專利名稱：快速檢測(cè)文心蘭上的鳳仙花壞死斑病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及文心蘭種 苗的鳳仙花壞死斑病毒的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
文心蘭又名跳舞蘭、金碟蘭，是多年生草本花卉，原產(chǎn)中南美洲和北美 洲南部。以花色鮮艷，花型豐富而成為世界上重要的蘭花品種之一?，F(xiàn)世界 各地均有栽培。隨著蘭花種植范圍的擴(kuò)大和無性繁殖技術(shù)的應(yīng)用，蘭花上的病毒病的發(fā)生也日趨嚴(yán)重。已報(bào)道感染蘭花的病毒病達(dá)27種，其中文心蘭上 常見的病毒病是建蘭花葉病毒(0^6/V/咖/i70w/c CyMV)和齒蘭環(huán)斑 病毒(^/0/ "《A ^咖_r//^57 W 「/r〃s， 0RSV)。目前的研究主要集中在這兩 種病毒檢測(cè)上。近幾年，番東斑萎病毒屬(7bwow'/T^)病毒在我國臺(tái)灣和 云南的蘭花上出現(xiàn)，引起蘭花葉片環(huán)斑，黃化。蘭花的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值 遭到了嚴(yán)重影響。研究初步確定為番癡斑萎病毒屬病毒但沒有鑒定到種。鳳仙花壞死斑病毒(//ff/73〃e/ 5" / ecro/7c s/7。f r/rw， INSV)是布尼亞病 毒科Ww^^/W&e)，番茄斑萎病毒屬中發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)病毒，傳播介體為西 花薊馬，是番東斑萎病毒屬中寄主范圍較廣，危害較大的病害?？汕秩?0 個(gè)科300多種植物，其中觀賞植稱占39個(gè)屬、蔬菜占6個(gè)屬，包括馬蹄蓮、 菊花、唐菖蒲、黃瓜、辣椒和萵苣等常見花卉和重要經(jīng)濟(jì)作物。ISNV引起的 癥狀多樣，隨寄主和侵染時(shí)期不同而變化，主要表現(xiàn)為矮化、環(huán)斑、葉片或 莖部的褐色至紫色的斑點(diǎn)、莖部變褐(潰瘍)、碎色花，甚至植株死亡。綜上所述，文心蘭是蘭花產(chǎn)業(yè)中主要的品種之一，侵染蘭花的病毒種類 多，且目前研究主要針對(duì)常見的幾種蘭花病毒病害。另外，鳳仙花壞死斑病 毒因寄主范圍廣，傳播介體個(gè)體小，傳播速度和繁殖速度快的特點(diǎn)易對(duì)蘭花產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重危害，這是一個(gè)迫切需要解決的技術(shù)難題?，F(xiàn)有技術(shù)中尚未發(fā) 現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，填補(bǔ)鳳仙花壞死斑病毒檢測(cè)方面 的空白，提供快速檢測(cè)文心蘭上的鳳仙花壞死斑病毒的方法。 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明提供了快速檢測(cè)文心蘭上的鳳仙花壞死斑病毒的方法，包括下述
順序的步驟
(1)運(yùn)用上海華舜的植物葉總RNA提取試劑盒從表現(xiàn)同心圓褪綠斑癥 狀的文心蘭葉片上提取植物總RNA;
(2 )利用鳳仙花壞死斑病毒的特異性引物ZI2R把提取到的總RNA反轉(zhuǎn) 錄成cDNA;
(3) 運(yùn)用合成的cDNA,分別以特異性引物ZI2F/ZI2R和ZI1F/ZI1R進(jìn) 行擴(kuò)增，建立常規(guī)的PCR檢測(cè)方法；
(4) 對(duì)ZI1F/ZI1R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物再分別以ZI1F/ZI3R、 ZI3F/ZI1R、 ZI3F/ZI3R為內(nèi)引物進(jìn)行二次擴(kuò)增，建立巢式PCR檢測(cè)方法。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
首次在文心蘭植株上檢測(cè)到鳳仙花壞死斑病毒，也是首次在中國發(fā)現(xiàn) 該病毒，建立了鳳仙花壞死斑病毒的liT-PCR和巢式PCR的檢測(cè)方法。與常規(guī)
的生物學(xué)方法相比，本發(fā)明的檢測(cè)方法具有靈敏性高，特異性好等優(yōu)點(diǎn)，本 發(fā)明中提到的特異性引物及PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序能擴(kuò)增出與預(yù)期片段大 小一致的目的條帶。特別是當(dāng)病毒含量少時(shí)，使用巢式PCR能在靈敏性和特 異性方面比常規(guī)RT-PCR有進(jìn)一步的提高。本發(fā)明建立鳳仙花壞死斑病毒的檢 測(cè)方法對(duì)及時(shí)防治病毒對(duì)植株的侵害提供了有效的檢測(cè)手段。


圖l受病毒侵害的文心蘭上的癥狀；其中，(a)初期表現(xiàn)出褪綠圓斑 (b)逐漸表現(xiàn)出同心圓退綠斑(c)后期變成褐色壞死斑塊；
圖2RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)iyo瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，其中，l.表現(xiàn)癥 狀的病斑處樣品2.表現(xiàn)癥狀的遠(yuǎn)離病斑處的樣品3.與病斑鄰近的葉片 4.健康植株對(duì)照；
圖3N基因上539bp序列比對(duì)聚類圖4巢式PCR;其中，1: ZI1F和ZI3R擴(kuò)增產(chǎn)物；2: ZI3F和ZI1R擴(kuò) 增產(chǎn)物；3: ZI3F和ZI3R ;
圖5常規(guī)PCR與巢式PCR靈敏性；其中，1-6:依次為1、 10、 l(T2、 10—3、 10"、 10-5倍稀釋后的常規(guī)PCR; 7-12:依次為1、 10、 l(T、 l(T3、 10一4、 10-5倍稀釋后的巢式PCR 。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)一步詳細(xì)描述。但它并不 是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
——RT-PCR檢測(cè)
從感病植株表現(xiàn)癥狀的部位、遠(yuǎn)離癥狀的葉尖和健康植株上取樣，提取 植物總RM,合成cDNA后分別以ZI2F和ZI2R作為特異引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò) 增。PCR反應(yīng)體系25nL:上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2pL、 10xPCR Buffer 3pL、 Mg2+(25raM)1.2iaL、 dNTP Mixture (各2. 5mM) 0. 4 y L、 ZI2F0. 4yL、 ZI2R0. 4 juL、 Taq酶(5U/yL) 0.2nL和滅菌水17.4juL。反應(yīng)程序94°C 5min; 94°C 30s、 45°C 30s、 72。C 40s, 30個(gè)循環(huán)；72°C 8min。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)iy。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2，表現(xiàn)癥狀 的葉片上經(jīng)PCR擴(kuò)增后，在500bp處可以看到與預(yù)期片段大小一致的目標(biāo)條帶 (見圖2 ，泳道l， 2)。從未表現(xiàn)癥狀的葉片上也擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小一 致的目標(biāo)條帶(見圖2，泳道3)。而陰性對(duì)照沒有特異性擴(kuò)增條帶。(圖2, 泳道4 )
利用大連寶生物公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，連接于 pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽性菌落，所 得重組質(zhì)粒經(jīng)酶切驗(yàn)證后，送大連寶生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明重組質(zhì)粒 插入片段全長為539bp, BLAST序列分析該片段的核苷酸序列與已經(jīng)報(bào)道的 INSV核苷酸序列同源性為99%。利用DNAMAN5. 2. 2軟件對(duì)不同地區(qū)樣品N基 因上的539bp序列分析發(fā)現(xiàn)，在所擴(kuò)增的區(qū)域中國云南文心蘭上INSV的分 離物(KMS6503 )與日本、意大利的分離物(GenBank登錄號(hào)為AB109100、 A菌803和DQ425096 )同源性為99%,與美國、荷蘭的分離物(GenBank登 錄號(hào)分別為D00914、 DQ523597、 DQ523598和X66972)同源性為9 8 % (見 圖3)。序列聚類結(jié)果表明中國云南文心蘭上發(fā)現(xiàn)的INSV可能是由日本、意 大利傳過來的。 實(shí)施例2
一一巢式PCR檢測(cè)
以ZI1F和ZI1R為外引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別以ZI1F 和ZI3R、 ZI3F和ZI1R、 ZI3F和ZI3R為內(nèi)引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。模板2yL、 10xPCR Buffer 3jaL、 Mg2+(25raM) 1. 2 n L、 dNTP Mixture (各2. 5mM) 0. 4 ja L、 上游引物0. 4jaL、下游引物0. 4juL、 Taq酶(5U/juL)0. 2juL和滅菌水17.4jjL。反應(yīng)程序94°C 5min; 94°C 30s、 52°C 30s、 72°C 40s， 30個(gè)循環(huán)； 72°C 8min。
同時(shí)將cDNA以10倍、10—2倍、10—3倍、10—4倍、10—5倍稀釋后先用引物ZI1F 和ZI1R進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，然后以ZI3F和ZI3R為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增來驗(yàn)證巢 式PCR的敏感性。
r/。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示ZIlF和ZI3R擴(kuò)增片段850bp;ZI3F和 ZI1R 452bp; ZI3F和ZI3R 338bp(見圖4)。 cDNA濃度梯度稀釋進(jìn)行常規(guī)PCR 和巢式PCR電泳結(jié)果顯示巢式PCR能檢測(cè)到1(T3倍(見圖5)。 1-6:依次為l、 10、 10—2、 l(T3、 l(T4、 1(T5倍稀釋后的常規(guī)PCR， 7-12:依次為l、 10、 10-2、 l(T3、 10—4、 10—5倍稀釋后的巢式PCR
所述的特異性引物為
ZI 1F: 5'-TATTTCACACGCAAACCCTT-3。
ZI 1R: 5LGATGAACAAAGCAAAGATTACC-3,;
ZI2F: 5'-GTTTAGCCTTACCAAT-3';
ZI2R: 5'-TACCAACAACCGTGAA-3、
ZI3F: 5'-CTAAGAGAACACCCAAGACA-3^
ZI 3R: 5^TACCAACAACCGTGAAAAGA-y。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)文心蘭上的鳳仙花壞死斑病毒的方法，其特征在于包括以下步驟(1)運(yùn)用上海華舜植物葉總RNA提取試劑盒從表現(xiàn)同心圓褪綠斑癥狀的文心蘭葉片上提取總RNA；(2)利用鳳仙花壞死斑病毒的特異性引物ZI2R把提取到的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；(3)運(yùn)用合成的cDNA，分別以特異性引物ZI2F/ZI2R和ZI1F/ZI1R進(jìn)行擴(kuò)增，建立RT-PCR檢測(cè)方法。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)方法，其特征在于進(jìn)一步包括對(duì) ZI1F/ZI1R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物再分別以ZI1F/ZI3R、 ZI3F/ZI1R、 ZI3F/ZI3R為 內(nèi)引物進(jìn)行二次擴(kuò)增，建立巢式PCR檢測(cè)方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)文心蘭上的鳳仙花壞死斑病毒的方法。本方法運(yùn)用鳳仙花壞死斑病毒抗血清從表現(xiàn)同心圓褪綠斑癥狀的文心蘭葉片上檢測(cè)到鳳仙花壞死斑病毒；利用鳳仙花壞死斑病毒的特異性引物ZI2R合成cDNA；運(yùn)用合成的cDNA，分別以特異性引物ZI2F/ZI2R和ZI1F/ZI1R進(jìn)行擴(kuò)增，建立RT-PCR檢測(cè)方法。本法還可對(duì)ZI1F/ZI1R擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物再分別以ZI1F/ZI3R、ZI3F/ZI1R、ZI3F/ZI3R為內(nèi)引物進(jìn)行二次擴(kuò)增，建立巢式PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明靈敏性高，特異性好，為及時(shí)防治鳳仙花壞死斑病毒對(duì)植株的侵害提供了有效的檢測(cè)手段。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101307366SQ20081005861
公開日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2008年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月1日
發(fā)明者丁元明, 毅 劉, 劍 周, 捷 和, 和萬忠, 張巧萍, 段祿華 申請(qǐng)人:云南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心