專利名稱：：一種通過基因沉默控制羅布麻分枝的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種通過基因沉默控制羅布麻分枝的方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：羅布麻是夾竹桃科(^wc戸acefle)羅布麻屬0;wQ7mm)的一種多年生宿根草本植物，它包括羅布紅麻(J/WQ7wmvewe^mZi/m)和羅布白麻C4;wc)7mmAe"^rw""/foo)t./.)。羅布麻無論在纖維利用、藥用還是保健品開發(fā)方面均具有極高的綜合利用價值。國內(nèi)外現(xiàn)有的報道主要是關(guān)于羅布麻纖維脫膠技術(shù)的研究，而對前期的育種、生長特性和如何提高麻纖維質(zhì)量的研究報道很少。由于羅布麻分枝較多，既影響種植密度，也難于實(shí)現(xiàn)機(jī)械化剝麻，直接影響了纖維長度和產(chǎn)量。野生資源已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足不斷增長的市場需求。目前，雖然進(jìn)行了一些小規(guī)模人工種植試驗(yàn)，但分枝多，纖維短及產(chǎn)量低的問題仍然無法解決。因此，通過現(xiàn)代生物工程技術(shù)，利用轉(zhuǎn)基因育種方法減少羅布麻的分枝，培育出分枝少、纖維產(chǎn)量高的新品種，提高麻皮的質(zhì)量和產(chǎn)量，不但在控制植物分枝研究方面具有重要意義，而且所選育新品種的推廣將會產(chǎn)生巨大的社會和經(jīng)濟(jì)效益。雖然目前對于其它植物的分枝發(fā)育調(diào)控國內(nèi)外已有較多研究，但分枝控制涉及到十分復(fù)雜的植物激素調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。隨著一些分枝調(diào)控基因和轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)，為我們通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)對植物分枝的控制提供了可能。玉米的tblgene被認(rèn)為是分枝調(diào)控基因(J.Doebleyetal.Nature,1997，386，485-488)，此基因本身有抑制分枝的作用。另外，還有研究通過構(gòu)建含有MADS-box基因的表達(dá)載體以實(shí)現(xiàn)增加農(nóng)作物和觀賞植物分枝的目的(UnitedStatesPatentNo.6995302)。在Ken-ichiroHibara和CasperW.Vroemen等對擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，CUC3基因?qū)?cè)枝發(fā)育有重要作用(Ken-ichiroHibaraetal.ThePlantCell,2006，18,2946—2957;CasperW.Vroemenetal.Theplantcell,2003，15,1563-1577)。CUC3基因?qū)儆贜AC轉(zhuǎn)錄因子家族，它對側(cè)枝的發(fā)育、器官原基邊界的界定和頂端分生組織的形成發(fā)揮主要作用。在擬南芥中抑制CUC3基因，使擬南芥的側(cè)枝生長受到抑制。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在側(cè)枝發(fā)育方面，CUC3起正調(diào)控作用。本發(fā)明將反義RNA技術(shù)應(yīng)用于羅布麻，沉默羅布麻的CUC3基因，實(shí)現(xiàn)對其分枝的控制。反義RNA技術(shù)是通過與RNA進(jìn)行堿基配對的方式從復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等水平上對基因表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用。目前，反義RNA技術(shù)己經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物基因工程中，成為作物遺傳改良的一個重要工具。目前利用反義RNA技術(shù)調(diào)控植物的基因表達(dá)取得了很多進(jìn)展，有些結(jié)果已接近實(shí)際應(yīng)用水平，反義RNA技術(shù)已經(jīng)滲透到植物學(xué)研究各個領(lǐng)域(孟博等.國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊，2001，24(6)，289-292)，如植物生長發(fā)育基因表達(dá)調(diào)控、農(nóng)藝性狀的改良(許本波等.中國農(nóng)學(xué)通報，2003，19(3)，84-88)、次生代謝途徑的調(diào)控和抗病轉(zhuǎn)基因植物育種(婁紅等，遼寧大學(xué)學(xué)報，2005，32(4)，328-333)，并獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因新品系，具有廣泛的應(yīng)用前景。目前還沒有通過反義RNA技術(shù)沉默CUC3基因來控制羅布麻及其他作物和觀賞植物分枝的相關(guān)報道。雖然國內(nèi)外已對羅布麻的組織培養(yǎng)進(jìn)行了一些研究，但尚未建立穩(wěn)定的再生體系。本發(fā)明通過發(fā)根農(nóng)桿菌感染羅布麻外植體，可得到發(fā)根，從發(fā)根途徑可直接得到再生植株，從而建立了羅布麻穩(wěn)定的再生體系。與以往對羅布麻組培途徑實(shí)現(xiàn)再生的研究相比，這種方法不易產(chǎn)生嵌合體植株，因此，是一種理想且穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株再生體系。本發(fā)明通過構(gòu)建CUC3基因的反義表達(dá)載體，利用發(fā)根農(nóng)桿菌途徑對羅布麻進(jìn)行轉(zhuǎn)化和實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的再生，從而實(shí)現(xiàn)對羅布麻分枝的控制。本發(fā)明是一種對植物實(shí)現(xiàn)分枝調(diào)控的新途徑，同時也為其他作物及觀賞植物分枝性狀控制提供了新的思路。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于應(yīng)用反義RNA引發(fā)的基因沉默技術(shù)，設(shè)計(jì)和構(gòu)建羅布麻的分枝調(diào)控基因CUC3保守區(qū)基因片段的反義表達(dá)載體，導(dǎo)致該基因的沉默，抑制羅布麻的分枝發(fā)育，獲得分枝少的羅布麻新品種。本發(fā)明提供了一種應(yīng)用反義RNA基因沉默技術(shù)控制羅布麻分枝的方法，主要內(nèi)容包括1.羅布麻分枝調(diào)控基因CUC3保守區(qū)的克隆；應(yīng)用RT-PCR方法，提取羅布麻總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，以cDNA為模板克隆分枝調(diào)控基因CUC3保守區(qū)基因片段，并根據(jù)反義RNA基因沉默原理構(gòu)建反義表達(dá)載體。1)克隆CUC3保守區(qū)的兼并引物Primerl:5'-ATTACT/CTTT/CTACTTAGCTTCCAAAA/G-3'Primer2:5'-CCTTTGTAGAAC/AACC/AAA/GC/TGTC/TTTCTTC-3'2)克隆到的CUC3保守區(qū)cDNA序列及同源性比較克隆到的CUC3保守區(qū)cDNA全長為287bp，編碼95個氨基酸，將此氨基酸序列與NCBIGenebank中其它植物編碼CUC3基因的核苷酸序列相比較表明羅布麻CUC3基因保守區(qū)與矮牽牛，擬南芥，大豆和水稻相應(yīng)區(qū)域核苷酸序列的同源性分別為76%、75%、75%和74%，與公布的CUC3，CUC2，CUC1相應(yīng)保守區(qū)氨基酸序列的同源性為77%，73%，68%。這說明利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)獲得了編碼羅布麻CUC3基因的保守區(qū)cDNA。該保守區(qū)的序列如下5SEQ.ID.NO1的信息a)序列特征長度287個核苷酸類型核酸鏈型雙鏈b)分子類型cDNAC)假設(shè)否d)反義否e)最初來源羅布麻f)序列描述SEQ.ID.NO11ATTACCTTTTACTTAGCTTCCAAAGTCTTATACGGACGCTTCTGTGGACTCGACATTGCT121AGAGAGTGGTACCTTTTCAGCTTAAGGGACAGGAAGTACCCAACGGGGCTGAGAACAAAT181AGAGCCACTTGTGCCGGGTACTGGAAAGCAACGGGGAAAGATAGAGAAGTCTACGGCAGT241GAAGGCGTTGTTGTGGGCATGAAGAAGACATTTGTnTCTACAAAGGSEQ.ID.NO2'的信息(a)序列特征長度95個氨基酸類型氨基酸鏈型單鏈(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述SEQ.ID.NO261RATCAGYWKATGKDREVYGSEGVVVGMKKTFVFYK2.基因沉默載體的構(gòu)建；將RT-PCR的目的產(chǎn)物片段連入克隆載體pEASY-Tl，然后進(jìn)行DNA序列分析，測序結(jié)果與Genebank中序列進(jìn)行同源性比較；將測序正確的CUC3基因片段用ZkJ和Sac/從pEASY-Tl切下，反向插入含有35S啟動子和NOS終止子的表達(dá)載體pCAMBIA-1301，構(gòu)建成反義表達(dá)載體pCAMBIA-1301-CUC3。3.通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移；采用凍融法將反義表達(dá)載體pCAMBIA1301-CUC3導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌，涂布含卡納霉素(50-100mg/L)的YEB平板后，在28'C恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2天后，挑取單菌落，用PCR方法進(jìn)行檢測。檢測為陽性的克隆用于感染羅布麻真葉、莖、子葉節(jié)，子葉，下胚軸，根等不同外植體部位。4.羅布麻的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株再生；用導(dǎo)入反義表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌感染羅布麻上述不同外植體部位。感染后的外植體在黑暗條件下共培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)至含有500mg/L頭孢霉素的MS培養(yǎng)6基，25±1°C，14h/10h光/暗培養(yǎng)，每隔5-7天轉(zhuǎn)接一次，共轉(zhuǎn)接3-5次，感染后約7-10天產(chǎn)生毛狀根。待毛狀根長至2-3cm，用PCR方法進(jìn)行檢測。將檢測為陽性的根切下轉(zhuǎn)至50mg/L卡那霉素和300mg/L頭孢霉素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，待篩選到的芽長至2-3cm高時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，經(jīng)過2-3周培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化植株生根并長成完整再生植。5.轉(zhuǎn)基因植株的檢測和篩選；對轉(zhuǎn)基因植株采取三步法篩選。第一步，通過采用PCR和Southernblot方法檢測轉(zhuǎn)基因植株的目的基因。第二步，對檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)行煉苗后，移栽到大田培養(yǎng)。在一個生長季后，對其分枝數(shù)進(jìn)行單株統(tǒng)計(jì)，與同時期野生型種子苗比較后，篩選獲得分枝較少的轉(zhuǎn)基因羅布麻株系。第三步，多代篩選，將上一年收獲的種子，大田種植后，進(jìn)一歩反復(fù)篩選，以獲得穩(wěn)定的表型和種質(zhì)資源。本發(fā)明通過CUC3基因保守區(qū)基因片段的反義表達(dá)載體的構(gòu)建，可以提高目的基因的表達(dá)效率；通過建立羅布麻的高效、穩(wěn)定的發(fā)根遺傳轉(zhuǎn)化體系，提高了選育轉(zhuǎn)基因羅布麻株系的再生效率；可縮短育種周期，提高育種效率，得到分枝少的羅布麻新品種，這將促進(jìn)我國的羅布麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，而且也對其它作物及觀賞植物的分枝調(diào)控提供了一條新的途徑。技術(shù)路線1.兼并引物設(shè)計(jì)目前，僅擬南芥、水稻、矮牽牛、大豆等模式植物中的CUC3基因被克隆得到全長。因此要克隆CUC3基因的保守區(qū)，首先要檢索NCBI獲取CUC3在植物中已知的cDNA序列，然后使用序列比對工具DNAMAN對核苷酸序列進(jìn)行比對，得到目的基因的保守區(qū)域，在保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)兼并引物。序列如下Primerl:5'-ATTACT/CTTT/CTACTTAGCTTCCAAAA/G-3'Pri證2:5'-CCTTTGTAGAAC/AACC/AAA/GC/TGTC/TTTCTTC-3'2.羅布麻CUC3基因保守區(qū)克隆提取羅布麻幼苗植物總RNA。(參見J.薩姆布魯克，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，(第二版)，金冬雁等譯，1992，科學(xué)出版社)。以總RNA為模板，使用First-StandcDNASynthesisKit(上海申能博彩生物科技有限公司)，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一鏈，之后進(jìn)行RT-PCR，使用上述兼并引物。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后回收目的DNA片段，和TransGenBiotech公司的克隆載體pEASY-Tl連接成重組質(zhì)粒p-EASY-CUC3，熱激轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選。挑選白斑，搖菌，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR檢測和酶切分析。檢測正確的轉(zhuǎn)化子，由上海英俊生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果在基因文庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)序列比對，及同源性分析。選用與其他植物的CUC3基因序列同源性較高的克隆。73.反義表達(dá)載體的構(gòu)建通過DNAMAN對已知序列進(jìn)行酶切圖譜分析。CUC3保守區(qū)基因片段要反向插入含35S啟動子和終止子的表達(dá)載體pCAMBIA-1301。在克隆載體及表達(dá)載體上選取合適的酶切位點(diǎn)。分別選取了和Sac/進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，回收目的片段用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-CUC3。轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞篩選陽性連接子，進(jìn)行PCR檢測和酶切分析。4.反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌將檢測連接正確的克隆，提取質(zhì)粒。采用凍融法將反義表達(dá)載體導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，28'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天。挑選單克隆進(jìn)行菌落PCR檢測(圖1)。檢測正確的克隆培養(yǎng)后用于感染羅布麻外植體，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。5.羅布麻的轉(zhuǎn)化體系及轉(zhuǎn)基因再生體系的建立導(dǎo)入反義表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌通過葉盤法感染羅布麻不同外植體部位，產(chǎn)生毛狀根(圖2)。通過頭孢霉素殺菌和卡那霉素抗性篩選后得到的陽性根系，用CTAB法提取基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測。對農(nóng)桿菌T-DNA的檢測根據(jù)Ri質(zhì)粒Tl-DNA上的rolC基因設(shè)計(jì)引物。目的產(chǎn)物為574bp(圖3)。rolC基因F引物5'-GATATATGCCAAATTTACACTAG-3，rolC基因R引物5，-GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3，檢測為陽性的發(fā)根，在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)出芽，生根培養(yǎng)基上生根，得到羅布麻轉(zhuǎn)基因再生植株(圖4)。6.轉(zhuǎn)基因植株目的基因的檢測通過CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，采用PCR和Southernblot方法檢測轉(zhuǎn)基因植株的目的基因。PCR檢測采用上述克隆CUC3保守區(qū)基因片段的兼并引物，目的片段287bp.Southernblot檢測再生植株總DNA(10#g)經(jīng)州"d///完全酶解后進(jìn)行Southern雜交。DNA探針為35S啟動子-CUC3保守區(qū)基因片段的全部序列，按TAKaRa公司的隨機(jī)弓|物法地高辛標(biāo)記試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記。7.分枝較少的轉(zhuǎn)基因株系的篩選對轉(zhuǎn)基因植株采取三歩法篩選。第一步，通過采用PCR和Southernblot方法檢測轉(zhuǎn)基因植株的目的基因。第二歩，對檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)行煉苗后，移栽到大田培養(yǎng)。在一個生長季后，對其分枝數(shù)進(jìn)行單株統(tǒng)計(jì)，與同時期野生型種子苗比較后，篩選獲得分枝較少的轉(zhuǎn)基因羅布麻株系。第三步，多代篩選。將上一年收獲的種子，大田種植后，進(jìn)一步反復(fù)篩選，以獲得穩(wěn)定的表型和種質(zhì)資源。8圖1:重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-CUC3轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌R1601后PCR檢測。1:陰性對照2-10:陽性克隆圖2:發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化羅布麻外植體后生成的發(fā)根圖3:發(fā)根PCR檢測1-2:發(fā)根農(nóng)桿菌質(zhì)粒陽性對照PCR結(jié)果；3-4:發(fā)根基因組DNAPCR結(jié)果圖4:通過發(fā)根途徑再生轉(zhuǎn)基因苗具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:羅布麻CUC3基因保守區(qū)的克隆1.羅布麻總RNA的提取將組培6-8周的羅布麻幼苗按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的Trizol法提取植物總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測。2.反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR:使用上海申能博彩生物科技有限公司的First-StandcDNASynthesisKit，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一鏈，以cDNA第一鏈為模板，用設(shè)計(jì)的兼并引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。3.目的片段與克隆載體連接，篩選陽性克隆PCR電泳產(chǎn)物回收后與TransGenBiotech公司的pEASY-Tl克隆載體連接，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞后，在含有氨芐青霉素和卡那霉素/IPTG/X-Gal的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，37'C倒置培養(yǎng)12-20小時，有的菌落為白色，有的變?yōu)樗{(lán)色。選取白色菌落，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行酶切和PCR鑒定。4.序列測定上海英俊生物技術(shù)有限公司完成測序。實(shí)施例2:羅布麻CUC3基因保守區(qū)基因片段序列信息SEQ.ID.NO1的信息g)序列特征長度:287個核苷酸類型:核酸鏈型雙鏈h)分子類型:cDNAi)假設(shè)否j)反義否k)最初來源羅布麻1)序列描述:SEQ.ID.NO11ATTACCmTA61GAAGTCGACCTCAACAGATGTGAGCCATGGGAGCTTCCCGATGCAGCTAAGATGGGAGAG121AGAGAGTGGTACCTTFTCAGCTTAAGGGACAGGAAGTACCCAACGGGGCTGAGAACAAAT241GAAGGCGTTGTTGTGGGCATGAAGAAGACATTTGTnTCTACAAAGGSEQ.ID.NO2的信息(d)序列特征長度95個氨基酸類型氨基酸鏈型單鏈(e)分子類型蛋白質(zhì)(f)序列描述SEQ.ID.N0261RATCAGYWKATGKDREVYGSEGVVVGMKKTFVFYK實(shí)施例3:反義表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化1.反義表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶^fl/和Sflc/將CUC3保守區(qū)序列從pEASY-Tl克隆載體上切下，用相同限制性內(nèi)切酶酶切表達(dá)載體pCAMBIA1301，分別回收目的片段。用T4DNA連接酶于16'C連接16h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，用卡那霉素抗性進(jìn)行篩選。挑選單克隆進(jìn)行PCR檢測和酶切分析。2.反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌使用凍融法。取6/d構(gòu)建好的質(zhì)粒pCAMBIA-1301-CUC3轉(zhuǎn)入到剛制好的發(fā)根農(nóng)桿菌R1601感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30min。浸入液氮中5min，37。C水浴5min，加入500W空YEB，28°C，150-160rpm，搖3-5h。在含有卡那霉素的YEB固體平板上，28'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。實(shí)施例4:羅布麻發(fā)根培養(yǎng)體系建立將轉(zhuǎn)入反義表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌R1601，RIOOO，LBA9402活化2-3次，挑取單克隆，在含卡那霉素(50mg/L)的YEB的液體培養(yǎng)基，28°C，200r/min，過夜培養(yǎng)。次R按1:50體積比擴(kuò)大培養(yǎng)3-5h，在對數(shù)生長期，OD600值為0.5-1.0用于感染。3500r/mhi收集菌體，用pH5.80的相同體積的MS培養(yǎng)基稀釋后，分別對羅布麻的真葉、莖、子葉節(jié)等不同部位外植體感染20-30min，7-10天后陸續(xù)有毛狀根長出。以無菌水沖洗后轉(zhuǎn)入含頭孢霉素500mg/L的MS固體培養(yǎng)基上，25±1°C，14h/10h光/暗培養(yǎng)。5-7天轉(zhuǎn)接一次，共轉(zhuǎn)接3-5次，脫菌至無菌。3種發(fā)根農(nóng)桿菌對羅布麻子葉節(jié)的發(fā)根誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)密度如表1所示。毛狀根誘導(dǎo)率=產(chǎn)生毛狀根的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)毛狀根誘導(dǎo)密度=產(chǎn)生毛狀根的總數(shù)/產(chǎn)生毛狀根的外植體數(shù)表l不同菌株對羅布麻子葉節(jié)毛狀根的誘導(dǎo)率<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例5:羅布麻轉(zhuǎn)基因植株發(fā)根途徑再生待毛狀根長至2-3cm長，切下，用CTAB法提取基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測。檢測為陽性的發(fā)根，轉(zhuǎn)入無激素固體1/2MS芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，2-3周后出現(xiàn)芽點(diǎn)，不定芽長到2-4厘米，切下轉(zhuǎn)入含IBA0.2-0.4mg/1的1/MS根誘導(dǎo)培養(yǎng)基，2-3周長出根。上述三種發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的發(fā)根的再生植株誘導(dǎo)率如表2所示。再生植株誘導(dǎo)率產(chǎn)生再生植株總數(shù)/接種的發(fā)根數(shù)表2不同菌株來源的發(fā)根的再生植株的的誘導(dǎo)率<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例6:轉(zhuǎn)基因植株目的基因的檢測轉(zhuǎn)基因羅布麻PCR檢測采用上述克隆CUC3保守區(qū)基因片段的兼并引物，目的片段287bp.PCR檢測結(jié)果表明，在64株檢測植株中有50株為PCR陽性，擴(kuò)增出了與目的基因片段相同的分子量條帶，而對照植株未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。轉(zhuǎn)基因羅布麻Southernblot檢測用35S啟動子_目的基因序列作為探針與轉(zhuǎn)基因再生植株的DNA雜交，在PCR陽性植株中，80%的植株轉(zhuǎn)基因真實(shí)性經(jīng)Southern雜交分析得到證實(shí)，含有一至多條雜交帶。實(shí)施例7:分枝較少的轉(zhuǎn)基因株系的篩選將得到的40株轉(zhuǎn)基因羅布麻株系，進(jìn)行煉苗后，移栽到大田培養(yǎng)。在一個生長季后，對其分枝數(shù)進(jìn)行單株統(tǒng)計(jì)，與同時期1000株大田種植的野生型種子苗比較后，篩選獲得分枝較少的轉(zhuǎn)基因羅布麻株系，之后進(jìn)行多代篩選。將上一年收獲的種子，大田種植后，進(jìn)一步反復(fù)篩選，以獲得穩(wěn)定的表型和種質(zhì)資源。權(quán)利要求1.一種通過基因沉默控制羅布麻分枝的方法，其特征是(1).羅布麻分枝調(diào)控基因CUC3保守區(qū)的克?。粦?yīng)用RT-PCR方法，提取羅布麻總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，以cDNA為模板克隆分枝調(diào)控基因CUC3保守區(qū)基因片段，并根據(jù)反義RNA基因沉默原理構(gòu)建反義表達(dá)載體；CUC3基因片段的克隆從羅布麻無菌種子苗中制備總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生cDNA第一鏈，再以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，根據(jù)Genebank中收錄的CUC3基因保守區(qū)的序列設(shè)計(jì)1對兼并引物，其序列為Primer15′-ATTACT/CTTT/CTACTTAGCTTCCAAAA/G-3′；Primer25′-CCTTTGTAGAAC/AACC/AAA/GC/TGTC/TTTCTTC-3′(2).基因沉默載體的構(gòu)建；將RT-PCR的目的產(chǎn)物片段插入克隆載體pEASY-T1，然后進(jìn)行DNA序列分析，測序結(jié)果與Genebank中序列進(jìn)行同源性比較；將測序正確的CUC3基因片段用XbaI和SacI從pEASY-T1切下，反向插入含有35S啟動子和NOS終止子的表達(dá)載體pCAMBIA-1301，構(gòu)建成反義表達(dá)載體pCAMBIA-1301-CUC3；(3).通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移；采用凍融法將反義表達(dá)載體pCAMBIA1301-CUC3導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌，涂布含卡那霉素(50-100mg/L)的YEB平板后，在28℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2天后，挑取單菌落，用PCR方法進(jìn)行檢測，檢測為陽性的克隆用于感染羅布麻真葉、莖、子葉節(jié)，子葉，下胚軸，根等不同外植體部位；(4).羅布麻的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株再生；用導(dǎo)入反義表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌感染羅布麻上述不同外植體部位，感染后的外植體在黑暗條件下共培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)至含有500mg/L頭孢霉素的MS培養(yǎng)基，25±1℃，14h/10h光/暗培養(yǎng)，每隔5-7天轉(zhuǎn)接一次，共轉(zhuǎn)接3-5次，感染后約7-10天產(chǎn)生毛狀根，待毛狀根長至2-3cm，用PCR方法進(jìn)行檢測，將檢測為陽性的根切下轉(zhuǎn)至50mg/L卡那霉素和300mg/L頭孢霉素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，待篩選到的芽長至2-3cm高時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，經(jīng)過2-3周培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化植株生根并長成完整再生植株；(5).轉(zhuǎn)基因植株的檢測和篩選；對轉(zhuǎn)基因植株采取三步法篩選，第一步，通過采用PCR和Southernblot方法檢測轉(zhuǎn)基因植株的目的基因，第二步，對檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)行煉苗后，移栽到大田培養(yǎng)，在一個生長季后，對其分枝數(shù)進(jìn)行單株統(tǒng)計(jì)，與同時期野生型種子苗比較后，篩選獲得分枝較少的轉(zhuǎn)基因羅布麻株系，第三步，多代篩選，將上一年收獲的種子，大田種植后，進(jìn)一步反復(fù)篩選，以獲得穩(wěn)定的表型和種質(zhì)資源。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過基因沉默控制羅布麻分枝的方法，其特征在于克隆得到的CUC3基因保守區(qū)基因片段的核苷酸序列為1ATTACCinTACTTAGCTTCCAAAGTCTTATACGGACGCTTCTGTGGACTCGACATTGCT121AGAGAGTGGTACCTTTTCAGCTTAAGGGACAGGAAGTACCCAACGGGGCTGAGAACAAAT241GAAGGCGTTGTTGTGGGCATGAAGAAGACATITGTnTCTACAAAGG3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過基因沉默控制羅布麻分枝的方法，其特征在于該克隆得到的基因片段編碼的氨基酸序列為1ITFYLASKVLYGRFCGLDIAEVDLNRCEPWELPDAAKMGEREWYLFSLRDRKYPTGLRTN61RATCAGYWKATGKDREVYGSEGVVVGMKKTFVFYK4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種通過基因沉默控制羅布麻分枝的方法，其特征是所述發(fā)根農(nóng)桿菌的培養(yǎng)條件是基本培養(yǎng)基為YEB培養(yǎng)基(pH=7.0)，溫度為28°C，轉(zhuǎn)數(shù)為160-200r/min，對發(fā)根的最佳誘導(dǎo)濃度范圍為OD600=0.5-1.0。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過基因沉默控制羅布麻分枝的方法，其特征是所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方是1/2MS，生根培養(yǎng)基的配方是IBA0.2-0.4mg/L+1/2MS。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種通過基因沉默控制羅布麻分枝的方法，其特征是所述羅布麻品種包括羅布紅麻(v4iocywwmvewe加mZiww)和羅布白麻7.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種通過基因沉默控制羅布麻分枝的方法，其特征是所述的發(fā)根農(nóng)桿菌為R1601,RIOOO，LBA9402，ATCC15834，ATCC39207，G58P，GV3296,NCPPB2659,R1500,R1600,TR105。全文摘要本發(fā)明涉及一種通過基因沉默控制羅布麻分枝的方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。根據(jù)NCBIGenebank公布的已知CUC3基因cDNA序列，設(shè)計(jì)兼并引物，利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)進(jìn)行目的片段克??；篩選的陽性克隆進(jìn)行酶切、PCR鑒定、DNA測序以及核苷酸序列同源性比較，獲得羅布麻CUC3基因的保守區(qū)基因片段；構(gòu)建反義表達(dá)載體，通過發(fā)根農(nóng)桿菌途徑轉(zhuǎn)化羅布麻；由羅布麻發(fā)根途徑實(shí)現(xiàn)植株再生，以達(dá)到控制羅布麻分枝的目的。文檔編號C12N15/82GK101497884SQ20081005713公開日2009年8月5日申請日期2008年1月30日優(yōu)先權(quán)日2008年1月30日發(fā)明者王曉東,賈海燕,兵趙申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所