得地衣芽孢桿菌耐高溫a-淀粉酶基因缺失株將出發(fā)菌株地衣芽孢桿菌單菌落接種到30mLPA液體培養(yǎng)基/250mL三角瓶(PA培養(yǎng)基配方100g去皮馬鈴薯加500ml水煮沸30min，雙層紗布過濾；lg酵母粉lOg蛋白胨，pH7.2，H201000mL)37"，200r/min培養(yǎng)72h。離心收集芽孢。將107個芽孢接種到25mLNBSG~X生長培養(yǎng)基/250mL三角瓶(NBSG"X培養(yǎng)基配方K^PO^56.Og，KH2P0424.Og，(NH》2SO,2.0g，擰檬酸三鈉6.Og，MgS04.7H201.2g，F(xiàn)eCl3'611200.04g，MnS04WO0.0025g，甘油5.0g，營養(yǎng)肉湯8.0g，pH8.0，H20lOOOmL)37X:，往復(fù)式搖床，振幅5cm，100次/min，培養(yǎng)18h。將0.1mL培養(yǎng)液、0.1mL(lOOMg)質(zhì)粒pUC-aOTy/-afflyfKnr與0.8mLTM培養(yǎng)基(TM培養(yǎng)基配方lyff(U4.0g，KH2P0,6.0g，(NH^SOA0g，檸檬酸三鈉1.Og,MgS(^7H201.Og，MnSOiH200.0125g，CaCl22H200.30g，NaCl11.7g，葡萄糖5.Og,H20lOOOmL)混合，37C往復(fù)式搖床，振幅5cm，100次/min，培養(yǎng)3h。將轉(zhuǎn)化液涂布于含卡那霉素(30Mg/mL)的minimal1瓊脂平板上(minimal1瓊脂培養(yǎng)基配方KJff0414.Og，KHaPOW.0g，(NH^SC^2二0g，擰檬酸三鈉1.Og,MgS04'7&00.20g，F(xiàn)eCl:,6H200.04g，MnSOtH200.0025g，葡萄糖5.0g，酸水解酪蛋白lg，瓊脂粉20g，H201000mL)。48h后挑取轉(zhuǎn)化子，點接到含氨芐青霉素(100Mg/mL)的minimi1瓊脂平板上，以在含氨芐青霉素(100fig/mL)的minimal1瓊脂平板上未長的轉(zhuǎn)化子基因組DM為模板，利用上游引物F3、下游引物R3，上游引物F1、下游引物R2分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約1100bp,1800bp處出現(xiàn)特異性條帶，即為陽性轉(zhuǎn)化子。此轉(zhuǎn)化子即為地衣芽孢桿菌耐高溫a-淀粉酶基因缺失株。四、利用打靶載體plJC-c柳j^同源重組地衣芽孢桿菌耐高溫ci-淀粉酶基因缺失株，獲得高溫耐酸性a-淀粉酶基因突變株將地衣芽孢桿菌耐高溫a-淀粉酶基因缺失株單菌落接種到30mLPA液體培養(yǎng)基/250mL三角瓶，37'C,200r/min培養(yǎng)72h。離心收集芽孢。將107個芽孢接種到25mLNBSG-X生長培養(yǎng)基/250mL三角瓶，37匯，往復(fù)式搖床，振幅5cm,100次/mJn，培養(yǎng)18h。將0.1mL培養(yǎng)液、0.1mL(100Hg)質(zhì)粒pUC-與0.8mLTM培養(yǎng)基混合，37°C，往復(fù)式搖床，振幅5cm，100次/ndn，培養(yǎng)3h。將轉(zhuǎn)化液涂布于minimal.1瓊脂平板上。48h后挑取轉(zhuǎn)化子，點接到含氨芐青霉素(100Mg/mL)、卡那霉素(30Mg/mL)的minimal1瓊脂平板上，以在含氨芐青霉素(lOOPg/raL)、卡那霉素(30Mg/mL)的minima]1瓊脂平板上未長的轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，上游引物FK下游引物R2，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約1500bp處出現(xiàn)特異性條帶，即為陽性轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子該基因進(jìn)行核苷酸序列測定進(jìn)行比對，結(jié)果與高溫耐酸性a-淀粉酶基因完全吻合的，即為高溫耐酸性a-淀粉酶基因突變株。五、突變株高溫耐酸性a-淀粉酶的表達(dá)及純化在活化培養(yǎng)基(牛肉粉5.0g，NaC12.0g，酵母粉2.0g，蛋白胨10g，粗淀粉10g，葡萄糖50g(單消)，瓊脂粉17g,H20lOOOmL)上培養(yǎng)36h，挑取地衣芽孢桿菌突變株單菌落接種到50mL種子培養(yǎng)基/250mL三角瓶(種子培養(yǎng)基配方牛肉粉1.50g，酵母粉L50g，蛋白胨5.00g,磷酸二氫鉀(無水)1.32g，磷酸氫二鉀3.68g，葡萄糖l.OOg,NaC13.00g，H201000mL)，37"，200r/min培養(yǎng)16h。然后按2%接種量轉(zhuǎn)接至50mL發(fā)酵培養(yǎng)基/250mL擋板三角瓶(豆餅粉26g，棉籽餅粉21g,磷酸氫二鉀28.8g，磷酸二氫鉀(無水)6.7g，檸檬酸三鈉2.0g，玉米漿20g，(肌)孤5.0g，CaCl20.45g,乳糖10g(單消)，H20lOOOmL),421C，300r/min培養(yǎng)96h。將發(fā)酵液經(jīng)離心后獲得的上清液，先加入30%飽和度的硫酸銨鹽析除去雜蛋白，再把飽和度加大到70%，沉淀目的蛋白，可取得較好的分離效果。用0.02mol/LTris-HC1(pH7.0)緩沖液平衡DEAE-S印haroseFastFlow(2.4cmX30cm)離子交換層析柱，將鹽析脫鹽后得到的活性組分用同樣的緩沖液溶解，6000r/min離心10min，上樣(2ml)后用同樣的緩沖液先洗脫未吸附的蛋白，再用含0-lmol/LNaCl的0.02raol/LTris-HC1(pH7.0)緩沖液梯度洗脫，分歩收集。用0.02mol/LTris-HC1(pH7.0)緩沖液平衡S印hadexG-75(1.6cmX80cm)凝膠層析柱，將離子交換得到的活性組分先用含0.15mol/LNaCl的0.02.ol/LTris-HC1(pH7.0)緩沖液平衡，樣品6000r/rain離心10min，上樣(2ml)后用相同的緩沖液以0.5ml/min的速度洗脫，每管收集2.Oml，紫外檢測器在線檢測A280nm，收集活性峰，得到電泳純的高溫耐酸性ci-淀粉酶。產(chǎn)品性能測定1.a-淀粉酶活力的測定酶活力單位定義在70'C、pH6.0條件下，lmin液化lmg可溶性淀粉成為糊精所需要的酶量，即為1個酶活力單位，以U/mL(U/g)表示。測定方法(QB/T2306-97)如下1.酶液制備用緩沖液配制成酶溶液，使其最終酶濃度控制在65U/mL-70U/mL范圍之內(nèi)。2.測定(1)吸取可溶性淀粉溶液(20g/L)20mL和磷酸緩沖液(pH=6.0)5mL于試管中。在70'C恒溫水浴中預(yù)熱3min-5min。(2)加入稀釋好的待測酶液1.OOmL，立即計吋，搖勻，準(zhǔn)確反應(yīng)5rain。(3)立即吸取1.OOmL反應(yīng)液移入預(yù)先裝有0.lmol/LHC10.5mL和5mL稀碘液的試管中搖勻。(4)以0.lmol/LHC10.5mL和5mL稀碘液的混合液作空白，于660nm波長下，用lOmm比色皿迅速測定吸光度(A)。根據(jù)吸光度査表，求得測試酶液的濃度(C)。3.計算X=CXNX16.67式中X-樣品的酶活力U/mL(U/g);C-測試的酶液濃度U/mL;N-樣品的稀釋倍數(shù)；16.67-換算常數(shù)。所得結(jié)果表示至整數(shù)。將突變株及原始株發(fā)酵液，12000r/min離心lOmin去除細(xì)胞，測定上淸液中的酶活(記為細(xì)胞外酶活)。2.a-淀粉酶性質(zhì)的研究經(jīng)硫酸銨鹽析、DEAE-S印haroscFastFlow離子交換層析、S印hadexG-75凝膠層析分離純化后，得到電泳純的突變a-淀粉酶及原始a-淀粉酶，對其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究。(1).溫度對酶活力的影響純酶最適反應(yīng)溫度的測定在不同溫度(30x:、4or;、5or、60"c、70°c、so'c、90'C、IOOX:)，pl訴.5的條件下測定重組酶純化酶液的酶活，將最高活力定為100%。②純酶的熱穩(wěn)定性測定將兩種重組酶純化酶液分別置于不同溫度U0r、60'C、80"、100r)服.5的條件下保溫21，每隔20min取出，各自測定其殘余酶活力，以相應(yīng)溫度下未保溫的酶液活力為100%，繪制溫度穩(wěn)定性曲線。原始a-淀粉酶和突變a-淀粉酶反應(yīng)的最適溫度均為95C在70X:到IOOX:之間相對酶活為80%以上。兩種酶在40到801C保溫120min，酶活基本沒有損失，殘余酶活保持在80%以上，1001C保溫60min，原始a-淀粉酶和突變a-淀粉酶仍有61%、68%的殘余酶活，具有一定的耐熱性.，.說明原始a-淀粉酶經(jīng)過體外定點突變后獲得突變a-淀粉酶,耐高溫的酶學(xué)特性并沒有改變,,(2).pH對酶活力的影響①純酶最適反應(yīng)pH的測定在不同pH值(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)70匸的下測定重組酶純化酶液的酶活，將最高活力定為100%。②純酶的pH穩(wěn)定性測定將兩種重組酶純化酶液在不同pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)條件下在70"保溫60min，各自測定其殘余酶活力，以相應(yīng)pH下未保溫的酶活力為10094，繪制pH穩(wěn)定性曲線。由圖5可知，原始a-淀粉酶的最適pH為6.5，在pH6-7之間，相對酶活在90%以上，pH3,5以下完全失活。突變a-淀粉酶最適pH為4.5，在pH4時相對酶活仍達(dá)到80%。由圖6可知，原始a-淀粉酶在pH5.5-7.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，殘余酶活為80%以上，突變a-淀粉酶在pH4.0-6.5范圍內(nèi)較穩(wěn)定，殘余酶活為80%以上，pH4.5時殘余酶活為90%,具有很好的耐酸穩(wěn)定性。結(jié)果表明，原始a-淀粉酶經(jīng)過體外定點突變后獲得突變a-淀粉酶，耐高溫的酶學(xué)特性并沒有改變，而耐酸穩(wěn)定性明顯提高，獲得了既耐酸又耐高溫的新型a-淀粉酶。(3).a-淀粉酶應(yīng)用實驗配置濃度為20%的玉米淀粉溶液100mL，調(diào)節(jié)pH值至4.5，按30U/g淀粉加入重組酶，95t:保溫90rain后，加入鹽酸調(diào)液化液pH至2.0，使酶鈍化，終止酶的反應(yīng)，并迅速冷卻至常溫，鈍化后加入相應(yīng)的氫氧化鈉中和鹽酸進(jìn)行DE值測定。①DE值的測定與計算測定方法參照中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB12I6-91中6.6.2直接滴定法。DE計算按下式進(jìn)行說，=lxK/x10式中DE-樣品的DE值，％:VI-標(biāo)定時消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(g/L);V2-測定時消耗試樣的體積，mL;m-樣品的質(zhì)量，g;G-樣品的固形物含量。②透光率的測定玉米淀粉液化反應(yīng)結(jié)束，立即加入一定量的lmol/L鹽酸終止反應(yīng)，并冷卻至室溫，以蒸餾水做對照，測定640rai波長下的透光率。DE值的變化結(jié)果如圖7所示，在95'C，pH值4.5的反應(yīng)體系下，突變a-淀粉酶的DE值明顯高于原始a-淀粉酶。由圖8所示，突變a-淀粉酶的透光率值高于原始a-淀粉酶，說明在此反應(yīng)體系f，突變a-淀粉酶液化液中雜質(zhì)凝聚的效果好于原始a-淀粉酶液化液。這一應(yīng)用試驗結(jié)果表明，突變a-淀粉酶在高溫酸性條件下的酶活力及穩(wěn)定性明顯高于原始a-淀粉酶。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>275HisTyrGinPhe290ArgLysLeuLeu305ValThrPheValSerThrValGin340ThrArgGluSer355ThrLysGlyAsp370GluProliel"eu385AspTyrPheAspSerSerValAla420GlyG]yAlaLys435TrpHisAspIe450Glu(;lyTrpC'.ly465ValGinArg<210>2<2J1〉1846<212>PRT<213>耐高溫a-<40()〉2GlyCysAlaAlaCysG]yCysThr20ThrGlyAlaAla35AlaA丄aThrGly50GlyGlyAlaAla65CysGlyAJaCysGJ.yCysThrGly100CysThrGlyCysHisAsnAsp325ThrGlySerLysHis405AsnArgThrGluAlaGly310AsnTrpTyrGinAla390HisSerMetGlyPhe470Ala295ThrHisPheProArg375ArgAspGlyTyrAsn455His280SerValAspLysGin360G]uLyslieLeuVal440ArgVatThrValThrPro345VallieGinValAla425GlySerAsnGinSerGin330LeuPheProTyrGly410AlaArgGluGlyGlyLys315ProAlaTyrAlaAla395TrpLeuGinProGly475Gly300HisGlyTyrGlyLeu380TyrThrlieAsnVal460Ser285GlyProGinAlaAsp365LysGlyArgThrAla445ValValTyrLeuSerPhe350MetHisAlaGluAsp430GlylieSorAspLysLeu335lieTyrLysGinGly415GlyGluAsnTieMetAla320GluLeuGlylieHis400AspProThrSerTyr柳.淀粉酶缺失株(a_1,4-glucan-glucanhydrolase)Ala5GlyThrAlaGlyThr85AlaCysThrAlaGlyCysCys70CysAlaGlyCysThrGlyGly55GlyGJyCysThrThrGJyThr40GlyThrGlyA.laThrCys25AlaCysThrCysGys105ThrAla10八LaCysCysThrAla90GlyGlyAlaGlyAJaAlaGJy75ThrGlyGlyThrThrThrAla60CysAlaThrAlaGlyAlaGJy45CysAlaThrAlaThrGlyGly15ThrThr30CysCysAlaThrAlaA1bThrThr95ThrThr110ThrCysAlaThrCysThrAla80GJyAlaCysCysAla145ThrCysGlyAlaAla225G]yCysThrGlyThr305CysGlyThrThrGly385ThrThrThrAlaCys465AlaCys130CysGlyGlyGlyAla210AlaGlyGlyThrThr290CysGlyAlaThrGly370AlaThrThrAlaGlyAlaGly115CysGlyGlyAlaGly195GlyAlaAlaAlaCys275ThrAlaGlyA.laGly355AlaAlaAlaGlyThr435ThrG]yAlaGlyAlaGlyCys180GlyGlyGlyGlyThr260CysThrThrCysGJy340AlaCysGyThr()]yThrThrThrThrGlyGlyCys165CysAlaGlyThrAla245CysCysAlaCysGly325AlaAlaGlyA]aThr405GlyThrCysThrGly485CysCys150ThrThrGlyAlaAla230GlyAlaGlyCysAla310CysThrGlyGlyThr390G〗y(tǒng)AlaThrAlaThr470CysAla135CysAlaThrThrCys215CysCysAlaCysGly295AlaThrG-:yThrAla375GlyCysA]aA丄iiAla455GlyThr120ThrAlaCysThrThr200GlyAlaThrAaGly280(;lyCys;LyThr360Thr(;lyAlaCysThr柳CysThrAlaAlaAlaGlyAla185ThrGlyGlyGlyAla265AlaGlyCysAlaAla345(;lyCysAlaAaGly425ThrAlaThrThrThrGlyGly170ThrCysThrCysCys250GlyCysGlyAlaThr330AlaAlaCysThrThr410GlyAlaA]aGlyA丄a490AlaCys155ThrGlyAlaThrAla235AlaThrAlaAlaCys315GlyCysThrGlyThr395GlyAlaAlaAlaAla475AlaAla140GlyGlyAlaThrCys220CysAlaCysThrThr300AlaCysCysCysCys380ThrThrAlaAlaCys460AlaThr125GlyGlyCysThrCys205GlyAlaThrThrThr285GlyAJa(;yGlyCys365CysThrGlyAlaGly445GyGlyThrGlyAlaThrThr190AlaGlyAlaCysThr270AlaThrAlaAlaCys350CysGlyCysG].yA]a430AlaGlyAlaGlyGlyThrThr175ThrAlaAlaAlaThr255CysAlaGlyGlyCys335GlyGlyAlaThrAla415AlaGlyGlyThrThr495AlaGly160AlaAlaAlaCysAla240GlyAlaCysGlyGly320CysG]yCysThrAla400AlaThrThrCysThr480ThrAlaGlyAlaAla545CysAlaAlaAlaGly625CysGlyAlaThrThr705(;]yThrThrAlaThr785AlaGlyAlaG]yGlyThrAlaGly530ThrCysGlyAlaAla610GlyThrAlaThrGly690;lyG]yThrGlyThr770CysGlyAlaGlyAla850AlaThrThr515ThrAlaAlaAlaThr595ThrAlaAlaAlaThr675GlyAlaThrGlyGly755ThrAlaCysAlaThr835AlaG]yAla500GlyThrAlaAlaAla580ThrGlyCysGlyGly660AlaAlaThr〔;lyGly740GlyGlyThrAlaThr820GlyThrAlaAlaCysAlaGlyAla565AlaAlaAlaCysAla645AlaAlaThrGlyThr725ThrCysAlaGlyGly805Gly(;lyThrThrAlaThrThrAla550ThrAlaThrGlyAla630GlyThrGlyAlaThr710ThrCysCysGlyThr790AlaGlyAlaThrThrAlaThrThr535AlaAlaG]yCysAla615AlaAlaThrAla695ThrThrGlyCysAla775CysGlyAlaA〗aThr855GlyA丄a520AlaCysThrCysThr600AlaThrAlaGly咖AlaAlaAlaThrThr760ThrA.laThrCysGlyGlyThrGly505GlyAlaGlyThrAla585GlyThrAlaGlyThr665Ala'J'hrAlaThrCys745AlaGlyAlaThrAla825GlyAlaALaAlaGlyThrGlyCys570AlaAlaAlaAlaAla650ThrCysAlaGlyGly730AlaThrAlaCysCys810AlaThrThrCysThrAlaAlaThr555ThrAlaAlaGlyThr635AlaCysGJyThrG]y715GlyG〗y(tǒng)ThrThrAla795AlaCysGlyAlaThrThrAlaGly540GlyThrThrAlaThr620AlaAlaAlaAlaGly700CysCysAlaCysGly780G]yGlyCysGlyGly860AlaGlyGly525CysCysAlaCysAla605GlyAlaGlyThrAla685GlyThrThrCysGly765ThrAlaCysGlyAla845CysAla510AlaThrThrThrThr590GlyAlaThrAlaGly670ThrGlyAlaCysThr750GlyGlyGlyCysGly830AlaGlyAlaCysGlyCysThr575AlaGlyAlaGlyAla655AlaAlaGlyThrThr735GlyAlaThrGlyAla815ThrGlyAlaGlyGlyAlaThr560ThrAlaC'lyThrAla640ThrA]aThrAlaThr720CysAlaThrGlyAla800ThrGlyThrAlaGlyAaThrThr865AlaAlaAlaThrThr945ThrAlaGlyThrThrGlyThrCysCysThrAlaAlaThrCysAlaGlyGlyCysThrThrCysCys930ThrAlaThrGlyThr1010Gly1025Ala1040Ala1055Gly1070Ala1085Thr1100Cys1115Thr腦Thr1145Ala1]60Cys1175Thr1190Thr1205Thr1220GlyCysAla915ThrA]aCysCysThr995CysCysAla900CysCysThrThrAla980AlaAla885GlyAlaThrGlyThr965AlaGly870ThrAlaThrAlaAla950A]aAlaAlaCysThrGlyThr935ThrGlyCysAlaThrThrPly920ThrThrA]aThrGlyCysGly905ThrThrCysGlyGly985Ala柳GlyCysThrAlaAla970Cys875GlyCysAlaGlyGly955AlaThrGlyCysA〗aCys940GlyAlaAlaThrGlyThr925CysThrGlyAlaGlyCys910ThrGlyGlyThrAla990Gly895ThrThrAlaGlyGly975Thr880AlaThrThrThrAla960ThrCys1000CysAlaCysGlyAlaThrAlaThrThrAlaThrThrGlyGlyThrGlyCysThfThrGlyGlyGlyA]aGlyCysGlyGlyAlaCysAlaThrAlaCysCysAlaCysAlaGlyThrThrCysThrGlyCysThrCysGlyAlaThrA]aAlaAlaA丄aThrCysGlyAlaAlaG]yCysThr1015Cys1030Cys畫Gly1060Ala1075Cys1090Cys1105Cyslt20Gly1135Gly1150Ala1165Ala腦Ala1195Cys1210Thr1225ThrThrGlyThrCysCysAlaGlyGlyThrGlyCysAidCysCysCysCysAlaAlaAlaCysGly1005ThrGlyCysGlyAlaThrthr1020ThrAlaThrCysGlyThrAla1035GlyThrThrThrGlyAlaAla腳CysAlaA[aA丄aThrGlyGly065ThrCysGlyThrGlyThrGly1080Gl.yAlaCysAlaAlaCysAla1095ALaThrCysCysThrThrGly1110GlyGlyThrAlaGlyCysAla1125ThrGlyCysCysA]aThrG]y1140ThrCysThrGlyCysAlaThr1155CysThrGlyThrThrAlaThr1170CysGlyCysThrThrCysGly185ThrGlyAlaAlaG]yCysAla200AlaThrCysAlaGlyALaThr1215AlaGlyGlyThrThrAlaThr1230GlyThrCysGlyThrThrGlyCysGlyAlaAlaThrThrCysGlyGJyCys(;lyG]yGlyCysThrAlaAla1235Thr1250Ala1265Ala1280Cys1295Gly1310Ala1325Ala1340Ala1355Thr1370Thr1385G]y1400ThrM15Thr簡Thr1445ThrM60Gly1475Cys1490Ala1505Cys1520Thr1535(;]y550Gly1565CysCysAlaGlyGlyGlyGlyCysThrAlaGlyThrAlaThrAlaCysGlyGLyAlaGlyThrAlaCysCysGlyCysAlaCysAlaThrGlyGlyCysAlaThrCysCysAlaA〗aAlaGlyAlaCysGlyAlaGlyAlaThrThrAlaThrAlaGlyGlyThrCysCysAlaGlyThrThrThrAlaThrG丄yGlyAlaCysAlaThrAlaThrAlaAlaThrGlyAlaGlyAlaCysAlaThrCysThrGlyThrALaGlyAlaAlaCysGlyCys1240Ala1255Thr1270Cys.1285Gly1300Gly1315Ala.1330Thr1345Thr1360Thr1375Thr1390Thr405Ala1421JCys1435Ala1450Gly1465Ala剛Cys1495Ala1510A]a1525Ala1540Gly1555Ala1570ThrThrCysThrAlaGlyCysAlaCysThrCysCysThrThrThrCysAlaCysGlyAlaCysAla八laGlyGlyCysThrGlyGlyAlaThrAlaThrThrAlaThrAlaCysGlyAaAlaAlaThrAlaThrAlaThrThrGlyCysAlaAlaGlyAlaAlaThrAlaThrThrGlyAlaCysGlyCysCysThrCysCysAlaGlyCysAlaThrAlaThrAlaThrAlaGlyAlaGlyAlaThrThrAlaGlyGlyThrCysAlaThrCysCys1245Thr1260Cys1275Gly1290Thr1305Thr1320Ala1335Ala1350Ala1365Ala1380Thr1395Thr訓(xùn)Thr1425Ala1440(;lyM55Thr訓(xùn)Gly1485Gly1500Cys1515Cys1530Ala1545Thr1560Ala1575CysGlyThrGlyThrCysCysGlyCysAlaAlaThrThrThrG〗y(tǒng)ThrThrGlyCysThrAlaAlaGlyAlaGlyCysAlaThrAlaGlyThrGlyCysAlaGlyAlaThrCysAlaGlyAlaCysGlyAlaAaThrGlyThrThrAlaCysGlyAlaGlyCysGlyThrGlyAlaAlaThrAlaThrCysAlaCysThrAlaAlaThrGlyCysGlyThrAlaCysGlyGlyAlaGlyCysAlaCysAla■158卩1590GlyCysAlaThrGlyAlaThr'ThrAlaThrThrThrCysGlyAla159516001605CysCysAlaCysCysAlsThrGlyAlaCysAlaThrThrGlyThr161016151620CysGlyGlyCysThrGlyGlyAlaCysAlaAlaGlyGlyG]yAla162516301635AlaGlyGlyCysGlyAlaCysAlaGlyCysThrCysGlyGlyThr164016451650ThrGlyCysAlaAlaAlaThrThrCysAlaGlyGlyThrThrThr165516601665GlyGlyCysG]yG丄yCysAlaThrThrAlaAlaThrAlaA]aCys167016751680AlaGlyAlaCysGlyGlyAlaCysCysCysGlyGlyThrGlyGly168516901695GlyGlyCysAlaAlaAlaGlyCysGlyAlaAlaThrGlyThrAla170017051710ThrGlyThrCysGlyGlyCysCysGlyGlyCysAlaA]aAlaAla171517201725CysGlyCysCysGlyGlyThrGlyAlaGlyAlaCysAlaThrGly173017351740GlyCysAlaThrGlyAlaCysALaThrThrAlaCysCysG〗y(tǒng)Gly174517501755AlaAlaAlaCysCysGlyThrThrCysGlyGlyAlaGlyCysCys176017651770GlyGlyThr"ThrGlyThrCysAlaThrCysAlaAlaThrThrCys177517801785Gly(;]yAlaA]aG.lyGlyCysThrGlyGyGlyGlyAJaGlyAla179017951800GlyThrThrThrCysAlaCysGlyThrALaAlaAlaCysGlyGly180518101815CysGlyGlyG丄yThrCysGlyGlyThrThrThrCysAlaAlaThr隨18251830ThrThrAlaThrGlyThrThr(:ysAlaAlaAlaGlyAla1835關(guān)1845<210〉3<211〉483<212>PRT<213>耐高溫a-淀粉酶模板(a-1,4-glucan-glucanhydrolasc)<400〉3AJaAsnLeuAsnGlyThrLf'uMetGinTyrPheGluT卬TyrMetPro151015AsnAspGlyGinHisTrpLysArgLeuGinAsnAspSerAlaTyrl,eu202530<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>AspTyrPheAspHisHisAspIloValGlyTrp405410SerSerValAlaAsnSerGlyLeuAlaAlaLeu420425GlyGlyAlaLysArgMetTyrValGlyArgGin435440TrpHisAsplieThrGlyAsnArgSerGluPro450455GluGlyTrpGlyGluPheHisValAsnGlyGly465470475ValGinArg<210〉4<211>483<212>PRT<213>高溫耐酸a-淀粉酶模板(a-1，4-glucan-<400〉4AlaAsnLeuAsnGlyThrLeuMetG]nTyrPhe1510AsnAspGlyG]nHisTrpLysArgLeuGinAsn2025AlaGluHisGlylieThrAlaValTrpliePro3540ThrSerGinAlaAspValGJyTyrGlyAlaTyr5055(;lyGluPheHisGJnLysGlyThrValArgThr657075GlyGlulx;u(;lnSerAlaliel,y'sSerKcuHis8590ValTyrG〗y(tǒng)AspValVallieAsnHisLysGly100]05GluAspValThrAlaValGluVa.l.AspProAla115120lieSerG丄yGluHisArgliei'ysAlaTrpThr130135GlyArgG]ySerThrTyi"SerAspRieLysTrp150155AspGlyThrAspTrpAspG]uSerArgLysLeu165170PheGinGly1-ysAlaTrpAspTrpGluValSer180185TyrAspTyrLeuMetTyrAlaAsp].leAspTyr195200AJaAlaG]ulieLysArgTrpG]yThrTrpTyr210215LeuAspGlyPheArgLeuA叩A(chǔ)laValLysHis225230235ThrlieAsnVal460SerArgG.luThrAsp430AlaGly445VallieValSerGlyAsp415GlyProGluThrAsnSerlieTyr480-g1ucanhydro1ase)GluTrpTyrMetProAspProAsp60LysSerGlyAspHis140HisAsnAsnAspAla220lieSerAla45heuTyrArgAla125PheTrpArgGluAla30TyrTyrSerAspAspL10AsnHi'sTyrlieAsn190ProHis205AsnGlul,ysPheMet15TyrLysAspThrHe95AlaM"gPheHisTyr175G]yAspLeuSerLeuGly匕euLys80AsnThrValProPhe160l-ysAsnValGinPho240LeuPheTyrHisArg305ValSerThrThrGlu385AspSerGlyTrp(;lu465ValArgThrLeuTyr290LysThrThrArgLys370ProTyrSerGJyHJs450GlyGinAspValAsn275GinLeuPheValGlu355GlyliePheValAla435AspTrpArgTrpAla260LysPheLeuValGin340SerAspl'euAspAla420LysTicGlyVal245GluThrHisAsnAsp325ThrGlySerLysHis405AsnArgThrGluAsnTyrAsnAlaGly310AsnTrpTyrGinAla390HisSerMetGlyPhe470HisTrpPheAla295ThrHisPheProArg375ArgAspG]yTyrAsn455HisValGinAsn280SerVaJAspLysGin360GluLysliehcuVal柳ArgAsn265HisThrValThrPro345VallieGinVa:l.Ala425(;lySerAsnGlu250AspSerGinSerGin330LeuPheProTyrGly410AlaArgGluGlyLysLeuValGlyLys315ProAlaTyrAlaAla395TrpLeuGinProGly475ThrGlyPheGly300HisGlyTyrGlyLeu380TyrThrlieA'snVal460SerGlyAlaAsp285GlyProGinAla八sp365LysGlyArgThrAla445ValLysLeu270ValTyrLeuSerPhe350MetHisAlaGuAsp430GlylieGlu255GluProAspI」ysL>eu335lieTyrLysG]nGly415GlyGluAsnMetAsnLeuMetAla320GluLeuGlylieHis400AspProThrSerValSerlieTyr柳<210〉5<211〉372<212〉DNA<2]3〉呵l<400〉5gcaaatcttaatgggacgctgatgeagtattttgaatggteicatgcccaatgacggccaa60cattggaagcgtttgcaaaacgactcggcataLttggctgaacaeggtattactgccgtc120tggattcccceggcatataagggaacgagccaageggatgtgggctaeggtgettacgae180ct"fitgatttaggggagtttcati;iiaafUigggacggttcggacaaagtacagcacaaaa240ggagagctgcaatctgegatcaaaagi.c"cattcccgcgacattaacgtttaeggggat300gtggtcatcaaccacaaaggeggegctgf"gcgaccgaagatgtaaccgcggttgaagtc360gatcccgctgac372<210〉6<2U〉350<212〉DM<213>呵2<400〉6acgggacgaa卿agactccC8gcgcgaa3ttcctgccttattgaetccga60tcttaaaagcgagaaaacagtatgcgtscggagcacEigcatgattatttcgaccaccatg120acattgtcggctggac卿gg3鄉(xiāng)cgac3gctcggttgcaaattcaggtttggCggC3t180taataacagacggacccggtggggcaaagcgaatgtatgtcggccggcaaaacgccggtg240ageicatggcatgacattaccggaaaccgttcggagccggttgtcatcaattcgg卿gct300gggg卿gtttcacgtaaacggcgggtcggtttcaatttatgttcaaaga350<210〉7<211〉1449<212>DM<213〉axnyd<400〉7gcaaatcttaeitgggacgctgatgcagtattttgaatggtacatgcccaatgacggccaa60cattggaagcgtttgcaaaacgactcggcatatttggctgaacacggtattactgccgtc120tggattcdcccggcatataagggaacgagccaagcgg3tgtgggctacggtgcttacgac180ctttatgattt鄉(xiāng)ggagtttcstcaaaaaggg3CggttCggacaaagtac3gCELcaeia3240gg卿gctgcaatctgcgatcaaaagtcttcattcccgcg3cattaacgtttELCggggat300gtggtcatcaaccacaaaggcggcgctgatgcgaccgaagatgt犯ccgcggttgaagtc360gatcccgctgaccgcaaccgcgtaatttcaggagaacaccgcattaaagcctggacEicat420tttcat!Atccggggcgcggagcgeittttaaalggca/ttggtaccatttt480gacggaaccgattgggacgagtc(:cgaaagctgaaccgcatCtatiiElgtt540gcUgggattgggaagtttcggC犯Ct3tgaUatttgatgUitgccgac600atcgattatgaccatcctgatgtcgcagcagalggggcac"ggtatgcc660aatgaactgcaattggacggtttccgt,cttgatgc"lgtcaattUctttt720Ugcgggattgggtteiatcatgtcagg,a,cggggaaggaaatgtttacggtagct780gaatattggcagaatgacttgggcgcgctgaaa1111aat840cattcagtgtUgacgtgccgcttcattatC￡lgttCC￡ltgctgctvtcgeicacagggaggc900ggctatgatfitgaggaaa/Ltacggtcgtttccaagcatccgttgaaagcg%0Lcgataaccfitgatacacagccggggc犯tcgcUgagtcgactgtccaa1020acatggtttaagccgcttgcttacgcttUaUctcacaagggaatctggataccctcag1080g"ttctacggggatatgtiiggagactccctcctgccUg1140ttgaaccgatcttaaaagcgatgcgtacggagcacagcat1200gattatttcgEtccaccatgacattgtcggctggacaagggaaggcgacagctcggttgca1260tggcggcattggacccggtggggc咖gcgaatgtatgtc1320ggccggcaaaacgccggtgagacattaccggaaaccgttcggflgCCggtt1380gtcatcaattcggaaggctgcacgttiaacggcgggtcggtttcaatttat1440M49<210〉8<211〉U12<212〉DNA〈213〉kmr<■>8gccgatgaagatggattttctaUattgcagggaa(:ggaaaaattatttt60<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><210〉13<211〉29<212〉DNA<213〉上游引物F3<400>13cgcggatccgccgatgaagatggattttc<210〉14<211>29<212〉DNA<213〉下游引物R3<400>14cggggtaccgcacaccctttattccgtta<210>15<211>1846<212>DNA<213>耐高溫a-淀粉酶缺失株基因序列(<400>15gc333tctt3stgggscgctgstgc3gt3tcattggaagcgtttgcaaaacgactcggcatggattcccccggcatataagggaacgagcctttstgstttsggggagtttcatcdsaaaggsgsgctgc33tctgcgatcsassgtcttgtggtC3tcs3ccsc3saggcggcgctgatgstcccgctgscggstccgccgstgasgdtg33cggs333stt3ttttatt33sg3gtsg3gatgctst3sttgttsttssssggsttgsctg33t33g3scggtgctctcceL站tsttcgssasgggsstg3g站tsgtg33tgg3cca3ttgttcstg333tt33gg33cg紛t3ttgggtgttt3tggctctcttggtcgtcsgscttgtgtcatgtc33c3g3gg3agcsgsgttcgtggssgtgssttttgstsgcgssgsgsttgsttggccgcttscscatggtcastttttctacttagagssagtgt3tcaasctgctsaaiatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgtgc33gg3ccgscascatttctsccstccstgttgattggtctgc3tc3tcgcstctgtgcagttasgc33tcsgstcttccttcsggtggtc3sctttccgsctctgagsascttctgcsggsgtggsC3gs6icg3c3cgg3tst3t3scgstgacctct33tssttgttsstcstgtttagtaatt3tcstggctgtC3tggcgcatg3cgsaagg3gsctcccsgcgcgsssttccs33agcg3g3333cagtstgcgtacggsgc2929a-l,4-glucan-glucanhyd]:olase)tttgaatggt3C3tgCCCS3tgacggccaa60tatttggctgtactgccgtc120caagcggatgtgggctacggtgcttacgac180ggg3cggttc240csttcccgcgttscggggst300gcgsccgssgstgtasccgcggttgaagtc360ggsttttctsttattgcsatgtggaattgg420gggccsgtttgttgsagatt480sggstgcttsggssgscgsgttatt33t3g540600660gggaitg3tgttsaggctatt720gstgggccct3ttcggatsttgsgstgstg780agccatgastggac33ccggtg3gtgg33g840ctactsgstt3tgC3tCtC3ggtggsstcs900tct3ttttgccgstttatgattcsggtggs960tcggtagaagCCC333Cgttccscg3tgcg1020gaatatgcaggc貼3tggcgtaststtcgt1080ttgsctgtacaggt3gcaatggcsggtgcc1140t3t3cgscgsgcgcttcggtCtt33Ctg331200tatgsccstctgtgcc3gttcgtsstgtct1260gastcgct3gagaatttctgg33tgggstt1320gtggstgtgt3CC3ttttg31380tggttscgtstttsttaacttctcctsgts1440taacgg33t3貼gggtgtgcggtsccscgg1500tgccttgsss33ccgstctt1560acagcstgattstttcgacc3CC3tg3C3t1620tgtcggctgg3ca3ggg3aggcgscsgctcaac3gacgg3cccggtggggcsaagcgaatatggcatgacattaccggaaaccgttcggaagagtttcacgtaaacggcgggtcggtttcggttgcsaattcaggtttggcggcattaat1680gt3tgtcggccggcaaaacgccggtgagac1740gccggttgtcatcaattcggsaggctgggg1800sstttatgttC33sgs184權(quán)利要求1、一種高溫耐酸性α-淀粉酶的突變株，其特征在于是將出發(fā)菌株地衣芽孢桿菌耐高溫α-淀粉酶基因經(jīng)體外Leu134→Arg和Ser320→Ala突變后所獲得的高溫耐酸性α-淀粉酶基因取代原始耐高溫α-淀粉酶基因后得到的突變株。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的高溫耐酸性a-淀粉酶的突變株，其特征在于所述的出發(fā)菌株地衣芽孢桿菌在中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心CICC保藏,保藏號10181。3、一種如權(quán)利要求l所述的高溫耐酸性a-淀粉酶的突變株的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建方法包括如下步驟(1).構(gòu)建打靶載體pUC-湖y^-afly^"KnT:以地衣芽孢桿菌基因組DNA為模板，各設(shè)計兩對特異的PCR引物，擴(kuò)增耐高溫a-淀粉酶的上游、下游同源性核苷酸片段，得到兩個同源性核苷酸片段，將上游片段、卡那霉素抗性基因、下游片段定向連接入載體中，構(gòu)建得到打耙載體pUC-an/7-affly步KnT;(2).構(gòu)建打靶載體pUC-a/nyty:以含髙溫耐酸性a-淀粉酶基因的重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計特異的PCR引物，擴(kuò)增髙溫耐酸性(i-淀粉酶基因，將該片段連入載體中，構(gòu)建得到打靶載體pUC-a/zy^/;(3).獲得地衣芽孢桿菌耐高溫a-淀粉酶基因缺失株利用打靶載體pUC-a/zy^-afly^"KnT轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌原始出發(fā)菌株，同源重組其宿主細(xì)胞基因組DNA，卡那抗性基因取代基因組DNA中部分耐高溫a-淀粉酶基因，獲得地衣芽孢桿菌耐高溫a-淀粉酶基因缺失株；(4).獲得高溫耐酸性a-淀粉酶基因突變株利用打靶載體pUC-a^^轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌耐高溫a-淀粉酶基因缺失株，同源重組其宿主細(xì)胞基因組DNA，高溫耐酸性a-淀粉酶基因帶有兩個突變位點的部分基因取代缺失株基因組中卡那抗性基因，獲得地衣芽孢桿菌高溫耐酸性a-淀粉酶基因突變株。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的高溫耐酸性a-淀粉酶的突變株的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(l)的耐高溫a-淀粉酶的上游、下游同源性核苷酸片段分別為372bp和350bp。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的高溫耐酸性a-淀粉酶的突變株的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(l)、(2)中連接基因片段的載體為pUC19;所述步驟(3)、(4)中卡那抗性基因來自于枯草芽孢桿菌pWB980質(zhì)粒，大小為1112bp;所述步驟(2)中含高溫耐酸性a-淀粉酶基因的重組質(zhì)粒為pBEC。6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的高溫耐酸性a-淀粉酶的突變株的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(3)的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞為地衣芽孢桿菌細(xì)胞;所述步驟(4)的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞為地衣芽孢桿菌耐高溫a-淀粉酶基因缺失株細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及一種高溫耐酸性α-淀粉酶的突變株及其構(gòu)建方法，是將地衣芽孢桿菌耐高溫α-淀粉酶基因經(jīng)突變后(Leu134→Arg和Ser320→Ala)獲得的高溫耐酸性α-淀粉酶基因，通過構(gòu)建打靶載體，利用同源重組的方法，將其整合到出發(fā)菌株地衣芽孢桿菌的基因組DNA中，得到了地衣芽孢桿菌突變株，實現(xiàn)高溫耐酸性α-淀粉酶的同源高效表達(dá)。本發(fā)明中的突變株所產(chǎn)α-淀粉酶在本身耐高溫的基礎(chǔ)上，酸穩(wěn)定性也有了明顯地提高，為我國酒精、淀粉糖化等淀粉深加工行業(yè)提供了更好的工藝條件，降低了成本，節(jié)省了能源和工業(yè)用糧，滿足了一些在酸性條件下進(jìn)行淀粉原料液化工藝的要求。文檔編號C12N15/56GK101298604SQ20081005362公開日2008年11月5日申請日期2008年6月25日優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日發(fā)明者劉逸寒,玉李,杜連祥,王建玲,王春霞,路福平申請人:天津科技大學(xué)