專利名稱：一種篩選抗葉銹病小麥的方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選抗葉銹病小麥的方法及其專用引物。
技術(shù)背景小麥葉銹病是一種世界性病害，其分布范圍比條銹病和稈銹病更廣。小麥葉銹病菌適應(yīng) 不同的氣候條件，可在全世界不同的小麥種植區(qū)發(fā)生，若條件適宜可造成40%'甚至更大的產(chǎn) 量損失(KnotU989)。在我國(guó)，小麥葉銹病過去主要在西南及長(zhǎng)江流域的部分地區(qū)如貴州、江 西等省發(fā)生較重，近年來華北、西北及東北各地也日趨嚴(yán)重。在我國(guó)1969年、1973年、1975 年和1979年曾幾度大面積流行，造成嚴(yán)重減產(chǎn)。1998年，小麥葉銹病在全國(guó)較大范圍內(nèi)流 行，山東魯西南等地發(fā)病嚴(yán)重，后期病葉率達(dá)70—80%，嚴(yán)重的達(dá)100%，部分田塊減產(chǎn)20% 以上(國(guó)家災(zāi)害綜合研究組，http:〃210.72.100.6/aspx/grid.aspx Dl=708)。利用抗葉銹品種 是減輕葉銹病危害的最經(jīng)濟(jì)、有效、快捷的方法。目前已有60個(gè)抗葉銹病基因正式命名 (Mcintosh etal. 2007)，其中大多數(shù)具有生理專化性，這些抗病基因往往會(huì)由于病菌小種的變 異而很快"喪失"抗性。育種學(xué)家和植病學(xué)家希望通過利用多基因聚合、基因布局和多系品種 來延長(zhǎng)苗期抗病基因的抗性壽命。要實(shí)現(xiàn)多基因聚合、基因布局和多系品種，必須有豐富的 有效抗源，目前已知的有效抗病基因僅有丄W,i:W9,丄r24和丄r3S，因此尋找和發(fā)掘新的抗源 異常重要。分子標(biāo)記(包括RAPD、 RFLP、 SSR和RGAP)在小麥的基因作圖中得到了廣泛應(yīng)用， 近年來，利用分子標(biāo)記定位和標(biāo)記了多個(gè)小麥抗葉銹病基因。SSR標(biāo)記由于其多態(tài)性高、共 顯性、穩(wěn)定性好及染色體位置清楚適合基因定位和作圖而得到了廣泛應(yīng)用，緊密連鎖的SSR 標(biāo)記可用于標(biāo)記輔助選擇和聚合育種。'1984年育成的小麥品系周8425B是一個(gè)很好的抗病育種材料，目前抗我國(guó)大多數(shù)葉銹菌 生理小種。以周8425B為親本材料已育出三十多個(gè)推廣品種，種植面積達(dá)600萬公頃。我們 對(duì)周8425B進(jìn)行苗期基因推導(dǎo)發(fā)現(xiàn)其可能含有新的抗葉銹病基因，進(jìn)一步通過對(duì)周8425B和 中國(guó)春雜交產(chǎn)生的F,、 F2和F3群體進(jìn)行遺傳分析和分子標(biāo)記，將抗病基因定位于1BL染色 體上，找到與其緊密連鎖的SSR標(biāo)記，并用于標(biāo)記輔助育種。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可用于篩選抗葉銹病小麥的方法及篩選抗葉銹病 小麥的專用引物。本發(fā)明所提供的用于篩選抗葉銹病小麥的分子標(biāo)記分別是IgM;m5S2和^mrS,標(biāo)記 Zgwm5W由引物wms582擴(kuò)增獲得，該引物由序列表中其上游序列(20個(gè)堿基)和下游序列 (20個(gè)堿基)組成；標(biāo)記^^rS由引物barc8擴(kuò)增獲得，該引物由其上游序列(27個(gè)堿基) 和下游序列(28個(gè)堿基)組成(見表l)。表1用于檢測(cè)抗葉銹基因的兩引物上下游序列引物名稱上游序列下游序列wms5825' AAGCACTACGAMATATGAC 3'5' TCTTAAGGGGTGTTATCATA 3'barc85' GCGGGAATCATGCATAGGAAAACAGM 3'5' GCGGGGGCGAAACATACACATAAAAACA 3，本發(fā)明所提供的篩選抗葉銹病小麥的方法，是以待測(cè)小麥品種基因組DNA為模板，分 別用引物wms582和barc8進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否分別有139bp和180bp的條 帶。如擴(kuò)增產(chǎn)物中有139bp和180bp的條帶，則待測(cè)品種為抗葉銹病小麥品種。20nlPCR反應(yīng)體系為模板DNA60ng， Taq酶1U，上、下游引物(4nmol'U1)各1.2 ^L， dNTP (10mmol七—1) O.化L， 10xPCR緩沖液2 ^iL，用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20pL。 反應(yīng)程序是94'C預(yù)變性4min，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94"變性lmin， 5(TC退火lmin， 72°C 延伸lmin;最后72。C延伸10min, 4 。C保存。所述檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法可為對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后銀 染顯色。具體方法可為取20(iL擴(kuò)增產(chǎn)物，加入8nL變性載樣指示劑(98%無離子甲酰胺， 10mMEDTApH8.0， 0.25%溴酚藍(lán)和0.25%二甲苯氫氟)，94。C變性10min后，立即放入冰 水混合物中冷卻，每份變性的擴(kuò)增樣品取5pL在濃度為6%的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分 離，銀染顯色。檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有139bp和180bp大小的條帶。本發(fā)明提供了一個(gè)新的小麥抗葉銹病基因^Z//5^的SSR標(biāo)記Zgww5S2和^ZwrcS，連 鎖距離分別為3.9cM和5.2cM， 對(duì)我國(guó)目前流行的大多數(shù)小種表現(xiàn)抗病。利用與該抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記可以對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，從而實(shí)現(xiàn)多個(gè)有效抗病基因的累 加，延長(zhǎng)品種的抗病性。本發(fā)明的新抗病基因及其專用引物將在小麥抗病育種中發(fā)揮重要作 用。


下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一歩詳細(xì)說明。圖1為用微衛(wèi)星引物wms582對(duì)抗感親本、抗感池和F2群體單株的PCR擴(kuò)增結(jié)果； 圖2為用微衛(wèi)星引物barc8對(duì)抗感親本、抗感池和F2群體單株的PCR擴(kuò)增結(jié)果； 圖3為7個(gè)SSR標(biāo)記與該抗病基因的連鎖圖。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所有引物合成均由上海生工完成。 小麥材料周8425B由河南省周口市農(nóng)科院選育。 實(shí)施例1小麥抗葉銹病新基因的SSR標(biāo)記J^wm5W和J wcS的獲得及基因來源鑒定 一、小麥抗葉銹病新基因的SSR標(biāo)記JTgw附5S2和JKwrS的獲得用我國(guó)目前強(qiáng)毒力葉銹菌生理小種THTT對(duì)小麥材料周8425B和中國(guó)春(親本)的Fi、 F2和F3代群體進(jìn)行苗期抗病性鑒定，共鑒定F,群體16株，F(xiàn)2群體487株，136F3家系，周 8425B表現(xiàn)中抗，中國(guó)春表現(xiàn)感病，F(xiàn)i全部抗病，F(xiàn)2中有359株表現(xiàn)抗病，128株表現(xiàn)感病， 抗感分離符合3: 1 (x2=0.43， P>0.5) 。 136個(gè)F3家系中29個(gè)家系表現(xiàn)純合抗病，67個(gè)家系表現(xiàn)抗感分離，40個(gè)家系表現(xiàn)為感病。F3家系分離比例為純合抗抗感分離純合感=1:2: 1 (X2=1.81, P>0.25)，表明周8425B中含有一個(gè)顯性抗病基因，暫命名為ZrZi/W。從 F2代單株中選用20個(gè)抗病單株和20個(gè)感病單株分別組成抗病池和感病池。選用793個(gè)SSR弓I物，其中GWM (Gatersleben wheat microsatellite)系列引物240個(gè)，WMC (Wheat Microsatellite Consortium)系列引物543個(gè)，8個(gè)BARC系列引物，2個(gè)CFA系列引物， 所有引物序列源自美國(guó)農(nóng)業(yè)部網(wǎng)站http:〃wh.eat.pw.usda.gov/GG2/quickquery.shtml，以周 8425B、中國(guó)春、抗病池和感病池的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR檢領(lǐng)(J， 20pLPCR反應(yīng)體系 為模板DNA60ng， Taq酶1U，上、下游引物"pmol.L-1)各1.2pL， dNTP (10mmo1.1/1) 0.4nL， 10xPCR緩沖液2pL，用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20nL。 PCR反應(yīng)程序?yàn)橄?4。C 4min;然后94。C lmin， 50°C lmin， 72。C lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后72。C 10min， 4。C保存。然后按下述方法對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，取20pL擴(kuò) 增產(chǎn)物，加入8|aL變性載樣指示劑(98%無離子甲酰胺，10mMEDTApH8.0， 0.25%溴酚藍(lán) 和0.25%二甲苯氫氟)，94'C變性10min后，立即放入冰水混合物中冷卻，每份變性的擴(kuò)增 樣品取5pL在濃度為6X的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染顯色。結(jié)果位于染色體1BL 上的7個(gè)標(biāo)記WarcS、 ^&fifn^W、 Zww";P、 Xwwc269、 Z&an^W、 Xgw附5S2、 Zw附c6何在 親本和抗感池之間有多態(tài)性，初步表明這些標(biāo)記和抗葉銹病基因連鎖，其中用微衛(wèi)星標(biāo)記Z，ff75S2 (序列表中的序列1和序列2)和；^"rcS (序列表中的序列3和序列4)對(duì)抗感親 本、抗感池和F2群體單株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果如圖1和圖2所示(Pl為周8425B， P2為中國(guó)春，Br為抗病池，Bs為感病池，R為抗病單株，S為感病單株)，用標(biāo)記Zgwm5S2 檢測(cè)出現(xiàn)了3種電泳帶型，分別稱為帶型A、 B和H (雜合帶型)，周8425B、抗病池和抗 病單株可擴(kuò)增出139bp的DNA片段，見圖1中帶型A，P2、感病池和感病單株可擴(kuò)增出147bp 的DNA片段，見圖1中帶型B;用標(biāo)記義to"S檢測(cè)出現(xiàn)了3種電泳帶型，分別稱為帶型A、 B和H (雜合帶型)，周8425B、抗病池和抗病單株可擴(kuò)增出180bp的DNA片段，見圖2 中帶型A， P2、感病池和感病單株可擴(kuò)增出258bp的DNA片段，見圖2中帶型B。用染色體1BL上的7個(gè)標(biāo)記JHwcS、^ZwcW0、XwK"79、Xwmc269、^kwc7W、Zgwm5S2、 義wwc6似對(duì)F2群體487個(gè)單株分別進(jìn)行檢測(cè)(反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上)，用Mapmanager QTXb20進(jìn)行處理，繪制基因連鎖圖，如圖3所示，表明這7個(gè)標(biāo)記都與抗病基因連鎖，遺 傳距離從3.9 cM到12 cM。距抗病基因較近的兩個(gè)標(biāo)記X^Mw5S2和力ara5遺傳距離分別為 3.9禾Q 5.2cM。用兩個(gè)標(biāo)記和^ZwrcS對(duì)136個(gè)F3家系進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2所示，表明這兩 個(gè)標(biāo)記與抗病基因的遺傳距離分別為4.9cM和7.7cM。表2 136個(gè)F3家系的苗期鑒定結(jié)果及SSR標(biāo)記Zw附dS2-LB和乃a rS-^在各個(gè)F3 家系中帶型標(biāo)記F2基因型帶型AHBRR (29)2441Rr (67)611rr (40)0139RR (29)2171Rr (67)10561rr (40) 0040二、小麥抗葉銹病新基因的來源鑒定對(duì)周8425B的兩個(gè)親本周78A和安農(nóng)7959用THTT進(jìn)行苗期抗性鑒定，周78A對(duì)THTT 表現(xiàn)中抗與周8425B反應(yīng)型相同，安農(nóng)7959對(duì)THTT表現(xiàn)感病，與中國(guó)春反應(yīng)型相同，表 明新的抗葉銹病基因ZrZ7/W來源于周78A。據(jù)系譜周78A的親本有山前麥、練豐1號(hào)和廣 麥74，山前麥和練豐l號(hào)苗期用THTT接種分別表現(xiàn)中抗和感病，廣麥74由于沒有種子未得到鑒定。用標(biāo)記Zww"S2和ja^r8對(duì)周8425B、周78A、山前麥、安農(nóng)7959和中國(guó)春 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果周78A和山前麥的帶型與周8425B相同，安農(nóng)7959和中國(guó)春帶型相同，抗 病鑒定和標(biāo)記檢測(cè)的結(jié)果表明^"Zi詔4來源于山前麥。
權(quán)利要求
1. 用于篩選抗葉銹病小麥的引物，是由序列表中引物wms582和barc8的上下游核苷酸序列組成的引物對(duì)。
2、 一種篩選抗葉銹病小麥的方法，是以待測(cè)小麥基因組DNA為模板，分別在權(quán)利要求 1所述的由序列表中引物wms582和barc8的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否 有139bp和180bp大小的條帶。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選抗葉銹病小麥的方法，其特征在于20nlPCR反應(yīng)體系 為模板DNA60ng， Taq酶1U，上、下游引物(4pmol.L")各1.2 ^L， dNTP.(10 mmoH/1) 0.4pL， 10xPCR緩沖液2 ^L，用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20pL, PCR反應(yīng)程序?yàn)橄?4°C 4min;然后94。Clmin， 50°C lmin， 72°C lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C 10min。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的篩選抗葉銹病小麥的方法，其特征在于所述檢測(cè)擴(kuò)增 產(chǎn)物方法為對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后銀染顯色。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選抗葉銹病小麥的方法及其專用引物。用于篩選抗葉銹病小麥品種的特異性引物，是由序列表中引物wms582和barc8的上下游核苷酸序列組成的引物對(duì)。該篩選抗葉銹病小麥的方法，是以待測(cè)小麥基因組DNA為模板，分別在上述引物對(duì)的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有139bp和180bp大小的條帶。SSR標(biāo)記Xwms582和Xbarc8的連鎖距離分別為3.9cM和5.2cM，與上述SSR標(biāo)記緊密連鎖的抗葉銹病基因?qū)ξ覈?guó)目前流行的大多數(shù)小種表現(xiàn)抗病。利用該抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記可以對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，從而實(shí)現(xiàn)多個(gè)有效抗病基因的累加，延長(zhǎng)品種的抗病性。本發(fā)明的新抗病基因及其專用引物將在小麥抗病育種中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101260437SQ200810054810
公開日2008年9月10日 申請(qǐng)日期2008年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月21日
發(fā)明者劉大群, 孟慶芳, 汀 張, 張立榮, 李在峰, 楊文香, 王海燕, 趙曉麗, 閆紅飛 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)