專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種水溶性高聚物生物降解率的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用微生物降解水溶性高聚物的
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是一種水溶性高聚物生物降解率的測(cè)定方法。(二)
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，高聚物的降解是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，已經(jīng)開(kāi)展將微生物應(yīng)用于水溶性高聚物的生物降解研究，通過(guò)微生物對(duì)水溶性高聚物的吸收利用，使高聚物對(duì)環(huán)境的危害降低到最小程度。目前利用微生物對(duì)水溶性高聚物的生物降解性測(cè)定評(píng)價(jià)方法較多，包括檢測(cè)降解過(guò)程中所產(chǎn)生的C02，以其為度量指標(biāo)，來(lái)評(píng)價(jià)生物降解能力，如STURM法；以BOD/COD為度量指標(biāo)，測(cè)試生物降解過(guò)程中02的消耗量，如MITI法等。對(duì)于水溶性聚合物的生物降解而言，由于上述方法均采用間接方法測(cè)定，方法不嚴(yán)密，因此準(zhǔn)確性低、誤差較大，特別是用不同的方法對(duì)同一樣品進(jìn)行測(cè)試所得出的結(jié)論有時(shí)相差很大。(三)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)上述存在的問(wèn)題，提供一種科學(xué)合理、簡(jiǎn)單實(shí)用、準(zhǔn)確性高且具有良好重復(fù)性和穩(wěn)定性的水溶性高聚物生物降解率的測(cè)定方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一種水溶性高聚物生物降解率的測(cè)定方法，其特征在于采用三組瓶液體培養(yǎng)法完成高聚物的生物降解過(guò)程，然后分別檢測(cè)并計(jì)算總有機(jī)碳的含量，根據(jù)培養(yǎng)前后總有機(jī)碳的變化值計(jì)算確定其降解率，具體方法如下(l)三組瓶液體培養(yǎng)法及總有機(jī)碳的檢測(cè)在三組瓶液體培養(yǎng)法中，所用水的純度最低為雙蒸水且可溶性有機(jī)碳少于lmg/L;所用試劑的純度最低為分析純；檢測(cè)用玻璃容器均用洗液洗滌干凈并確保容器壁內(nèi)不含有含碳化合物；微生物菌種來(lái)源于從污水處理廠(chǎng)生化池取得且經(jīng)過(guò)濾去除雜質(zhì)的新鮮活性污泥濾液，接種菌液的活菌濃度為1.0xl0Ll.0xl()SCFU/mL;無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液是由以下組分構(gòu)成的水溶液，各組分的含量按g/1000mL水溶液計(jì)分別為KH2PO40.34、Na2HP040.15、(NH4)2SO40.40、MgSO4'7H2O0.07、FeCl3'6H200.0025、酵母粉0.001，余量為水，培養(yǎng)基的pH值為7.27.6，以水溶性高聚物作為微生物生長(zhǎng)的碳源；l)樣品瓶液體培養(yǎng)取900mL上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液，加入總有機(jī)碳量為50mg的水溶性高聚物，滅菌后接種上述微生物菌種即活性污泥濾液50mL，再用上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液定容至lOOOmL，培養(yǎng)溫度為30°C±rC,于170200r/min條件下避光振蕩培養(yǎng)28天，培養(yǎng)結(jié)束后取樣品lO.OmL進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，破碎時(shí)間為2.0min，然后檢測(cè)其總碳和無(wú)機(jī)碳的含量，由于總有機(jī)碳的含量等于總碳的含量減去無(wú)機(jī)碳的含量，即可獲3得總有機(jī)碳的含量，用^養(yǎng)表示；2)毒性瓶液體培養(yǎng)取900mL上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液，加入總有機(jī)碳量為50mg的水溶性高聚物，滅菌后加入0.03MHgCl2溶液10.0mL，以抑制溶液中雜菌的生長(zhǎng)，再用上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液定容至1000mL，培養(yǎng)溫度為30°C±rC，于170~200r/min條件下避光振蕩培養(yǎng)28天，培養(yǎng)結(jié)束后取樣品lO.OmL進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，破碎時(shí)間為2.0min，然后檢測(cè)其總碳和無(wú)機(jī)碳的含量，由于總有機(jī)碳的含量等于總碳的含量減去無(wú)機(jī)碳的含量，即可獲得總有機(jī)碳的含量，用r毒性表示；3)中性瓶樣品配制取900mL上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液，滅菌后接種上述微生物菌種即活性污泥濾液50mL，再用上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液定容至1000mL，然后立即取樣品lO.OmL進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，破碎時(shí)間為2.0min，然后檢測(cè)其總碳和無(wú)機(jī)碳的含量，由于總有機(jī)碳的含量等于總碳的含量減去無(wú)機(jī)碳的含量，即可獲得總有機(jī)碳的含量，對(duì)上述三組瓶液體樣品進(jìn)行的超聲波細(xì)胞破碎操作必須同時(shí)進(jìn)行，相應(yīng)的取樣和檢測(cè)操作亦分別同時(shí)迸行；(2)通過(guò)計(jì)算確定降解率降解率計(jì)算公式『=%性—(％養(yǎng)—性)><100%。'%性本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是在水溶性高聚物的生物可降解測(cè)試中首次采用三組瓶測(cè)定方法，該方法科學(xué)合理、簡(jiǎn)單實(shí)用；在降解方案及過(guò)程中，毒性瓶?jī)H接入高聚物而不接入菌液，培養(yǎng)瓶則接入了高聚物和菌液，中性瓶的作用是扣除因加入菌液所致的總有機(jī)碳值的增加，從而減少了實(shí)驗(yàn)誤差，使得本方法邏輯性更加嚴(yán)密；由于采用直接測(cè)定溶液中的有機(jī)物的方法，提高了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性；在檢測(cè)各處理液的總碳和無(wú)機(jī)碳的含量前，采用超聲波細(xì)胞破碎法是基于最終生物降解理論進(jìn)行的，此處理方法可以將高聚物不完全降解轉(zhuǎn)化成的中間代謝產(chǎn)物保留在處理液中，測(cè)定的降解率僅涉及完全轉(zhuǎn)化為C02和H20的部分高聚物，因此本測(cè)定方法更為科學(xué)、嚴(yán)密。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:聚天冬氨酸的生物降解率的測(cè)定，聚天冬氨酸樣品的分子量約為2300。(1)三組瓶液體培養(yǎng)法及總有機(jī)碳的檢測(cè)在三組瓶液體培養(yǎng)法中，所用水的純度最低為雙蒸水且可溶性有機(jī)碳少于lmg/L;所用試劑的純度最低為分析純；檢測(cè)用玻璃容器均用洗液洗滌干凈并確保容器壁內(nèi)不含有含碳化合物；微生物菌種來(lái)源于從某污水處理廠(chǎng)生化池取得且經(jīng)過(guò)濾去除雜質(zhì)的新鮮活性污泥濾液，其優(yōu)勢(shì)菌為動(dòng)膠菌屬(Zoog/oea)、叢毛單胞菌屬(Comam朋"勻，假單胞菌屬(尸,w2^fomoH",力和微球菌屬(M,croacc船)等，接種菌液的活菌濃度為1.0xl04~1.0x]05CFUmL;無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液是由以下組分構(gòu)成的水溶液，各組分的含量按g/1000ml水溶液計(jì)分別為KH2PO40.34、Na2HPO40.15、(NH4)2SO40,40、MgS04.7H200.07、FeCl3.6H200.0025、酵母粉0.001，余量為水，培養(yǎng)基的pH值為7.2~7.6，以聚天冬氨酸作為微生物生長(zhǎng)的碳源；1)樣品瓶液體培養(yǎng)取900mL上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液，加入聚天冬氨酸119.0mg(相當(dāng)于5.17xl(^rnol)，折算為總有機(jī)碳的量為50mg，滅菌后接種上述微生物菌種50mL，再用上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液定容至lOOOmL，培養(yǎng)溫度為3(TC，于180r/min條件下避光振蕩培養(yǎng)28天，培養(yǎng)結(jié)束后取樣品lO.OmL進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，破碎時(shí)間為2.0min，然后檢測(cè)其總碳和無(wú)機(jī)碳的含量，由于總有機(jī)碳的含量等于總碳的含量減去無(wú)機(jī)碳的含量，即可獲得總有機(jī)碳的含量，用r培養(yǎng)表示；2)毒性瓶液體培養(yǎng)取900mL上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液，加入總有機(jī)碳量為50mg的水溶性高聚物，滅菌后加入0.03MHgCl2溶液10.0mL，以抑制溶液中雜菌的生長(zhǎng)，再用上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液定容至1000mL，培養(yǎng)溫度為3(TC，于180r/min條件下避光振蕩培養(yǎng)28天，培養(yǎng)結(jié)束后取樣品lO.OmL進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，破碎時(shí)間為2.0mm，然后檢測(cè)其總碳和無(wú)機(jī)碳的含量，由于總有機(jī)碳的含量等于總碳的含量減去無(wú)機(jī)碳的含量，即可獲得總有機(jī)碳的含量，用〃ft性表示；3)中性瓶樣品配制取900mL上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液，滅菌后接種上述微生物菌種50mL，再用上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液定容至1000mL，然后立即取樣品10.0mL進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，破碎時(shí)間為2.0min，然后檢測(cè)其總碳和無(wú)機(jī)碳的含量，由于總有機(jī)碳的含量等于總碳的含量減去無(wú)機(jī)碳的含量，即可獲得總有機(jī)碳的含量，用r巾性表示；對(duì)上述三組瓶液體樣品進(jìn)行的超聲波細(xì)胞破碎操作必須同時(shí)進(jìn)行，相應(yīng)的取樣和檢測(cè)操作亦分別同時(shí)進(jìn)行；(2)通過(guò)計(jì)算確定降解率降解率計(jì)算公式『=%性—"養(yǎng)—Vft)xlOO%。%性三組瓶檢測(cè)結(jié)果及通過(guò)計(jì)算確定的降解率如下表所示樣品瓶中性瓶毒性瓶降解率％21.565.3149.5367.1922.015.1349.2765.7422.315.2749.6265.66注表中三組瓶數(shù)據(jù)為降解后各瓶中總有機(jī)碳的含量，以mg/1000mL計(jì)。表中顯示該微生物對(duì)聚天冬氨酸的降解能力最大為67.19%,平行測(cè)定的最大誤差為1.53%，檢測(cè)數(shù)據(jù)具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性；按照OECD301提供的對(duì)水溶性物質(zhì)生物降解性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判斷，此高聚物屬于可生物降解有機(jī)物。實(shí)施例2:聚丙烯酸的生物降解率的測(cè)定，聚丙烯酸樣品的分子量約為2100。除了在樣品液體培養(yǎng)基配制中改為加入聚丙烯酸100.0mg(相當(dāng)于4.76xlO—Smo1)，折算為總有機(jī)碳的量為50mg外，其他如三組瓶液體培養(yǎng)法及總有機(jī)碳的檢測(cè)、通過(guò)計(jì)算確定降解率的方法和步驟與實(shí)施例1完全相同，三組瓶檢測(cè)結(jié)果及通過(guò)計(jì)算確定的降解率如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注表中三組瓶數(shù)據(jù)為降解后各瓶中總有機(jī)碳的含量，以mg/1000mL計(jì)。表中顯示該微生物對(duì)聚丙烯酸的降解能力最大為21.53%，平行測(cè)定的最大誤差為1.84%，檢測(cè)數(shù)據(jù)具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性；按照OECD301提供的對(duì)水溶性物質(zhì)生物降解性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判斷，此高聚物屬于可生物降解有機(jī)物。實(shí)施例3:聚天冬氨酸殼聚糖共聚物的生物降解率的測(cè)定，聚天冬氨酸與脫乙酰殼聚糖共聚生成聚合度為17%19%的聚天冬氨酸殼聚糖共聚物，分子量約為2500。除了在樣品液體培養(yǎng)基配制中改為加入共聚物108.7mg(相當(dāng)于4.3440—5mol)，折算為總有機(jī)碳的量為50mg外，其他如三組瓶液體培養(yǎng)法及總有機(jī)碳的檢測(cè)、通過(guò)計(jì)算確定降解率的方法和步驟與實(shí)施例1完全相同，三組瓶檢測(cè)結(jié)果及通過(guò)計(jì)算確定的降解率如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注表中三組瓶數(shù)據(jù)為降解后各瓶中總有機(jī)碳的含量，以mg/1000mL計(jì)。表中顯示該微生物對(duì)聚丙烯酸的降解能力最大為57.43%，平行測(cè)定的最大誤差為4.19%，檢測(cè)數(shù)據(jù)具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性；按照OECD30]提供的對(duì)水溶性物質(zhì)生物降解性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判斷，此高聚物屬于可生物降解有機(jī)物。權(quán)利要求1.一種水溶性高聚物生物降解率的測(cè)定方法，其特征在于采用三組瓶液體培養(yǎng)法完成高聚物的降解過(guò)程，然后分別檢測(cè)并計(jì)算總有機(jī)碳的含量，根據(jù)培養(yǎng)前后總有機(jī)碳的變化值計(jì)算確定其降解率，具體方法如下(1)三組瓶液體培養(yǎng)法及總有機(jī)碳的檢測(cè)在三組瓶液體培養(yǎng)法中，所用水的純度最低為雙蒸水且可溶性有機(jī)碳少于1mg/L；所用試劑的純度最低為分析純；檢測(cè)用玻璃容器均用洗液洗滌干凈并確保容器壁內(nèi)不含有含碳化合物；微生物菌種來(lái)源于從污水處理廠(chǎng)生化池取得且經(jīng)過(guò)濾去除雜質(zhì)的新鮮活性污泥濾液，接種菌液的活菌濃度為1.0×104～1.0×105CFU/mL；無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液是由以下組分構(gòu)成的水溶液，各組分的含量按g/1000mL水溶液計(jì)分別為KH2PO40.34、Na2HPO40.15、(NH4)2SO40.40、MgSO4·7H2O0.07、FeCl3·6H2O0.0025、酵母粉0.001，余量為水，培養(yǎng)基的pH值為7.2～7.6，以水溶性高聚物作為微生物生長(zhǎng)的碳源；1)樣品瓶液體培養(yǎng)取900mL上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液，加入總有機(jī)碳量為50mg的水溶性高聚物，滅菌后接種上述微生物菌種即活性污泥濾液50mL，再用上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液定容至1000mL，培養(yǎng)溫度為30℃±1℃，于170～200r/min條件下避光振蕩培養(yǎng)28天，培養(yǎng)結(jié)束后取樣品10.0mL進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，破碎時(shí)間為2.0min，然后檢測(cè)其總碳和無(wú)機(jī)碳的含量，由于總有機(jī)碳的含量等于總碳的含量減去無(wú)機(jī)碳的含量，即可獲得總有機(jī)碳的含量，用r培養(yǎng)表示；2)毒性瓶液體培養(yǎng)取900mL上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液，加入總有機(jī)碳量為50mg的水溶性高聚物，滅菌后加入0.03MHgCl2溶液10.0mL，以抑制溶液中雜菌的生長(zhǎng)，再用上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液定容至1000mL，培養(yǎng)溫度為30℃±1℃，于170～200r/min條件下避光振蕩培養(yǎng)28天，培養(yǎng)結(jié)束后取樣品10.0mL進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，破碎時(shí)間為2.0min，然后檢測(cè)其總碳和無(wú)機(jī)碳的含量，由于總有機(jī)碳的含量等于總碳的含量減去無(wú)機(jī)碳的含量，即可獲得總有機(jī)碳的含量，用r毒性表示；3)中性瓶樣品配制取900mL上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液，滅菌后接種上述微生物菌種即活性污泥濾液50mL，再用上述無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液定容至1000mL，然后立即取樣品10.0mL進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，破碎時(shí)間為2.0min，然后檢測(cè)其總碳和無(wú)機(jī)碳的含量，由于總有機(jī)碳的含量等于總碳的含量減去無(wú)機(jī)碳的含量，即可獲得總有機(jī)碳的含量，用r中性表示；對(duì)上述三組瓶液體樣品進(jìn)行的超聲波細(xì)胞破碎操作必須同時(shí)進(jìn)行，相應(yīng)的取樣和檢測(cè)操作亦分別同時(shí)進(jìn)行；(2)通過(guò)計(jì)算確定降解率降解率計(jì)算公式id="icf0001"file="A2008100539120002C1.tif"wi="58"he="12"top="254"left="65"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>全文摘要一種水溶性高聚物生物降解率的測(cè)定方法，采用三組瓶-培養(yǎng)瓶、中性瓶、毒性瓶-液體培養(yǎng)法，在特定條件下對(duì)培養(yǎng)瓶和毒性瓶的液體進(jìn)行28天培養(yǎng)，分別檢測(cè)并計(jì)算各樣液總有機(jī)碳的含量，根據(jù)培養(yǎng)前后總有機(jī)碳的變化值計(jì)算確定其降解率。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是該方法科學(xué)合理、簡(jiǎn)單實(shí)用；由于采用直接測(cè)定溶液中的有機(jī)物的方法，提高了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性；在檢測(cè)各處理液的總碳和無(wú)機(jī)碳的含量前，采用超聲波細(xì)胞破碎法是基于完全生物降解理論進(jìn)行的，此處理方法可以將高聚物不完全降解轉(zhuǎn)化成的中間代謝產(chǎn)物保留在處理液中，測(cè)定的降解率僅涉及完全轉(zhuǎn)化為CO<sub>2</sub>和H<sub>2</sub>O的部分高聚物，因此本測(cè)定方法更為科學(xué)、嚴(yán)密。文檔編號(hào)C12Q1/02GK101315359SQ20081005391公開(kāi)日2008年12月3日申請(qǐng)日期2008年7月22日優(yōu)先權(quán)日2008年7月22日發(fā)明者刁虎欣,吳新世,波孫,岳紅雨,慈師,菁王申請(qǐng)人:天津理工大學(xué)