專利名稱：水稻hap3及其基因在提高植物耐逆性能上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及來源于水 稻與耐逆性相關(guān)的HAP類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與其在提高植物耐逆性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)錄因子(Transcriptionfactor)是能夠與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特 異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白或能與這些蛋白相互作用的相關(guān)蛋白質(zhì)，并且能特異性地 激活或抑制轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子(Guilfoyle T J. 1997. The structure of plant gene promoters. Genet Engin, 19: 15 47)。細(xì)胞的分化，多細(xì)胞生物的形態(tài)發(fā)育，器官建成，以及對(duì)外界刺激(生 物和非生物逆境)的反應(yīng)都與轉(zhuǎn)錄因子的作用密切相關(guān)(Adam E, Szell M, Szekeres M, et al. 1994. The developmental and tissue-specific expression of tobacco phytochrome-A genes. Plant J, 6: 283 293. Baerson S R， Lamppa C K. 1993. Developmental regulation of an acyl carrier protein gene promoter in vegetative and reproductive tissues, Plant Mol Biol, 22: 255 267. Logemann E, Parniske M, Hahlbrock K. 1995. Modes of expression and common structural features of the complete phenylalanine ammonia-lyase gene family in parsley. Proc Natl Acad SciUSA,92: 5905 5909.)。在干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫的逆境條件下，植物能夠在分子、細(xì)胞和整體水平上 做出相應(yīng)的調(diào)整，以最大程度上減少環(huán)境所造成的傷害并得以生存。許多基因受脅迫誘導(dǎo) 表達(dá)(Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki，K. ， 1994. Molecular responses to drought and cold stress. Curr. Opin. Biotechnol 7, 161-167; Thomashow, M.F.， 1999. Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50, 571-599)，這些基因的產(chǎn)物不僅能夠直接參與植物的脅迫應(yīng)答，而且能夠調(diào)節(jié)其它相關(guān)基 因的表達(dá)或參與信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強(qiáng)對(duì)脅迫環(huán)境的抗性。轉(zhuǎn) 錄因子就是其中的一類。目前已知在植物中與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族主要有AP2/ EREBP、 bZIP、 WRKY、 MYC和MYB家族，其中大部分成員都參與調(diào)節(jié)植物對(duì)干旱、高 鹽和低溫等的逆境脅迫反應(yīng)。同類轉(zhuǎn)錄因子的功能大多是冗余的。HAP復(fù)合物(HAP complex)，也稱為核因子Y(nuclear factor Y， NF-Y或CCAAT結(jié) 合因子CCAAT-binding factor, CBF)，是結(jié)合CCAAT盒的轉(zhuǎn)錄因子。CCAAT盒是在動(dòng)物、真菌和植物中一些基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游存在的核心序列為CCAAT的順式元件，該元件可 呈正、反兩種方向(Van Huijsduijnen H, Bollekens J， Dom A (1987), Properties of a CCAAT box-binding protein. Nucleic Acids Res, 15: 7265 7283)。與這些基因上游的CCAAT元件 結(jié)合以調(diào)節(jié)其基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子是保守的HAP復(fù)合物，有功能的HAP復(fù)合物是一個(gè)異 源三聚體蛋白，由三個(gè)不同的亞基組成即HAP2 /NF-YA/ CBF-B， HAP3 /NF-YB/ CBF-A， HAP5/ CBF-C/ NF-YC (Miyoshi K, Ito Y, Serizawa A， Kurata N. OsHAP3 genes regulate chloroplast biogenesis in rice. The Plant Journal (2003) 36:532—540.)。在釀酒酵母中，HAP 復(fù)合物是由HAP2， HAP3， HAP4和HAP5亞基組成的異源四聚體，其中HAP2， HAP3 和HAP5這3個(gè)亞基與DNA結(jié)合有關(guān)(Xing Y, Fikes JD， Guarente L (1993). Mutations in yeast HAP2/HA; McNabb DS, Xing Y， Guarente L (1995). Cloning of yeast HAP5: a novel subunit of a heterotrimeric complex required for CCAAT binding. Genes & Dev, 9: 47 58)， 而HAP4亞基提供基因激活功能(Foraburg SL， Guarente L (1989). Identification and characterization of HAP4:A third component of the CCAAT-bound HAP2/HAP3 heteromer. Genes&Dev,3: 1166 1178)。哺乳動(dòng)物中的CCAAT結(jié)合因子CBF由CBF-A， CBF-B， CBF-C 3個(gè)亞基組成(Maity S N， Sinha S， Ruteshouser E C， et al.Three different polypeptides are necessary for DNA binding of the mammalian heteromeric CCAAT binding factor.J Biol Chem， 1992， 267(23): 16 574 16 580)。體外凝膠滯后的試驗(yàn)顯示CBF-A, CBF-B， CBF-C 可與釀酒酵母的HAP3， HAP2和HAP5進(jìn)行功能替換；各亞基的氨基酸組成分析表明CBF 的三個(gè)亞基分別與HAP3， HAP2, HAP5存在高度進(jìn)化保守的功能域(KimIS， Sinha S， Crombrugghe D B， et al.Determination of functional domains in the C subunit of the CCAAT-binding factor CBF delineate functional domains involved in the three-step assembly of the CBF-DNA complex.Mol Cell Biol， 1996， 16(8): 4 003 4 013;CoustryF， Maity SN， De-Crombrugghe B.Studies on transcription activation by the multimeric CCAAT-binding factor CBF.J Biol Chem， 1995， 270(1): 468 475; Maity S N， De-Crombrugghe B.Biochemical analysis of the B subunit of the heteromeric CCAAT-binding factor: A DNA-binding domain and a subunit interaction domain are specified by two separate segments.J Biol Chem， 1992， 267(12): 8 286 8 292)。哺乳動(dòng)物中的CBF在細(xì)胞周期和生長(zhǎng)、發(fā)育過程中行使重要功 能。對(duì)來自不同生物的HAP2類似蛋白氨基酸序列比較結(jié)果顯示，該類蛋白存在由約60 個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的結(jié)構(gòu)域(Li Z， Kalasapudi S R， Childs G.Isolation and characterization of cDNAs encoding the sea urchin (Strongylocentrotus purpuratus) homologueof the CC AAT binding protein NF-YA subunit.Nucleic Acids Research ， 1993 ， 21(19): 4639。 Albani D， Robert L.Cloning and characterization of a Brassica napus gene encoding a homologue of the B subunit of a heteromeric CCAAT-binding factor.Gene， 1995， 167: 209 213)。在動(dòng)物和酵母中，每個(gè)蛋白亞基分別由一個(gè)基因編碼。在植物中編碼HAP復(fù)合物 每個(gè)亞基的基因分別組成一個(gè)基因家族，例如擬南芥中有9個(gè)HAP2基因，10個(gè)HAP3 基因，10個(gè)HAP5基因(Edwards D, Murrey JAH, Smith AG. Multiple genes coding the conserved CCAAT-box transcription complex are expressed in Arabidopsis. Plant Physiology (1998) 117:1015—1022. Gusmaroli G, Tonelli C， Mantovani R. Regulation of the CCAAT-binding NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana. Gene (2001) 264:173-185. Gusmaroli G, Tonelli C， Mantovani R. Regulation of novel members of the Arabidopsis thaliana CCAAT-binding nuclear factor Y subunit. Gene (2002) 283:4148.)。在高等植物中，已分離鑒定了多個(gè)HAP基因，如擬南芥的LEC1、 LlL(LECl-LIKE)、 AtHAP3b，胡蘿卜的C-LEC1 ，玉米的ZmLECl 、 ZmNF-YB2，水稻的OsHAP3A、 OsHAP3B、 OsHAP3C、 OsNF-YBl等。多數(shù)已分離的HAP基因與植物的胚胎發(fā)育、葉綠體發(fā)育、開 花時(shí)間的調(diào)控相關(guān)。如擬南芥的LECl (LEAF COTYLEDONl， HAP3同源基因)是目前植 物中研究最為詳細(xì)的一個(gè)HAP基因，LEC1基因功能缺失的真葉狀子葉(leaf-cotyledon) 突變體其胚胎發(fā)育出現(xiàn)異常，導(dǎo)致其子葉的形態(tài)與真葉相同，而且該突變體也不能耐受干 燥(Meinke 1992， Meinke , D W, 1992. A Homeotic mutant of ^ra脇o/w7'51 ^w//awa with leafy cotyledons. Science, 258, 1647-1650; Meinke, D.W., Franzmann, L.H., Nickle, T.C., and Yeung, E.C. 1994. Leafy cotyledon mutants of Arabidopsis. Plant Cell 6:1049-1064)，而組成型過 表達(dá)LEC1基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥在葉中形成類似胚胎的結(jié)構(gòu)，胚胎特異基因在胚胎發(fā)育期 后的其它時(shí)期持續(xù)表達(dá)(Lotan， T.， Ohto, M.， Matsudaira Yee, K., West, M.A丄.，Lo, R.， Kwong， R.W.， Yamagishi， K.， Fischer, R丄.，Goldberg, R.B., and Harada, J.J. (1998). Arabidopsis LEAFY COTYLEDONl is sufficient to induce embryo development in vegetative cells. Cell 93, 1195-1205)。L1L基因也是胚胎發(fā)育過程中的一個(gè)關(guān)鍵基因，但L1L禾卩LEC1 的功能不同(Kwong R W, Bui A Q, Lee H， Kwong L W， Fisher R L, Goldberg R B, Harada J J. 2003. LEAFY COTYLEDONl-LIKE difmes a class of regulators essential forembryo development. The Plant Cell 15， 5-18)。 AtHAP3b基因通過提高開花關(guān)鍵基因(如FT、 SOC1) 的表達(dá)調(diào)節(jié)擬南芥在長(zhǎng)光照條件下的開花時(shí)間；而且AtHAP3b基因的表達(dá)受滲透脅迫的 誘導(dǎo)，在滲透脅迫條件下，AtHAP3b基因突變體的開花時(shí)間比野生型植株延遲(Cai X， Ballif J, Endo S, Davis E, Liang M， Chen D, DeWald D， Kreps J, Zhu T， Wu Y. 2007. A putativeCCAAT-binding transcription factor is a regulator of flowering timing in Arabidopsis.Plant Physiol. 145(1):98-105. Chen NZ, Zhang XQ, Wei PC, Chen QT, Ren F, Chen J, Wang XC. 2007 AtHAP3b Plays a Crucial Role in the Regulation of Flowering Time in Arabidopsis during Osmotic Stress. J Biochem Mol Biol. 40(6):1083-9.)。還有研究發(fā)現(xiàn)由AtNF-YA5、AtNF-YB9、 AtNF-YC9組成的AtHAP復(fù)合物參與擬南芥對(duì)藍(lán)光和ABA反應(yīng)的兩條不同的信號(hào)途徑(Warpeha KM, Upadhyay S， Yeh J, Adamiak J， Hawkins SI, Lapik YR, Anderson MB， Kaufman LS. 2007 The GCR1， GPA1, PRN1, NF-Y signal chain mediates both blue light and abscisic acid responses in Arabidopsis. Plant Physiol. 143(4): 1590-600)。胡蘿卜的C-LEC1可 與C-HAP2B、 C-HAP5A或C-HAP5B組成HAP復(fù)合物調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程中的基因表達(dá)(Yazawa K, Kamada H. 2007， Identification and characterization of carrot HAP factors that form a complex with the embryo-specific transcription factor C-LEC1. J Exp Bot.58(l3):3819-28.)。玉米的ZmLECl( Masiero S, Imbriano C, Ravasio F， Favaro R, Pelucchi N, Gorla MS, Mantovani R, Colombo L， Kater MM. 2002. Ternary complex formation between MADS-box transcription factors and the histone fold protein NF-YB. J Biol Chem. 277(29):26429-35.)和向日葵的HaLlL (Fambrini M, Durante C, Cionini G, Geri C, Giorgetti L, Michelotti V， Salvini M， Pugliesi C. ， 2006. Characterization of LEAFY COTYLEDON1-LIKE gene in Helianthus annuus and its relationship with zygotic and somatic embryogenesis. Dev Genes Evol. 216(5):253-64.)也在胚胎發(fā)育過程中起作用。從一項(xiàng)研究 各種逆境條件下擬南芥轉(zhuǎn)錄因子作用的研究中發(fā)現(xiàn)了 40個(gè)左右提高抗旱能力的轉(zhuǎn)錄因子， 其中包括一個(gè)HAP3基因AtNF-YBl (Riechmann JL, Heard J, Martin G, Reuber L, Jiang C， KeddieJ, Adam Pineda O, Ratcliffe OJ, Samaha RR, etal. (2000) Science 290: 2105..C2110 ，)。 玉米中的研究發(fā)現(xiàn)ZmNF-YB2 (HAP3基因)的轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力得到提高(Nelson DE, Repetti PP, Adams TR, Creelman RA， Wu J, Warner DC, Anstrom DC, Bensen RJ, Castiglioni PP, Donnarummo MG, Hinchey BS, Kumimoto RW, Maszle DR， Canales RD, Krolikowski KA, Dotson SB, Gutterson N, Ratcliffe OJ, Heard JE. Proc Natl Acad Sci USA. 2007 。 Plant nuclear factor Y (NF國(guó)Y) B subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields on water-limited acres.l04(42):16450-5.) 。 Miyoshi等在水稻中通過cDNA克隆和數(shù)據(jù)庫(kù)查詢 也發(fā)現(xiàn)了 11個(gè)HAP3基因，通過反義RNA和RNAi干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)OsHAP3A、 OsHAP3B、 OsHAP3C、 OsNF-YBl基因中至少有一個(gè)基因與葉綠體發(fā)育相關(guān)(Miyoshi K, Ito Y, Serizawa A, Kurata N. OsHAP3 genes regulate chloroplast biogenesis in rice. The Plant Journal已有的研究表明植物HAP基因主要參與了胚胎發(fā)育、葉綠體發(fā)育、對(duì)光周期的反應(yīng) 等過程的調(diào)節(jié)，在擬南芥和玉米中HAP3基因的表達(dá)受干旱和滲透脅迫的誘導(dǎo)，可以提高 植物的抗旱能力。但尚未有文獻(xiàn)報(bào)道水稻的HAP基因與耐逆性調(diào)控相關(guān)。本發(fā)明將已經(jīng)報(bào)道的玉米HAP3基因ZmLECl、 ZmNF-YB2和水稻的HAP3基因 OsHAP3A、 OsHAP3B、 OsHAP3C進(jìn)行了蛋白序列的比較，發(fā)現(xiàn)在這幾個(gè)蛋白的保守區(qū)域 中，玉米ZmNF-YB2蛋白在保守區(qū)域比其它蛋白多出了七個(gè)氨基酸(見圖1)。根據(jù)報(bào)道， 玉米中的兩個(gè)HAP3基因ZmNF-YB2與ZmLECLl功能相差較大，根據(jù)ZmLECl基因表 達(dá)分析，該基因可能與體細(xì)胞胚胎再生的發(fā)育過程有關(guān)系，不具有抗逆性能(Zhang S, Wong L, Meng L， Lemaux PG (2002) Similarity of expression patterns of knottedl and ZmLECl during somatic and zygotic embryogenesis in maize ( Zea mays L.). Planta 215:191-4)，推領(lǐng)ll這 7個(gè)氨基酸可能是一個(gè)重要的結(jié)構(gòu)，與ZmNF-YB2可以提高玉米的抗旱能力具有一定的相 關(guān)性。而水稻的OsHAP3A、 OsHAP3B、 OsHAP3C蛋白不含有這7個(gè)氨基酸，在保守結(jié)構(gòu) 上與不具抗旱功能的ZmLECl更為相似。另一方面，水稻為水性植物，而玉米為旱地植物， 二者在抗逆性調(diào)控機(jī)制上是否類似僅通過理論分析是無法確定的，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研 究加以驗(yàn)證。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是對(duì)水稻的HAP類轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行功能研究，從而獲得與耐逆性相關(guān)的 水稻HAP轉(zhuǎn)錄因子及其基因，用于提高植物的耐逆性能。本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)，克隆到三個(gè)與水稻的耐逆性相關(guān)的HAP類轉(zhuǎn)錄因子的基因， 可以提高水稻的抗鹽、抗旱和耐低溫的能力。本發(fā)明所提供的與耐逆性相關(guān)的HAP類轉(zhuǎn) 錄因子基因，來源于稻屬水稻(OryzasativaL.)，編碼下述蛋白質(zhì)(i)或(ii):(i) 具有序列表中SEQIDNO: 1、 3或5的氨基酸序列；(ii) 在(i)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一至十個(gè)氨基酸殘基且具有調(diào)控 植物耐逆性功能的由(i)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ ID NO: 1氨基酸序列由178個(gè)氨基酸殘基組成，其中，自氨基端第 33-122位氨基酸殘基為保守區(qū)，將具有該氨基酸殘基序列的蛋白命名為OsHAP3A。序列表 中的SEQIDNO: 3氨基酸序列由185個(gè)氨基酸殘基組成，其中，自氨基端第37-130位氨基 酸殘基為保守區(qū)，將具有該氨基酸殘基序列的蛋白命名為OsHAP3B。序列表中的SEQ ID NO: 5氨基酸序列由143個(gè)氨基酸殘基組成，其中，自氨基端第25-110位氨基酸殘基為保守區(qū)，將具有該氨基酸殘基序列的蛋白命名為0sHAP3C。所述取代.缺失或添加的一至十個(gè) 氨基酸殘基可以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。對(duì)氨 基酸殘基進(jìn)行取代、缺失或添加的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，通常是利用基因工 程的手段對(duì)其編碼基因進(jìn)行突變，然后再表達(dá)出相應(yīng)的蛋白。通過在植物中表達(dá)所述蛋白， 并測(cè)試這些植物的耐逆性，可以判斷發(fā)生這些變化后的蛋白是否還具有調(diào)控植物耐逆性的 功能。本發(fā)明所提供的與耐逆性相關(guān)的HAP類轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，可以具有下述核苷酸 序列序列表中SEQIDNO: 2、 4或6的DNA序列；與序列SEQIDNO: 2、 4或6具有 卯X以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。序列表中的SEQIDNO: 2由534個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架為自5'端第1-534位 堿基，編碼具有序列表中SEQIDNO:l的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5'端第97-366 位堿基編碼保守區(qū)，將具有該核苷酸序列的基因命名為Os/i4i^4。序列表中的SEQ ID NO: 4由555個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架為自5'端第1-555位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO: 3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，其中，自5，端第109-390位堿基編碼保守區(qū)，將具有 該核苷酸序列的基因命名為Oy/i4尸M。序列表中的SEQIDNO: 6由429個(gè)堿基組成，其 開放閱讀框架為自5'端第1-429位堿基，編碼具有序列表中SEQIDNO: 5的氨基酸殘基 序列的蛋白質(zhì)，其中，自5'端第73-330位堿基編碼保守區(qū)，將具有該核苷酸序列的基因命 名為ay//AP3C。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增C^//^P3J、 C^tt4P3B和Os/i4戶3C中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍 之內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高植物耐逆性的方法，包括對(duì)高鹽、干旱和低溫的 耐受能力。本發(fā)明所提供的提高植物耐逆性的方法，是將編碼所^7K稻與耐逆性功能相關(guān)的HAP 類轉(zhuǎn)錄因子的基因(Os/"P^4、 Oy/i4P35或Os/MP3C)或與所述基因具有90%以上同源 性且編碼相同蛋白的DNA序列導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官，使植物耐逆性獲得提高。在上述提高植物耐逆性的方法中，編碼本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)的HAP類轉(zhuǎn)錄因子的 基因(ay/Z^P3J、 C^ffilP3萬或CWi4/^C)既可為所述基因的cDNA序列，也可為所述基因 的基因組基因序列；與所述基因具有90X以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列，是將所述基因的cDNA或基因組基因序列用巳知的方法進(jìn)行分離和/或修飾和/或設(shè)計(jì)得到的。本領(lǐng) 域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改變可能會(huì)導(dǎo)致該基因 效能的降低或者加強(qiáng)，而且在一些應(yīng)用(例如，反義或共抑制技術(shù))中，部分序列經(jīng)常會(huì) 和全長(zhǎng)序列同樣有效地發(fā)揮作用?；蛐蛄凶兓蚩s短的方法，以及測(cè)試這些發(fā)生變化的 基因的有效性的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。編碼本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)的HAP類轉(zhuǎn)錄因子的基因(Os//^P^4、 或 Oy/WP3C)或其同源序列植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官；用于構(gòu)建所述植物表 達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或 可用于植物微彈轟擊的載體等，如GatewayTW系列載體(如pH2GW7等)、pBin系列載 體(如pBin 19等)、pBI系列載體(如pBI 101等)、pCAMBIA系列載體(如pCAMBIA 1301等)、per8、 pX6或其它衍生植物表達(dá)載體，所述出發(fā)載體還可為可在原核生物中復(fù) 制的載體，如pENTER-TOPO、 pUC系列載體或pBluescript系列載體等。使用編碼本發(fā)明7jC稻與耐逆性相關(guān)的HAP類轉(zhuǎn)錄因子的基因(<%/^尸^4、 (％/^戶_^或 Orfi4i^C)或其同源序列構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增 強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型(ABA、干旱、鹽堿或化學(xué)誘導(dǎo)等)啟動(dòng)子；所述組 成性表達(dá)啟動(dòng)子可為花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動(dòng)子，玉米Ubiquitin啟動(dòng)子或水稻 actinl啟動(dòng)子等；所述組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子可為根特異性表達(dá)啟動(dòng)子、葉片特異性表達(dá)啟 動(dòng)子、維管特異性表達(dá)啟動(dòng)子、種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子、花特異性表達(dá)啟動(dòng)子或花粉特異 性表達(dá)啟動(dòng)子，如2S1啟動(dòng)子(GenBank號(hào)NM—118848.2, GI:30687489)和NapinA(GenBank 號(hào)M64633.1， GI:349405)啟動(dòng)子等；所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可為受低溫、干旱、ABA、乙 烯、鹽堿或化學(xué)等誘導(dǎo)的啟動(dòng)子；上述啟動(dòng)子可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用； 此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄 增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼 序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源 是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu) 基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加 工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、 GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、慶大霉素標(biāo)記物或卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII) 基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等進(jìn)行篩選，含 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可 由潮霉素進(jìn)行篩選。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆 境篩選轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)上述方法進(jìn)行篩選后還可采用Southem、 PCR或點(diǎn)雜交等分子檢測(cè)手 段對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，以確定其是否轉(zhuǎn)化有目的基因。其中，以pH2GW7 (購(gòu)自inVitrogen公司)為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有編碼本發(fā)明水稻 與耐逆性相關(guān)的HAP類轉(zhuǎn)錄因子的基因的植物表達(dá)載體命名為pHAC Vector-OsHJ戶W、 pHAC Vector-Oy/^尸^8或pHAC Vector-Oy/^i^C。攜帶有編碼本發(fā)明7jC稻與耐逆性相關(guān)的HAP類轉(zhuǎn)錄因子的基因(Os/i4P^4、 Os/^戶M 或Oy/Z^WC)或其同源序列的植物表達(dá)載體可通過使用原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法(Ca^、 PEG)、 Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管導(dǎo)入、微注射、電激、基因槍、 農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織或器 官，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果 莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。此外，通過將轉(zhuǎn)化有編碼本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)的HAP類轉(zhuǎn)錄因子的基因 (Oy/i4i^4、 OWi4P3S或6^/"P3C)或與所述基因具有卯％以上同源性且編碼相同蛋白 的DNA序列的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)后，可從中進(jìn)一步篩選出基因純合的轉(zhuǎn)基因植株。 此外，還可對(duì)該轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行擴(kuò)繁，可使轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性進(jìn)一步改善和提高。所述 轉(zhuǎn)基因植物的擴(kuò)繁包括無性繁殖和/或種子繁殖。本發(fā)明的方法對(duì)雙子葉植物和單子葉植物均適用，因此，所述被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組 織或器官既可來源于煙草、油菜、棉花、大豆、楊樹、桉樹、馬鈴薯或牧草等雙子葉植物， 也可來源于水稻、玉米、小麥、大麥、高梁、谷子或草坪草等單子葉植物。本發(fā)明提供了一組來源于水稻與耐逆性相關(guān)的HAP類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因。實(shí)驗(yàn) 證明，將本發(fā)明的HAP3蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)化水稻可顯著提高水稻對(duì)逆境脅迫的耐受性， 增強(qiáng)水稻的抗鹽、抗旱和耐低溫的能力，且對(duì)水稻的正常生長(zhǎng)和經(jīng)濟(jì)性狀沒有明顯的影響。 同時(shí)，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，水稻的這三個(gè)HAP3蛋白的保守區(qū)域與玉米的ZmNF-YB2蛋白有較明 顯的差異(見圖1)，推測(cè)水稻的HAP3可能有著不同于玉米的工作機(jī)理。本發(fā)明的蛋白 及其編碼基因?qū)τ谥参锬婢衬褪苄詸C(jī)制的研究，以及提高植物的耐逆性及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義，將在植物(特別是禾谷類作物)的抗逆基因工程改良中發(fā)揮 重要作用，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為玉米與水稻HAP3基因保守區(qū)同源性的比對(duì)圖；圖2為0sHAP3A轉(zhuǎn)基因水稻不同株系中耐旱、耐鹽和耐冷植株百分比柱形圖； 圖3為OsHAP3B轉(zhuǎn)基因水稻不同株系中耐旱、耐鹽和耐冷植株百分比柱形圖； 圖4為OsHAP3C轉(zhuǎn)基因水稻不同株系中耐旱、耐鹽和耐冷植株百分比柱形圖； 圖5為干旱脅迫15天復(fù)水2周后的OsHAP3A、 OsHAP3B和OsHAP3C轉(zhuǎn)基因代植株與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓暾掌粓D6為經(jīng)1% NaCl鹽溶液脅迫5天后OsHAP3A、 OsHAP3B和OsHAP3C轉(zhuǎn)基因Ti代植株與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓暾掌?；圖7為經(jīng)低溫脅迫7天后OsHAP3A、 OsHAP3B和OsHAP3C轉(zhuǎn)基因T！代植株與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓暾掌?br> 具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J., Russell， David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001， NY， Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。實(shí)施例1、 TK稻與耐逆性相關(guān)的HAP類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的獲得1、 基因序列的獲得從NCBI査詢到OsHAP3A (GenBank號(hào)AB095438)、 OsHAP3B (GenBank號(hào) AB095439)、 OsHAP3C(GenBank號(hào)AB095440)。 (Miyoshi K, Ito Y, Serizawa A, KurataN. OsHAP3 genes regulate chloroplast biogenesis in rice. The Plant Journal (2003) 36:532—540)。2、 Os//AP^4、 Osii4P35禾卩6^fi4P3C的PCR擴(kuò)增及序列分析 根據(jù)GenBank中的序列設(shè)計(jì)引物，以水稻中花ll號(hào)(0;^w^w "ZhonghuaNO.il")的cDNA為模板，采用RT-PCR方法擴(kuò)增Oy/i4戶3厶C^ffi4P3B和Oy/fAWC，引物序列如下(1) 按OsHAP3A的CDS序列設(shè)計(jì)引物 OsHAP3A引物序列正向引物5 ，> CACCATGATGATGATGGATCTAGGGTTT >3 ， 反向引物5 ，> GGTGTCCCCATTATGATACTGAG>3'(2) 按OsHAP3B的CDS序列設(shè)計(jì)引物 OsHAP3B引物序列正向引物5 ，>CACCATGGCGGATGGGCCGGGGAGC>3 ， 反向引物5 '>GTTTGAGACATCCCCATTATGGTAC >3,(3) 按OsHAP3C的CDS序列設(shè)計(jì)引物 OsHAP3C引物序列正向引物5，> CACCATGTCGGAGGGGTTCGAC >3， 反向引物5 ，>CATGCCTTCAAACGATGATC>3 ，具體方法為取約2嗎的水稻總RNA，加入2nlOligo(dT;h8primer(0.1ng/(xl),小心混 勻，65。C保溫5分鐘。室溫放置10分鐘，然后分別加入4pl 5x First-strand buffer, 0.5^1 Ribonuclease inhibitor(40U/|il)， 2pl lOOmM DTT， 2|_d 4xdNTP(各10mM)， ipl MMLV Reverse Transcriptase (200U/nl)，小心混勻，37。C保溫1小時(shí)。然后90。C處理5分鐘，冰上冷卻， 離心收集即獲得相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。將得到的cDNA稀釋10倍，取1^1作為PCR 反應(yīng)的模板，用PCR方法擴(kuò)增。50pLPCR反應(yīng)體系為上、下游引物(10pM)各l^il, cDNA 模板lpil， Pfo酶(5U/pl)liLi1， 4xdNTPs(各lOmM) lpl， 10><buffer(Mg2+) 5^1， H2O40nl。PCR反應(yīng)條件為預(yù)熱94°C預(yù)變性2min、然后94°C變性30 s、退火40 s (OsHAP3A、 OsHAP3和OsHAP3C的退火溫度分別為57°C、 59"C和54°C) 、 72°C延伸90 s，共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳 檢領(lǐng)U，經(jīng)擴(kuò)增獲得了大小分別為534bp， 555 bp， 429bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符?；厥詹⒓兓鲜銎?，將其分別連接入載體pENTER-TOPO (Invitrogen公司)中，再 將連接產(chǎn)物分別用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(五.co") DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，挑 選陽性單菌落加入到5mL含50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37'C、 200rpm下培 養(yǎng)12-16小時(shí)，提質(zhì)粒，得到含有目的片段的重組質(zhì)粒，分別命名為pENTER-TOPO Vector-Oy/^尸3丄pENTER-TOPO Vector-Os/^戶3S禾d pENTER-TOPO Vector-Os/Wi^C 對(duì)上述質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明獲得了序列正確的as/M尸M、 C^tt4尸3B和Oy/i4戶3C。其中，CWMP3^具有序列表中SEQIDNO: 2的核苷酸序列，由534個(gè)堿基組成，其開放 閱讀框架為自5'端第1-534位堿基，編碼具有序列表中SEQIDNO: 1的氨基酸序列的蛋 白質(zhì)，其中，自5'端第97-366位堿基編碼保守區(qū)；Osii4戶3S具有序列表中SEQIDNO: 4 的核苷酸序列，由555個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架為自5'端第1-555位堿基，編碼具有 序列表中SEQIDNO: 3的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中，自5'端第108-390位堿基編碼保 守區(qū)；Os/i4i^C具有序列表中SEQIDNO: 6的核苷酸序列，由429個(gè)堿基組成，其開放 閱讀框架為自5'端第1-429位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的蛋 白質(zhì)，其中，自5'端第73-330位堿基編碼保守區(qū)；對(duì)Oy/i4尸X4、 Os/Z^P35和Oy/i4i^C 編碼的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)果如圖l所示，比對(duì)結(jié)果表明上述各基因編碼氨 基酸序列具有84.6%的一致性，歸為同一類。實(shí)施例2、與耐逆性相關(guān)的HAP類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因轉(zhuǎn)基因水稻的獲得 用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將實(shí)施例1獲得的與耐逆性相關(guān)的HAP類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因 C^K4P^4、 C^ffi4尸18和Os/i4P3C分別轉(zhuǎn)化水稻，具體方法如下 1)轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建和鑒定人工合成包含有Sac I 、州'"d III和*e I等內(nèi)切酶位點(diǎn)的182 bp片段，具有序列表中 SEQ ID NO: 7的核苷酸序列，該片段用Sac I和印e I雙酶切后插入pH2GW7載體(購(gòu)自 inVitrogen公司)得到含有歷力d III酶切位點(diǎn)的中間載體，命名為pHUG-l。經(jīng)過酶切和測(cè) 序鑒定證明插入片段正確，pHUG-l構(gòu)建正確。以水稻日本晴基因組 DNA 為模板，用正向引物 (5'> CCCAAGCTTTGAGAAGAGAGTCGGGATAGTCCAAAAT>3，，含州wd III酶切位點(diǎn))和反 向引物(5，> GGACTAGTTCTACCTACAAAAAAGCTCCGCACGAGG>3，，含I酶切 位點(diǎn))弓l物58。C退火PCR擴(kuò)增獲得產(chǎn)物Actin啟動(dòng)子，該片段用歷"d III和I雙酶切 后插入構(gòu)建好的pHUG-l載體得到的新載體，命名為pHAC (11823 bp)，經(jīng)酶切和測(cè)序 鑒定證明pHAC構(gòu)建正確。2)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌通過LR反應(yīng)將實(shí)施例1中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pENTER-TOPO Vector-Osii4P"、 的植物表達(dá)載體pHAC中，LR反應(yīng)體系為2^1 LR酶(LR Clonase enzyme mix, Invitrogen試劑盒中提供)，2pl 5xLR Clonase Reaction buffer, 2^1 pENTER國(guó)TOPO隱Os/i4P^4 (150ng4d)、 pENTER-TOPO-Oy/i4i^B (150ng4tl)或pENTER國(guó)TOPO陽as/i4尸3C (150ng4d)， 2^1 pHAC (150ng/pl)，補(bǔ)水2pl。 LR反應(yīng)條件為25。C水浴1到3個(gè)小時(shí)。然后，通過熱激法將上 述重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(五.coW DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，挑選陽性單菌落加 入到5mL含50mg/L的壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37'C、200rpm下培養(yǎng)12-16小時(shí)， 提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRV進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)酶切獲得了大小分別為618 bp、496 bp 和513bp的酶切產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果相符，再在實(shí)施例1中引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR鑒定， 鑒定結(jié)果表明獲得了分別含有0 /i4尸3J、 C^i4i^S和Os/ilP3C的重組植物表達(dá)載體， 分別命名為pHAC-C^/MP^4、 pHAC-Oy/MP!B和pHAC-ayft4i^C，隨后將上述重組載體 分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGLO菌株(中國(guó)科學(xué)院遺傳所贈(zèng)送)。3)侵染水稻愈傷組織挑取步驟1)獲得的陽性重組農(nóng)桿菌的單菌落接種于含壯觀霉素50mg/L和利福平 50mg/L的20mL YEB液體培養(yǎng)基中，在28°C 、 150rpm下振蕩培養(yǎng)2-3天，再于4°C 、5000rpm 離心3分鐘，去上清，將菌體沉淀重懸于含0.1mmol/L乙酰丁香酮的AA培養(yǎng)基 (Co(N03)2.6H2O0.15mg/L， CaCl2 110mg/L， MgS04122mg/L， KI3.75mg/L， NaH2P04'H20 150mg/L， Na2-EDTA0.01mM， FeS04'7H20 139mg/L, KC12.95g/L， MnS04'4H20 84.5mg/L， ZnS04-7H20 6.25mg/L， H3B03 5mg/L， Gly37.5mg/L， CuS04 0.005mg/L， Na2Mo04.2H20 1.25mg/L，鹽酸硫胺素VBi 5mg/L，煙酸5mg/L，鹽酸吡哆醇VB6 5mg/L，肌酸O.lg/L, 酪蛋白水解物0.3g/L， L-Gln 87.6mg/L， L-Asp 26.6mg/L，蔗糖20g/L)中，在28。C下避光 振蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)至OD6txr0.6-0.9。挑選按常規(guī)植物組織培養(yǎng)方法獲得的水稻中花11的生 長(zhǎng)狀態(tài)良好、顆粒狀愈傷組織浸入上述分別轉(zhuǎn)化有Os/i4尸^4、 Oy/i4i535和Os/i4尸3C的 重組農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中搖動(dòng)20分鐘后，靜置30分鐘，取出，用無菌濾紙吸干多余菌液，將 愈傷組織接種于N6共培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基+10g/L葡萄糖+lmg/L乙酰丁香酮+2mg/L2，4-二 氯苯氧乙酸(2,4-D))上培養(yǎng)，其中N6基本培養(yǎng)基的配方為(NH4) 2SO40.46g/L， KN03 2.83g/L， CaCl2 0.2g/L， MgS04 0.092g/L， KH2P04 0.4g/L， Na2-EDTA 0.15g/L， FeS04.7H20 0.11g/L， MnS04.4H20 0.44g/L, ZnS04-7H20 0.17g/L， H3B03 0.14g/L， CoCl2.6H20 0扁5g/L， CuS04'5H20 0,0005g/L， Na2Mo04.2H20 0.005g/L，鹽酸硫胺素VBi 0.01g/L，煙酸0.001g/L， 鹽酸吡哆醇VB6 0.001g/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物0.3g/L， L-Pro 0.5g/L，蔗糖30g/L， 瓊脂10g/L， pH5.8。 2-3天后，將愈傷組織放入廣口瓶中，用無菌水沖洗3-5次，每次搖動(dòng)數(shù)次，然后在含500mg/L頭孢霉素的無菌水中浸泡30-60分鐘，最后再用無菌水沖洗1 遍，置于無菌濾紙上晾干，最后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(N6基本培養(yǎng)基+2，4-D 2mg/L+頭孢霉素 250mg/L)篩選。4)陽性轉(zhuǎn)基因水稻的獲得將侵染后的水稻愈傷組織于N6共培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3-5天后，轉(zhuǎn)至含30mg/L潮霉素和 400mg/L頭飽霉素的N6固體培養(yǎng)基(N6大量元素+B5微量元素+B5有機(jī)成分+300mg/L水 解酪蛋白+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+7-8g/L瓊脂，pH 5.8)上篩選3周，再轉(zhuǎn)入含50mg/L 潮霉素和200mg/L頭飽霉素的N6固體培養(yǎng)基上篩選4周，隨后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入預(yù)分 化培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基+lmg/L奈乙酸+2mg/L6-芐基氨基嘌呤+5mg/L脫落酸)，光照培養(yǎng)3 周，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基+lmg/L奈乙酸+2mg/L6-芐基氨基嘌呤)上進(jìn)行分化， 將生長(zhǎng)出的再生植株在壯苗培養(yǎng)基(1/2 MS無機(jī)鹽+0.5mg/L奈乙酸+0.25mg/L多效唑)上進(jìn) 行生根培養(yǎng)后移至溫室中，在28"C、 15小時(shí)/天的光照下培養(yǎng)1個(gè)月后取植株葉片，按常 規(guī)方法提取總DNA，在正向引物5'-AGCTGCGCCGATGGTTTCTACAA-3，和反向引物 5'-ATCGCCTCGCTCCAGTCAATG-3'的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，經(jīng)擴(kuò) 增獲得lkb DNA片段的為陽性轉(zhuǎn)基因植株，檢測(cè)結(jié)果表明用上述方法獲得了分別轉(zhuǎn)化有 OsiilP^4、 Os/i4i^B和C^^WC的轉(zhuǎn)基因水稻。實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因1代植株耐旱性鑒定收獲Os/"P" 、 OWi4尸3B和C^fM戶3C L代轉(zhuǎn)基因水稻種子。用水浸種培養(yǎng)3天使 其萌發(fā)，然后用50mg/L潮霉素進(jìn)行抗性篩選，同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因水稻中花ll作對(duì)照，篩選 5天后，對(duì)照植株全部死亡，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗性 分離比，選擇抗性苗與無抗性苗的分離比約為3: 1的株系，結(jié)果表明獲得了具有單位點(diǎn) 插入的6^fi4i^4、 Os/i4P3S和Os股P3C轉(zhuǎn)基因株系，繼續(xù)培養(yǎng)一周后進(jìn)行干旱處理，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)基因的水稻中花ii植株作對(duì)照。將水稻幼苗種入裝箱的土壤中，采用蛭石營(yíng)養(yǎng)土混合比例為3 : 1的混合土， 土壤的含水量限定為55-65%之間(采用烘干法測(cè)量土 壤含水量，根據(jù)土壤烘干前后土壤重量的差值計(jì)算土壤的含水量)。從處理即日起不再澆 水，直至絕大多數(shù)的未轉(zhuǎn)基因水稻苗的葉片干枯、莖桿脫水彎曲、死亡，而各轉(zhuǎn)基因株系 的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，葉片稍下垂，莖桿直立，停止篩選，復(fù)水培養(yǎng)。去除干旱協(xié)迫條件，在 正常的復(fù)水培養(yǎng)條件下恢復(fù)生長(zhǎng)2周后統(tǒng)計(jì)各轉(zhuǎn)基因株系的成活苗數(shù)，計(jì)算耐旱苗比例， Oy/i4P3丄C^/f^P!B和C^i4尸3C 1\代轉(zhuǎn)基因水稻的耐旱篩選結(jié)果如圖2、圖3和圖4中所示，與野生型對(duì)照植株(WT)相比，OsHAP3A、 OsHAP3B和OsHAP3C轉(zhuǎn)基因7jC稻 Tj代植株對(duì)干旱脅迫的耐受性均明顯提高。OsHAP3A、 OsHAP3B和OsHAP3C轉(zhuǎn)基因水 稻L代經(jīng)耐旱處理后的植株與經(jīng)耐旱處理后的未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?WT)如圖5所示。篩 選出的轉(zhuǎn)基因耐旱苗在大田中繼續(xù)培養(yǎng)并收獲種子，進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗(yàn)證。實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因Ti代植株耐鹽性鑒定收獲Ti代陽性轉(zhuǎn)基因水稻種子，用水浸種培養(yǎng)3天使其萌發(fā)，然后用50mg/L潮霉素 進(jìn)行抗性篩選，同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因水稻中花ll作對(duì)照，篩選5天后，對(duì)照植株全部死亡，統(tǒng) 計(jì)轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗性分離比，選擇抗性苗與無抗性苗 的分離比約為3 : 1的株系，結(jié)果表明獲得了具有單位點(diǎn)插入的ay股尸M、 ay/W"5和 Oy/i4P3C轉(zhuǎn)基因株系。繼續(xù)培養(yǎng)一周后，將苗轉(zhuǎn)移到三角瓶中，加入含有P/。NaCl的鹽 溶液，進(jìn)行鹽脅迫處理5天(溫度28°C，光強(qiáng)40001ux，光15h/暗9h)，期間每天更換鹽 溶液，以保持鹽濃度的穩(wěn)定，篩選5天后除去鹽溶液，統(tǒng)計(jì)成活苗數(shù)，計(jì)算耐鹽苗比例， Oy/^P3^、 as/M尸35和C^ffi4尸3C T！代轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽篩選結(jié)果如圖2、圖3和圖4 中所示，同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因的中花ll水稻苗(WT)為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ti代轉(zhuǎn)基因水 稻植株對(duì)鹽的耐受能力明顯高于未轉(zhuǎn)基因水稻植株，經(jīng)鹽處理后，Os/M尸^4、 Oy/^P3B 和C^WP3C轉(zhuǎn)基因水稻l代陽性株系的植株恢復(fù)培養(yǎng)后能夠繼續(xù)生長(zhǎng)，未轉(zhuǎn)基因的中花 11對(duì)照(WT)植株的葉片發(fā)黃、巻曲、干枯，莖桿不能直立，恢復(fù)培養(yǎng)后很快死亡(如 圖6所示，圖中WT/鹽為鹽溶液脅迫后未轉(zhuǎn)基因植株對(duì)照；WT/H20為正常培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)基 因植株對(duì)照；OsHAP3A、 OsHAP3B和OsHAP3C分別是鹽溶液脅迫后的OsHAP3A、 OsHAP3B和OsHAP3C轉(zhuǎn)基因T^代植株)。篩選出的轉(zhuǎn)基因耐旱苗在大田中繼續(xù)培養(yǎng)并收 獲種子，進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗(yàn)證。實(shí)施例6、轉(zhuǎn)基因1^代植株耐低溫性鑒定收獲l代陽性轉(zhuǎn)基因水稻種子，用水浸種培養(yǎng)3天使其萌發(fā)，然后用50mg/L潮霉素 進(jìn)行抗性篩選，同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因水稻中花ll作對(duì)照，篩選5天后，對(duì)照植株全部死亡，統(tǒng) 計(jì)轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗性分離比，選擇抗性苗與無抗性苗的分離比約為3: i的株系，結(jié)果表明獲得了具有單位點(diǎn)插入的as/^尸3x、 as/MW5和(9^Wi^C轉(zhuǎn)基因株系。繼續(xù)培養(yǎng)一周后，將培養(yǎng)苗放入4。C (光強(qiáng)25001ux，光15h/暗9h) 培養(yǎng)條件下進(jìn)行低溫處理7天，然后恢復(fù)室溫繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因的中花11為對(duì)照，分別統(tǒng)計(jì)成活苗數(shù)，計(jì)算耐低溫苗比例。OWi4P^4、 C^f"尸18和Os/ilP3C 1\代轉(zhuǎn)基因 水稻的耐低溫篩選結(jié)果如圖2、圖3和圖4中所示，耐低溫處理后的轉(zhuǎn)基因Ti代植株和對(duì) 照植株如圖7所示，4QC處理7天后，陽性轉(zhuǎn)基因株系的T！代植株(OsHAP3A、 OsHAP3B 和OsHAP3C)僅葉尖部分稍有巻曲，室溫培養(yǎng)后能夠繼續(xù)恢復(fù)生長(zhǎng)，而未轉(zhuǎn)基因的中花 11對(duì)照(WT/低溫)植株的葉片萎蔫、巻曲、干枯，莖桿不能直立，室溫培養(yǎng)后不能恢復(fù) 生長(zhǎng)，并很快死亡，表明轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫的耐受抵抗能力明顯高于未轉(zhuǎn)基因植株。篩選 出的轉(zhuǎn)基因耐旱苗在大田中繼續(xù)培養(yǎng)并收獲。如附圖所示，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，OsHAP3基因在提高植物抗低溫的能力方面具有 更明顯的效果，耐鹽效果也略好于其它兩個(gè)基因。盡管為說明目的公開了本發(fā)明的具體實(shí)施例和附圖，其目的在于幫助理解本發(fā)明的內(nèi) 容并據(jù)以實(shí)施，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解在不脫離本發(fā)明及所附的權(quán)利要求的精 神和范圍內(nèi)，各種替換、變化和修改都是可能的。因此，本發(fā)明不應(yīng)局限于最佳實(shí)施例和 附圖所公開的內(nèi)容。序列表(SEQUENCELISTING) <110>北京未名凱拓農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司 <120>水稻HAP3及其基因在提高植物耐逆性能上的應(yīng)用 <130> JSP070357 <160> 7< 170> Patentln version 3.1<210> 1<211> 178<212> PRT<213> 水稻(Oryzasativa)<400> 1Met Met Met Met Asp Leu Gly Phe Leu Glu Gly Gly Ala GlyAspArgLysThr65AlaAla GlyLysGly 145 AlaGluLys 50 LeuGin 35 AlaAsp Leu LeuPro LeuPhe 100 工le!Leu 130 ProLys 115Ser Ser His SerTyr Thr Gin Asp Thr5Asp Glu Ser GlyArg Phe !Leu Pro 40 GlyHis 20 AspVal Pro AlaGin Glu Cys Ser Asp LysCys 85 AlaTyr!LysGlyVal 70 GinAsn 55 SerLeu HisAlaAla 150 Gly Met 165Gly 135 SerLys 120 AspSer 25 lie10 ProPro Arg SerAla Asn lie!Lys工le AlaGlu Phe lieLys Glu !Lys Met Gly Thr105 TyrArg90GlySer 75 Lys!Lys60PheArg Glu Met Gly Ser ValSer Ser SerGly Tyr MetGin 170!Lys 140 Ala Gin 155Pro GinSer45AspGly 30 ArgThr lie AsnPhe Glu GluTyr 110 GlyMet Als 15Gly Val lie MetAla Lys GluVal ThrGlu 125Lys Asp Gly Met Tyr HisSer Glu 80Gly Glu 95Val AspAsp SerThr lieVal Gly 160 Asn Gly 175<210> 2<211> 537<212> DNA<213> 水稻(Oryzasativa)<400> 2atgatgstgatgg3tctsgggtttttggsgggcggcgcggggstggcggacgcggggcsc60gacgsgagcgggsgcccgccg3gg3gcggcggggtgsgggagcaggacaggttcctgccc120tcsgccgc3tgccgtcccggcgaacggcaagatcgccaag180gscgccssgg3gsccctgc3ggsgtgcgtctcggsgttcstctccttcgtcsccsgcgsg240gcgagcgscs33tgtcsga3ggsgssgcgcacggggaagstctcctcttt300gcgatgggtacgcttggctttgsggsgtacgttgstccgttg33g3tct3ttt3C3C33g360tgg3gggtg3tagt3sgctgtcctcaaaggctggtgatgg420ttggtccgcacsgtggcgctsgtsgctcaagtgcgcasgggatggttggg糊gcttaicsccccctcsgtstcC3CC534210> 3 <211> 185 <212> PRT<213> 水稻(Oryzasativa)<400> 3Met Ala AspSer GlyGly GlySer Arg50 Asp Ala 65lie ThrSerGly35 工le工le Asn GlyGlyPro 20 ValAsp 100Pro 5ArgArg Lys Lys Glu ThrMetSer GluAla 85 AspGly GlySer Pro Gly Gly GlyGlu GinLysVal70SerAla 55 GinAspLeu LeuAsp 40 lieGluLysTrpGly 25 ArgCysCysAla 105Gly 10 GlyValGin 90 MetGly GlyPro Ala AsnSer 75 ArgGly GlyPhe Leu ProGly 60 GluGlyGlylie 45 !LysSerGly 30 AlaHis 15 GlyGlu !Lys ArgAla Thr LeuGly 110!Lys 95 PheGluGlyAsn lielie Ala LysPhe lie SerPhe 80 ThrGluAsp Tyr lie Glu Pro Leu Lys Val 115 120 Glu Gly Asp Ser Lys Leu Thr Ala130 135 Lys Asp Val Leu Gly Ser His Gly 145 150 Met Gly Gin Gin Ala Ala Tyr Asn 165Gin Tyr His Asn Gly Asp Val Ser 180Tyr !Leu Gin Lys Tyr Arg Glu Met 125Lys Ala Gly Asp Gly Ser Val Lys 140Gly Ser Ser Ser Ser Ala Gin Gly 155 160 Gin Gly Met Gly Tyr Met Gin Pro 170 175Asn 185<210> 4<2H> 558<212> DNA<213> 水稻(Oryzasativa)<400> 4atggcggstgggccggggsgcccggggggsggsggggggsgccscgsgsgcgggsgcccg60sgggggggsgggggsggsgggggaggtgggggtgggggtgggggggtgaggg3gc3gg3c120aggttcctcccceitcgccei3catcsgccgcsggccstcccggccaacggg180sggacgcc33ggsgsccgtgcsggsgtgcgtctccgsgttC3tCtCCttC2403tcsccsgcgaggcgagcgat333tgccaggc33g3cc3tC3scggcgsc300gscttgctgtgggcgstggccscgctgggcttcg3gg3ctsc3tcgsgcccctcssggtc360tacctgcaga3gt3c3g3g3gstggsgggtt33CtgC333ggctggtg3t420ggctctgtgascttggttctC3tggsgg33gc3gttC33gtgcccaaggg480C33tc33ggs3tgggttat3tgC33CCtC3gtaccataat540ggggatgtct555<210> 5<211> 143<212> PRT<213> 水稻(Oryzasativa)<400> 5Met Ser Glu Gly Phe Asp Gly Thr Glu Asn Gly 15 10Gly Gly Gly Gly Gly 15Gly GlyGly ArgAsp Ser50 lie Thr 65lie AsnAsp TyrGlu GlyAsp Val 130Val Gly !Lys 20lie Met Arg 35Lys Glu SerSer Glu AlaGly Asp Asp 85Val Glu Pro 100Asp Thr Lys 115Val Leu AsnGlu GinArg AlaVal Gin 55Ser Asp 70Leu lieAsp Arg 25Val Pro 40Glu Cys Lys Cys Trp SerPhe Leu Pro lieGlu Asn GlyLeu Lys Leu Tyr 105Gly Ser Arg Ala 120Gly Asp Pro Gly 135Val Ser!Leu Lys 75Met Gly 90Leu ArgGlu 60 GluLys 45 PheLysAla 30 lieLeu TyrArg 110 ValAsn lieAla Lyslie Ser PheArg Thr Leu GlyLysPhe 95 GluThr80GluThrSer Glu Leu Pro Val Lys Lys 125Ser Ser Phe Glu Gly Met 140<210> 6<211> 429<212> DNA<213> 水稻(Oryzasativa)<400> 6stgtcggsggggttcgscggggcggcggcggcggcggsggcggsgt3ggg60accggttcctgccgstcgcc33C3tcggccgcstc3tgcgccgggccgtg120ccggsgsscggc33g3tcgcc33gg3ctccssggagtccgtccsggsgtgcgtctccgag180ttcdtcsgcttc3tcscc3gcg33gc33gcgacssgtgccgcgcasgscc2403tcsaLtgggg3cg3cctgattctggtceL3tgggcacgctcgctstgtcgsg300cctctcasgctctscctcsggctctsccgggsgscggsgggggttc33gs360gcttctgsactgcc3gt333gtacttsatggsgstcctggatcatcgttt420g33ggc3tg429<210> 7<211> 182<212> DNA <213>人工序列<400> 7gagaggagct cgctstgacc atgattacgc cssgcttagc scggscttst cggtcggsgc 60acggacttat cggtcggagc acggacttat cggtcggagc acggacttat cggtcggagc 120acggacttat cggtcggtct sgaagctact ccacgtccat 3aggg3cac3 tactsgtscg 180ac 18權(quán)利要求
1.水稻HAP3基因及其編碼的蛋白質(zhì)在提高植物耐逆性能上的應(yīng)用，所述HAP3基因編碼下述蛋白質(zhì)(i)或(ii)(i)具有序列表中SEQ IDNO1、3或5的氨基酸序列；(ii)在(i)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一至十個(gè)氨基酸殘基且具有調(diào)控植物耐逆性功能的由(i)衍生的蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于將所述HAP3基因?qū)胫参锛?xì)胞、組織或器官，再將被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株，得到耐逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述HAP3基因具有下述核苷酸序列之一 1) 序列表中SEQ ID NO: 2、 4或6的DNA序列； 2) 與l)限定的DNA序列具有90X以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述HAP3基因通過植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物 細(xì)胞、組織或器官。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體是一 種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體， 或者是可在原核生物中復(fù)制的載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植 物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體為pBin系列載體、pBI系列載體、GatewayTw 系列載體、pCAMBIA系列載體、per8或pX6;所述可在原核生物中復(fù)制的載體為 pENTER-TOPO、 pUC系列載體或pBluescript系列載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于用所述HAP3基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在 其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于用所述HAP3基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)添加 翻譯增強(qiáng)子和/或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于在所述植物表達(dá)載體中加入選擇性標(biāo)記基因，所述選擇性標(biāo)記基因包括但不限于可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶的基因、發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物和抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為雙子葉植物或單子葉植物，所 述雙子葉植物包括煙草、油菜、棉花、大豆、楊樹、桉樹、馬鈴薯和牧草；所述單子 葉植物包括水稻、玉米、小麥、大麥、高梁、谷子和草坪草。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組來源于水稻的與耐逆性相關(guān)的HAP3基因，其編碼的蛋白質(zhì)具有下述氨基酸序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1、3或5；2)將序列表中SEQ ID NO1、3或5的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且所衍生的蛋白質(zhì)具有調(diào)控植物耐逆性的功能。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化水稻可提高水稻對(duì)高鹽、干旱和低溫逆境脅迫的耐受性，且對(duì)水稻的正常生長(zhǎng)和經(jīng)濟(jì)性狀沒有明顯的影響。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锬湍鏅C(jī)制的研究，以及提高植物的耐逆性及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義，將在植物(特別是禾谷類作物)的耐逆基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101220364SQ200810056828
公開日2008年7月16日 申請(qǐng)日期2008年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日
發(fā)明者王喜萍 申請(qǐng)人:北京未名凱拓農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司