專利名稱：一株非谷氨酸依賴型γ-聚谷氨酸合成菌及其發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物法制備高分子聚合物材料y-聚谷氨酸的生產(chǎn)，具體地涉及一 株非谷氨酸依賴型產(chǎn)y-聚谷氨酸的菌株及其培養(yǎng)與發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
1937年Ivanovics等發(fā)現(xiàn)炭疽芽孢桿菌中含有y.聚谷氨酸[Poly( glutamic acid)， ，PGA)，它是由單個谷氨酸分子在y-羥基和a-氨基形成的酰胺鍵而連接 成的多聚體，為水溶性的酰胺化合物，Y-PGA相對分子量范圍一般在10-1,000 萬之間。它的結(jié)構(gòu)式如圖所示
聚谷氨酸含有大量的羧基，為弱陰離子型聚合大分子，且單體中含有手性碳 原子。？PGA及其衍生物具有極佳的成膜性，成纖維性，阻氧性，可塑性，粘結(jié) 性，保濕性和可生物降解等獨特的理化和生物學(xué)特性。由于聚谷氨酸獨特的性質(zhì)， 它被廣泛運用于各種領(lǐng)域，包括食品工業(yè)、保濕劑、藥物載體、生物絮凝劑、生 物粘合劑等。因此，目前聚谷氨酸及其工業(yè)化生產(chǎn)的研究得到了眾多研究者的關(guān) 注。
根據(jù)培養(yǎng)基中是否需要谷氨酸的情況，可將y-PGA產(chǎn)生菌分為兩類， 一類 為需要谷氨酸來產(chǎn)生y-PGA ( I型)，而另一類培養(yǎng)基中不需要加入谷氨酸(II 型)。前者包括許多微生物，如5. ATCC9945，及仰雄^ IF03335， A
sw6rifc F-2-01和A 等這類菌通常生成較多量的？PGA，這類
生產(chǎn)菌不僅廣泛使用在？PGA的生產(chǎn)方面，而且在闡明整個芽孢桿菌的？PGA 合成機制方面都起到了很重要的作用。后一類包括A仰^/fo TAM-4， A"cfem/om^A35，由于培養(yǎng)基中無需加入要提供谷氨酸，可顯著降低生產(chǎn)成本， 但相對于谷氨酸依賴型生產(chǎn)菌來而言，它們種類較少，且在培養(yǎng)基中積累的 Y-PGA量不如谷氨酸依賴型生產(chǎn)菌高，所以目前對它們的了解還不是很多。

發(fā)明內(nèi)容
一. 要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一株非谷氨酸依賴型Y-PGA合成菌，本發(fā)明的又一 目的 是提供該菌株的培養(yǎng)及發(fā)酵方法。
二. 技術(shù)方案
本發(fā)明從食品中篩選獲得一株非谷氨酸依賴型Y-PGA合成菌，解淀粉芽孢 桿菌(Sa"7/twam;;/^々we/aa'eraNK-LL3)，該菌株已于2008年7月14日被保藏 于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No: M 208109.
該菌株通過16S rDNA PCR擴增獲取1431bp的基因片斷，將擴增產(chǎn)物送商 業(yè)公司測序，登錄GenBank注冊測序結(jié)果，獲得注冊序列號EU755383。
解淀粉芽孢桿菌(Sac/〃ws awy/o/^we/adew NK-LL3)的形態(tài)學(xué)特征為 菌體形態(tài)為桿狀，數(shù)個菌體可連成鏈狀，在細(xì)胞生長后期產(chǎn)生芽孢。 菌落特征為菌落濕潤、圓形、不透明，表面光滑，挑起時有粘稠感，長時間 培養(yǎng)會有倒掛現(xiàn)象(倒置培養(yǎng)時由于菌落粘度過大，出現(xiàn)了菌落分泌物滴于下 方的現(xiàn)象)；
解淀粉芽孢桿菌(5ad//^aw>^//，e/ac/emNK-LL3)的培養(yǎng)特征為 好氧，有氧條件下才能生長。適宜生長溫度為28 - 37°C，適宜pH為6.5 -7.2， 在發(fā)酵培養(yǎng)基中遲緩期較短，兩小時后即可進(jìn)入對數(shù)生長期，5小時后進(jìn)入對數(shù) 生長期的后期，在17小時左右得到最大的菌體量。
解淀粉芽孢桿菌(萬ad〃i^w^/o/^we/aderaNK-LL3)的分離方法為 用滅過菌的小鏟采用無菌操作將發(fā)酵食品接入無菌生理水中，-4°(:條件下， 在磁力攪拌器上攪拌30分鐘，然后轉(zhuǎn)入10(TC處理15分鐘。再進(jìn)行梯度稀釋， 選擇合適梯度的菌懸液涂布在篩選平板上，挑取表面變粘的菌落若干株傳代并純 化，通過發(fā)酵小試最終獲得了本發(fā)明所述的，PGA合成菌…-解淀粉芽孢桿菌 (5aa7/w aw_y/o//^e/adms NK-LL3)。純化后得到的菌株保藏于-7(TC的甘油管中。
解淀粉芽孢桿菌(5a 7/^tw^/o/Z，e/ademNK-LL3)的培養(yǎng)方法為
1. 菌種的活化接種解淀粉芽孢桿菌(5flc///^aw_y/o/^we々deraNK-LL3)至培 養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基，在37"C下培養(yǎng)24小時；
2. 種子培養(yǎng)在500ml滅菌的三角瓶內(nèi)裝100ml液體種子培養(yǎng)基，然后將活化 的菌種接至種子培養(yǎng)基中，37°C，以180-220rpm振蕩培養(yǎng)24小時，制得種子 液；
3. 發(fā)酵培養(yǎng)以體積比1.0-5.0%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C， 180 - 220rpm振蕩培養(yǎng)48-72小時。
其中所用到的培養(yǎng)基組成分別為
(1) 培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基蛋白胨8.0-12.0g/L，酵母粉3.0-8.0g/L， NaCl 9.0-11.0g/L，瓊脂15.0-25.0g/L， pH 6.5-7.2;
(2) 液體種子培養(yǎng)基葡萄糖20.0g/L， K2HP04 10.0 -15.0 g/L， KH2P04 5.0 -8.0 g/L， MgSO40.1-0.4g/L， (NH4)2S04 2.0 — 6.0 g/L，微量元素溶液(以FeS04*4H20， CaCl2*2H20， MnS(V4H20和ZnCl2配制水溶液，使各成分濃度均為1.0 mM) 1.0-3.0 mL pH 6.5-7.2;
(3) 發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20.0 - 50.0 g/L， K2HP04 12.0 g/L， KH2P04 6.0 g/L， MgSO40.3g/L， (NH4)2SO44.0g/L,微量元素(以FeS04'4H20， CaCl2*2H20， MnS04'4H20和ZnCl2配制水溶液，使各成分濃度均為1.0 mM) 1.0 -3.0 mL， pH 6.5 - 7.2。
三.有益效果
本發(fā)明提供的Y-PGA合成菌株解淀粉芽孢桿菌(&c/〃m NK-LL3)是從一種發(fā)酵食品中分離得到的。該菌株發(fā)酵合成Y-PGA的過程中培 養(yǎng)基中無需添加L-谷氨酸，可以直接從糖質(zhì)原料出發(fā)合成y-PGA。這與以往采 用的需要谷氨酸作為原料的微生物發(fā)酵相比，有效地降低了生產(chǎn)成本，具有工業(yè) 化應(yīng)用前景。
本發(fā)明所述的非谷氨酸依賴型，PGA合成菌解淀粉芽孢桿菌(&"7/m awy/o/zXac/em'NK-LL3)已于2008年7月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，保藏編號為CCTCC No: M 208109.
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
非谷氨酸依賴型，PGA合成菌的分離篩選
用滅過菌的小鏟采用無菌操作將發(fā)酵食品接入裝有100ml無菌生理鹽水的 250ml三角瓶中，-4。c條件下，在磁力攪拌器上攪拌30分鐘，制成菌懸液，IO(tc 處理15分鐘。再進(jìn)行梯度稀釋，制成稀釋了 101—109不同梯度的菌懸液。選擇 稀釋了 103、 105、 107、 109倍的菌懸液涂布于不含谷氨酸的篩選平板上，進(jìn)行培 養(yǎng)，挑取菌落表面變粘的菌落若干株在培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)并純化，獲 得純化的單菌落。通過發(fā)酵小試最終獲得了本發(fā)明所述的y-PGA合成菌—--解淀 粉芽孢桿菌(5ad//w a ^/o//，e/aderaNK-LL3)。將獲得的單菌落培養(yǎng)在液體種 子培養(yǎng)基中，以15%的濃度保存在甘油管中，-7(rc保存。
本發(fā)明依此方法篩選獲得一株非谷氨酸依賴型y-PGA合成菌-…-解淀粉芽 孢桿菌(5鎖7/w5'應(yīng)盧/一咖c/em NK-LL3)。
實施例2
解淀粉芽孢桿菌(Sa"7/ws amy/o/fgwe/ac/em NK-LL3 )的培養(yǎng)及，PGA檢測
(1) 菌種活化將-7(TC保存的解淀粉芽孢桿菌(3ad〃M aw_y/o/^we/"c/era NK-LL3)用接種環(huán)接種至活化培養(yǎng)皿固體平板上，活化培養(yǎng)基成分為蛋白胨 8.0-12.0g/L，酵母粉3.0-8.0g/L， NaCl 9.0-11.0g/L，瓊脂15.0-25.0g/L， pH 6.5 -7.2; 將培養(yǎng)皿固體平板倒置于37'c下培養(yǎng)24小時；
(2) 種子培養(yǎng)將活化好的解淀粉芽孢桿菌。fld〃ws NK-LL3) 一環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中(500ml三角瓶中含有100ml種子培養(yǎng)液)。種子培養(yǎng) 液成分為葡萄糖20.0g/L， K2HP04 10.0-15.0 g/L， KH2P04 5.0-8.0 g/L， MgS04 0.1-0.4g/L， (NH4)2S04 2.0 — 6.0 g/L，微量元素溶液(以FeS04'4H20， CaCl2*2H20， MnS04*4H20和ZnCl2配制水溶液，使各成分濃度均為1.0 mM) 1.0 -3.0 mLpH 6.5 -7.2，將接種好的種子培養(yǎng)液置于37'c恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，180-220rpm振蕩培 養(yǎng)24小時，制得種子液；
(3) 發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液取1.0-5.0 ml接入發(fā)酵培養(yǎng)集中(500ml 三角瓶中含有100ml發(fā)酵培養(yǎng)液)，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖20.0-50.0 g/L，K2HP04 12.0 g/L， KH2P04 6.0 g/L， MgS04 0.3g/L， (NH4)2S04 4.0 g/L，微量元素(以FeS04*4H20， CaCl2*2H20， MnS04*4H20和ZnCl2配制水溶液，使各成分濃度均為1.0mM) 1.0-3.0mL， pH6.6-7.2。將接種好的發(fā)酵培養(yǎng)基置于37°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中180-220rpm振蕩培養(yǎng)48小時。
(4) PGA產(chǎn)量的測定將發(fā)酵液6000rpm離心10分鐘收集上清，以四倍體
積乙醇沉淀上清液，離心獲取沉淀，將沉淀物溶于去離子水再次加入四倍體積乙醇，離心獲取沉淀，所得沉淀溶解后在去離子水中透析(截留范圍8000 -15000)12小時，每2小時換一次去離子水，最后冷凍干燥并稱重。
(5) 檢測及結(jié)果
采用FT-IR、 'HNMR、氣-質(zhì)聯(lián)用等，對采用上述培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)方法發(fā)酵生產(chǎn)y-PGA的水解物進(jìn)行檢測，確認(rèn)其為y-PGA。
權(quán)利要求
1一株產(chǎn)γ-聚谷氨酸的菌株----解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens NK-LL3)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述菌株的培養(yǎng)方法為(1) 菌種的活化接種解淀粉芽孢桿菌(Sad〃wtw^/o/zXac/em'NK-LL3)至培養(yǎng)皿固體 培養(yǎng)基，在37'C下培養(yǎng)24小時；(2) 種子培養(yǎng)在500ml滅菌的三角瓶內(nèi)裝100ml液體種子培養(yǎng)基，然后將活化的菌種接 至種子培養(yǎng)基中，37°C，以180-220rpm振蕩培養(yǎng)24小時，制得種子液；(3) 發(fā)酵培養(yǎng)基以體積比1.0-5.0%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C， 180: 220rpm振蕩培養(yǎng)48 - 72小時。
3.根據(jù)權(quán)利2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所用到的培養(yǎng)基組成為(1) 培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基蛋白胨8.0-12.0g/L，酵母粉3.0-8.0g/L， NaCl 9.0-11.0g/L，瓊脂 15.0濕25.0g/L， pH6.5 -7.2;(2) 液體種子培養(yǎng)基葡萄糖20.0g/L， K2HP04 10.0-15.0 g/L， KH2P04 5.0 -8.0 g/L， MgS04 0.1-0.4g/L， (NH4)2S04 2.0 - 6.0 g/L，微量元素溶液(以FeS04'4H20， CaCl2*2H20， MnS04'4H20 和ZnCl2配制水溶液，使各成分濃度均為1.0 mM) 1.0 -3.0 mLpH 6.5 -7.2;(3) 發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20.0 — 50.0 g/L， K2HP04 12.0 g/L， KH2P04 6.0 g/L， MgSO40.3g/L， (NH4)2SO44.0g/L，微量元素(以FeS04'4H20， CaCl2'2H20， MnS04'4H20和ZnCI2配制水 溶液，使各成分濃度均為l.OmM) 1.0-3.0mL， pH 6.5-7.2。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株非谷氨酸依賴型γ-聚谷氨酸合成菌--解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens NK-LL3)，本發(fā)明還提供了該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)方法以及適用的培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的γ-聚谷氨酸的菌株營養(yǎng)要求簡單，傳代穩(wěn)定，而且培養(yǎng)方法簡單易行。以Bacillus amyloliquefaciens NK-LL3作為發(fā)酵菌株，利用糖質(zhì)原料進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，在發(fā)酵原料中無需添加L-谷氨酸，這與以往通常采用的需要谷氨酸作原料的微生物發(fā)酵相比，有效降低了生產(chǎn)成本，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
文檔編號C12P13/00GK101508962SQ200810053900
公開日2009年8月19日 申請日期2008年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月21日
發(fā)明者森 代, 娜 劉, 莉 劉, 宋存江, 曹名鋒, 王淑芳, 耿偉濤, 丹 胡 申請人:南開大學(xué)