專利名稱：：2型糖尿病疫苗的構(gòu)建和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種2型糖尿病疫苗的構(gòu)建和制備方法，屬于醫(yī)學(xué)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：糖尿病已成為繼癌癥、心腦血管病之后引起死亡的第三大殺手。流行病學(xué)研究表明，我國已成為世界上第二大糖尿病國家。目前，我國糖尿病發(fā)病人數(shù)達(dá)4000萬,至2010年發(fā)病人數(shù)將達(dá)到6000萬，其中90%以上是2型糖尿病，而且隨著病程進(jìn)展，2型糖尿病患者將出現(xiàn)許多嚴(yán)重并發(fā)癥，腎功能衰竭、心血管疾病和腦血管意外等，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量甚至死亡。新近發(fā)現(xiàn)，由脂肪組織分泌的脂肪細(xì)胞因子視黃醇結(jié)合蛋白一4(retinolbindingprotein,簡稱RBP-4，以下同)是肥胖癥和胰島素抵抗之間的關(guān)聯(lián)因子。在肥胖癥和2型糖尿病患者的部分脂肪細(xì)胞中，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的GLUT4的表達(dá)量低于常人。敲除了小鼠體內(nèi)的Glut4(也常被稱為Slc2a4)基因(adipose—Glut4(-/-)型)后，在小鼠的肌肉和肝臟部位出現(xiàn)對胰島素的抵抗性。利用DNA陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)，adipose-Glut4(-/-)型小鼠脂肪組織中的視黃醇結(jié)合蛋白一4(RBP-4)的表達(dá)量是增加的。另外，在對胰島素不敏感性增加的小鼠及患有肥胖癥、2型糖尿病的患者體內(nèi)，其血清中RBP-4的含量明顯增加。RBP-4的水平還可以受羅格列酮(rosiglitazone，一種胰島素敏感性藥物)的調(diào)節(jié)以維持正常穩(wěn)態(tài)。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)過表達(dá)人源RBP-4或?qū)⒅亟MRBP-4注射到正常小鼠體內(nèi)，可以引起機(jī)體對胰島素的抵抗。相反，將RBP-4基因敲除后，機(jī)體對胰島素的敏感性增加。而血清中RBP-4含量的增加，會刺激肝臟表達(dá)葡糖異生酶——烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PEPCK),并削弱肌肉組織中的胰島素信號傳導(dǎo)途徑。因此，RBP-4是一種源于脂肪細(xì)胞的"信號"，降低RBP-4的水平則可能成為治療2型糖尿病的一個新的途徑。這種信號對闡明2型糖尿病的發(fā)病機(jī)理有重要病理生理學(xué)意義。另外，利用噬菌體展示技術(shù)研制基因工程抗原具有多種優(yōu)勢(1)噬菌體作為表達(dá)產(chǎn)物的載體展示的是生物體自身翻譯機(jī)制產(chǎn)生的天然構(gòu)象產(chǎn)物，能很好的誘發(fā)機(jī)體的抗原-抗體免疫反應(yīng)；(2)噬菌體有強(qiáng)的免疫原性，是天然的免疫佐劑，在噬菌體表面表達(dá)的多肽易于接近抗體，容易被免疫系統(tǒng)識別；(3)噬菌體可以募集T輔助細(xì)胞，而且噬菌體顆粒的不對稱性有利于引發(fā)T細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng)；(4)由于噬菌體顆粒是由感染的細(xì)菌細(xì)胞分泌，噬菌體顆粒可以方便的大規(guī)模生產(chǎn)抗原用抗原表位，還可以在同一噬菌體上展示多個具有保護(hù)性作用的抗原決定簇，構(gòu)建多價抗原；(5)純化簡單、花費(fèi)少；(6)噬菌體顆粒穩(wěn)定，對理化因素的抵抗力強(qiáng)。由于應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)研究基因工程抗原具有以上的優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)抗原和其它基因工程抗原產(chǎn)量不高、純化復(fù)雜等缺陷，對新型抗原的開發(fā)具有重要意義。2型糖尿病已成為我國嚴(yán)重的個人健康問題和社會問題，就目前的藥物治療尚不能治愈2型糖尿病，且長期服藥將帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，基于新發(fā)現(xiàn)的RBP-4在2型糖尿病發(fā)病過程中的始動作用，以及RBP-4是通過脂肪細(xì)胞分泌到血液中，達(dá)到肌肉組織及肝臟發(fā)揮功能的特點(diǎn)，我們提出一個預(yù)防治療2型糖尿病的免疫干預(yù)新思路，即以RBP-4為耙點(diǎn)，以噬菌體為載體，將RBP-4基因或其表位展示在噬菌體表面，構(gòu)建成噬菌體為載體的復(fù)合抗原，即構(gòu)建I重組噬菌體疫苗，免疫機(jī)體后，產(chǎn)生抗RBP-4或其表位的抗體，中和血液中的RBP-4，降低RBP-4的量，最終逆轉(zhuǎn)或減輕胰島素抵抗及2型糖尿病，因此用它治療2型糖尿病，可徹底改變傳統(tǒng)藥物治療存在的諸多不足或問題，必將產(chǎn)生極大的經(jīng)濟(jì)效益和社會意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個目的就是提供一種2型糖尿病疫苗的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第二個目的就是為解決目前藥物治療2型糖尿病存在的不足，提供一種2型糖尿病疫苗的制備方法，使疫苗免疫機(jī)體后，刺激產(chǎn)生針對RBP-4的特異性抗體，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)的RBP-4水平，從而達(dá)到預(yù)防和治療2型糖尿病的目的。本發(fā)明的第一個目的通過下列技術(shù)方案完成一種2型糖尿病疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于經(jīng)過下列步驟(1)在蛋白編碼序列如下(549bp，編碼183個aa)的人視黃醇結(jié)合蛋白一4(retinolbindingprotein,簡稱RBP-4，以下同)的編碼序列前添加啟動密碼子ATG:CATAACGGCTATTGCGATGGCCGTAGCGAACGTAACCTGCTG;(2)將添加起始密碼子ATG的人RBP-4蛋白基因片段的5'端引入EcoRI的酶切位點(diǎn)GAATTC，3'端引入HindIII酶切位點(diǎn)AAGCTT，合成插入pGEM-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒RBP/T;(3)將合成構(gòu)建得到的質(zhì)粒RBP/T轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10F'感受態(tài)細(xì)胞，克隆擴(kuò)增，大量提取質(zhì)粒RBP/T;(4)從質(zhì)粒RBP/T上用EcoRI和HindIII雙酶切下目的片段，插入T7Select10-3b多克隆位點(diǎn)的EcoRI和HindIII之間，使其正好位于T710B基因的3'端，使人RBP-4蛋白與T7IOB表達(dá)成融合蛋白，構(gòu)建成為重組噬菌體RBP/T7。所述步驟(3)的質(zhì)粒RBP/T克隆擴(kuò)增方法是將合成構(gòu)建得到的質(zhì)粒RBP/T轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10F'感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB固體培養(yǎng)基平板(Ampr)，37'C倒置培養(yǎng)過夜，挑取LB固體培養(yǎng)基平板(Ampr)中的單菌落至裝有5mlLB液體培養(yǎng)基(Ampr)的試管中，于恒溫?fù)u床37'C，150rpm/min過夜培養(yǎng)，次日將該5ml菌液接種800mlLB液體培養(yǎng)基(Ampr)，于恒溫?fù)u床37'C，150rpm/min過夜培養(yǎng)，次日收獲菌液。用質(zhì)粒大量抽提試劑盒從克隆擴(kuò)增收獲的菌液中提取RBP/T重組質(zhì)粒。所述步驟(4)的質(zhì)粒RBP/T雙酶切、融合蛋白構(gòu)建的方法是A、RBP/T重組質(zhì)粒EcoRI和HindIII雙酶切，大量提取得到的重組質(zhì)粒RBP/T用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系如下10XMbuffer120y1EcoRI60y1HindIII60iilRBP/T960P1總體積1200u137'C水浴60min，1%瓊脂糖凝膠電泳、用小量膠回收試劑盒回收目的片段；B、T7噬菌體載體的處理及準(zhǔn)備，將T7Select10-3b載體用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切，并回收酶切產(chǎn)物，T7Select10-3b載體雙酶切體系如下10XMBuffer2ix1EcoRI1u1HindIIIliilT7Select10-3b1H2011u1總體積20u137'C水浴60min，按DNA片段純化的操作用小量膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物；C、RBP片段與T7載體的連接，RBP/T重組質(zhì)粒EcoRI和HindIII雙酶切電泳后的膠回收所得的目的片段與T7Select10-3b載體雙酶切后，回收所得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，其連接反應(yīng)體系T7Select10-3b的回收產(chǎn)物0.5u1RBP/T質(zhì)粒EcoRI和HindIII雙酶切電泳后的膠回收產(chǎn)物2u1SolutionI2.5uI總體積5iU室溫連接過夜，得RBP/T7重組噬菌體。本發(fā)明的第二個目的通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種2型糖尿病疫苗的制備方法，其特征在于將人RBP-4蛋白與T7IOB表達(dá)成融合蛋白，并構(gòu)建成的重組噬菌體RBP/T7，在大腸桿菌株BLT5403中擴(kuò)增后，按收獲噬菌體，測定噬菌體的滴度，滴度按pfu/ml計(jì)數(shù)，數(shù)值上等于"噬斑數(shù)X稀釋倍數(shù)X10"，調(diào)整噬菌體濃度為所需滴度，按1:4000體積比加入甲醛，用常規(guī)方法滅活，得2型糖尿病疫苗。所述2型糖尿病疫苗的具體制備方法是①將甘油凍存的E.coliBLT5403菌株在LB固體培養(yǎng)基ampr平板上劃線接種，37'C過夜培養(yǎng);②從平板上挑取單菌落接種5mlLB培養(yǎng)基，37°C、150卬m振蕩過夜；③過夜培養(yǎng)的E.coliBLT5403菌液按1:100比例分別接種5ml、500mlLB液體培養(yǎng)基ampr各一份，37°C、150rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.60.8，時間為3h，得新鮮E.coliBLT5403菌液，存放于4'C備用；接種50y1高滴度RBP/T7噬菌體種子至5ml新鮮E.coliBLT5403菌液，其0D600=0.60.8，37°C、150rpm培養(yǎng)13h至菌液澄清并出現(xiàn)細(xì)絲狀殘片；⑤將所得5ml噬菌體液接種至500ml新鮮E.coliBLT5403菌液，其0D600=0.60.8，37°C、150rpm培養(yǎng)l3h至菌液澄清并出現(xiàn)細(xì)絲狀殘片；⑥所得噬菌體液4。C離心10000rpm，10min，取上清，加入29.3g1M的固體NaCl，振搖至溶解，促進(jìn)細(xì)菌碎片沉淀，4'Clh或過夜；⑦4'C，10000rpm離心10min，收集上清加入50g10。/。的PEG8000，振蕩至完全溶解后，4。C過夜；⑧4。C，10000rpm離心30min，棄上清；⑨所得沉淀物用10ml噬菌體稀釋液，即1MNaCl，10mMTris-HC1，pH8.0，lmMEDTA，劇烈抽提后，4°C、10000rpm離心15min,收集上清；⑩余下的沉淀物再重復(fù)一次⑨步驟，即用10ml噬菌體稀釋液劇烈抽提后，4°C、10000rpra離心15min，收集上清，合并收集的上清之后保存。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明基于新發(fā)現(xiàn)的RBP-4在2型糖尿病發(fā)病過程中的始動作用，以及RBP-4是通過脂肪細(xì)胞分泌到血液中，達(dá)到肌肉組織及肝臟發(fā)揮功能的特點(diǎn)，將RBP-4蛋白或其抗原表位插入到噬菌體中，通過展示表達(dá)在噬菌體表面，形成一個外源性的抗原復(fù)合物，經(jīng)免疫進(jìn)入機(jī)體后，通過抗原呈遞系統(tǒng)，誘導(dǎo)針對噬菌體和RBP-4或其表位的特異性抗體，抗RBP-4或其表位的特異性抗體與血液中的RBP-4蛋白結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，從而被機(jī)體清除，進(jìn)而降低RBP-4在體內(nèi)的含量，從而抑制RBP-4誘導(dǎo)的胰島素抵抗，最終達(dá)到預(yù)防治療2型糖尿病的目的。經(jīng)試驗(yàn)，構(gòu)建的重組噬菌體疫能夠有效降低KKAy小鼠血糖、甘油三酯和膽固醇，并能有效地保護(hù)KKAy小鼠，避免了其血糖水平的升高，同時增強(qiáng)了KKAy小鼠對葡萄糖灌胃和胰島素注射的耐受性。因此用它治療2型糖尿病，可徹底改變傳統(tǒng)藥物治療存在的諸多不足或問題。具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一歩詳述。實(shí)施例1、RBP編碼基因5，端添加GAATTCAATG，其中含有EcoRI的酶切位點(diǎn)GAATTC和起始密碼子ATG，二者間的一個A為調(diào)整正確讀碼框所需，3'端添加AAGCTT為HindIII酶切位點(diǎn)，將該序列送商業(yè)公司進(jìn)行人工合成并插入pGEM-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒RBP/T;2、質(zhì)粒RBP/T轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10F'感受態(tài)細(xì)胞，克隆擴(kuò)增及質(zhì)粒大量提取將合成構(gòu)建得到的質(zhì)粒RBP/T轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F'感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB固體培養(yǎng)基平板(Ampr)，37'C倒置培養(yǎng)過夜，挑取LB固體培養(yǎng)基平板(Ampr)中的單菌落至裝有5mlLB液體培養(yǎng)基(Ampr)的試管中，于恒溫?fù)u床37'C，150rpm/min過夜培養(yǎng)，次日將該5ml菌液接種800mlLB液體培養(yǎng)基(Ampr)，于恒溫?fù)u床37。C，150rpm/min過夜培養(yǎng)，次日收獲菌液。用質(zhì)粒大量抽提試劑盒從克隆擴(kuò)增收獲的菌液中提取RBP/T重組質(zhì)粒；3、RBP/T重組質(zhì)粒EcoRI和HindiII雙酶切大量提取得到的重組質(zhì)粒RBP/T用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系如下10XMbuffer120u1EcoRI60ii1Hindlll60ulRBP/T960ul總體積1200y137。C水浴60min，1%瓊脂糖凝膠電泳、用小量膠回收試劑盒回收目的片段；4、T7噬菌體載體的處理及準(zhǔn)備將T7Select10-3b載體用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Hindlll進(jìn)行雙酶切，并回收酶切產(chǎn)物，T7Select10_3b載體雙酶切體系如下10XMBuffer21EcoRI1y1HindllllixlT7Select10-3b5u1H2011u1總體積20u137。C水浴60min，按DNA片段純化的操作用小量膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物；5、RBP片段與T7載體的連接RBP/T重組質(zhì)粒EcoRI和Hindlll雙酶切電泳后的膠回收所得的目的片段與T7Select10-3b載體雙酶切后，回收所得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，其連接反應(yīng)體系為T7Select10_3b的回收產(chǎn)物0.5u1RBP/T質(zhì)粒EcoRI和Hindlll雙酶切電泳后的膠回收產(chǎn)物2u1SolutionI2.5u1總體積5ul室溫連接過夜，得RBP/T7重組噬菌體；6、RBP/T7重組噬菌體的包裝利用T7SelectPackagingKit試劑盒包裝RBP/T7重組噬菌體，包裝體系為RBP/T重組質(zhì)粒EcoRI和Hindlll雙酶切電泳后膠回收所得的目的片段與T7Select10-3b載體雙酶切后回收所得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接的連接產(chǎn)物5y1T7PackagingExtracts25y1總體積30ul室溫包裝2h后在反應(yīng)體系中加入270u1LB培養(yǎng)基終止。7、RBP/T7包裝產(chǎn)物的平板擴(kuò)增100iilRBP/T7包裝反應(yīng)物與250iil于恒溫?fù)u床37°C，150rpm/min新鮮培養(yǎng)的BLT5403菌液(0D600=0.61.0)混勻后，迅速與5ml融化后42。C溫浴的上層瓊脂混合均勻并鋪平板，平板靜置至上層瓊脂凝固后，37'C倒置培養(yǎng)至形成噬斑。8、RBP/T7重組噬菌體的PCR鑒定及擴(kuò)增(1)噬菌斑單克隆挑取用高壓滅菌的牙簽從上層瓊脂培養(yǎng)基上挑取獨(dú)立的、邊緣整齊的、圓形半透明單克隆噬菌斑，并在無菌EP管中用牙簽搗碎，根據(jù)噬斑大小加入50200y110mMEDTA(F>H8.0)，4'C浸泡過夜，浸出液中含有重組噬菌體。(2)重組噬菌體的PCR鑒定和測序鑒定以噬菌體浸出液為模板，以T7-UP、T7-D0WN—對引物，對單個噬斑進(jìn)行PCR鑒定。選出陽性克隆。T7-UP和T7-DOWN分別是T7Select10-3b多克隆位點(diǎn)上下游引物，用于重組噬菌體的鑒定T7-UP:5，-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3，；T7-D0WN:5，-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3，。挑取單個噬斑于含50yl10mMEDTA(PH8.0)的EP管中，4。C過夜。溫和顛倒管子，3000g離心5min棄沉淀，上清作為PCR模板。PCR反應(yīng)體系10XEXPCRBuffer(Mg2+Plus)lul10mMdNTPs1u1T7-UP(100nM)0.5u1T7-DO麗(100uM)0.5ix1噬菌體浸出液lylEXTaq0.1u1H205.9u1總體積10u1PCR反應(yīng)過程94°C10min94°C30s30個循環(huán)50°C30s72°C60s72°C10minPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，含有目的片段大小的為陽性。將PCR鑒定選出的陽性重組噬菌體在E.coliBLT5403擴(kuò)增后保存。擴(kuò)增方法甘油凍存的E.coliBLT5403菌株用在LB固體培養(yǎng)基(ampr)平板上劃線接種，37。C過夜培養(yǎng)；從平板上挑取單菌落接種5mlLB培養(yǎng)基，37°C、150卬m振蕩過夜；過夜培養(yǎng)E.coliBLT5403菌液按1:100比例分別接種5mlLB液體培養(yǎng)基(ampr)，37°C、150rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.60.8(約3h)成新鮮E.coliBLT5403菌液；將PCR鑒定選出的陽性重組噬菌斑浸出液接種至5ml新鮮E.coliBLT5403菌液37。C、150rpm培養(yǎng)13h至菌液澄清并出現(xiàn)細(xì)絲狀殘片；所得噬菌體液4。C離心10000rpm，10min，取上清一8(TC或液氮中凍存作為種子。將PCR鑒定選出的陽性重組噬菌體用PCR鑒定的相同條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增所得產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，與pGEM-T載體連接后測序以鑒定RBP/T7重組噬菌體插入基因的正確性。9、RBP/T7的大量制備及滴度測定RBP/T7的大量制備①將甘油凍存的E.coliBLT5403菌株在LB固體培養(yǎng)基ampr平板上劃線接種，37。C過夜培養(yǎng)；②從平板上挑取單菌落接種5mlLB培養(yǎng)基，37°C、150rpm振蕩過夜；③過夜培養(yǎng)的E.coliBLT5403菌液按1:100比例分別接種5ml、500mlLB液體培養(yǎng)基ampr各一份，37°C、150rpm振蕩培養(yǎng)至0D600=0.60.8，時間為3h，得新鮮E.coliBLT5403菌液，存放于4'C備用；接種50u1高滴度RBP/T7噬菌體種子至5ml新鮮E.coliBLT5403菌液，其00600=0.60.8，37°C、150rpm培養(yǎng)l3h至菌液澄清并出現(xiàn)細(xì)絲狀殘片；⑤將所得5ml噬菌體液接種至500ml新鮮E.coliBLT5403菌液，其OD600=0.60.8，37°C、150rpm培養(yǎng)13h至菌液澄清并出現(xiàn)細(xì)絲狀殘片；⑥所得噬菌體液4。C離心10000rpm，10min，取上清，加入29.3g1M的固體NaCl，振搖至溶解，促進(jìn)細(xì)菌碎片沉淀，4'Clh或過夜；⑦4。C，10000rpm離心10min，收集上清加入50g10。/。的PEG8000，振蕩至完全溶解后，4'C過夜；⑧4。C，10000rpm離心30min，棄上清；⑨所得沉淀物用10ml噬菌體稀釋液，即1MNaCl，lOmMTris-HCl，pH8.0，lmMEDTA，劇烈抽提后，4。C、10000rpm離心15min，收集上清；⑩余下的沉淀物重復(fù)一次⑨步驟，即用10ml噬菌體稀釋液劇烈抽提后，4'C、10000rpm離心15min，收集上清，合并收集的上清之后保存。噬菌體滴度測定取100u1待測噬菌體，用900u1LB液體培養(yǎng)基按l(T倍比稀釋；取100u1稀釋12液與250y1新鮮E.coliBLT5403菌液(OD600=0.60.8)混勻后，迅速與5ml融化后42'C溫浴的上層瓊脂混合均勻并鋪平板，平板靜置至上層瓊脂凝固后，37'C培養(yǎng)至形成噬斑，計(jì)數(shù)。噬菌體滴度按pfu/ral記數(shù)，數(shù)值上等于"噬斑數(shù)X稀釋倍數(shù)X10"。例如，如果稀釋倍數(shù)為106的平板上有20個噬斑，滴度為20X106X10=2X108pfu/ml。10、甲醛滅活RBP/T7重組噬菌體調(diào)整RBP/T7重組噬菌體至所需滴度，按1:4000體積比加入甲醛，37°C、100rpm振蕩72h，得重組噬菌體滅活液。上述實(shí)驗(yàn)方法中所用培養(yǎng)基的配方LB液體培養(yǎng)基(Uiria-Bertani培養(yǎng)基)細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5gNaCl10g用900ml去離子水溶解后，用1NNaOH調(diào)節(jié)PH至7.5，再定容至1000ml，15lbf/in2(1.034X105Pa)高壓下蒸汽滅菌20min。LB固體培養(yǎng)基(鋪制平板用)在LB液體培養(yǎng)基配置中加入細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(Bacto-agar)至濃度為15g/L，于15lbf/in2(1.034X105Pa)高壓下蒸汽滅菌20min，旋動混勻后鋪平板。若為氨芐青霉素抗性，則冷卻至5(TC以下加入氨芐青霉素，混勻后鋪平板。氨芐青霉素貯存液(10X)100mg/ml工作液100yg/ml稱取lg氨芐青霉素，ddH20定容為10ml，用0.22um濾器過濾除菌后，分裝成lml小份，-2(TC凍存。所述的人RBP-4蛋白展示在T7噬菌體的表面10B蛋白上。本發(fā)明經(jīng)過下列試驗(yàn)1.KKAy小鼠抗人RBP—4的特異性抗體檢測用噬菌體展示人RBP—4制成新的抗原復(fù)合物免疫8周齡雌性KKAy小鼠16只，1(Tpfu/只/次，分別于第0月、l月免疫二次，同時設(shè)立噬菌體空載體對照組免疫雌性KKAy小鼠16只，未免疫的雌性KKAy小鼠模型對照16只。分別于免疫二次后第4、8、12、16、20周采集尾靜脈血，分離血清，用RBP-4作為抗原包被板子，用間接ELISA法檢測抗人RBP-4抗體。表2抗人RBP-4抗體水平(I土S)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>檢測結(jié)果表明，噬菌體展示的人RBP-4噬菌體抗原復(fù)合物免疫KKAy小鼠后，誘導(dǎo)了抗人RBP-4抗體的產(chǎn)生，并且抗體水平在第二次免疫后第12周時升至最高，達(dá)到4966±867，與其它組相比，差異顯著(P〈0.01)，之后開始逐漸下降，而噬菌體空載體組與模型對照組的抗體水平相比，差異沒有顯著性(P〉0.05)。2.KKAy小鼠血糖及體重檢測表3KKAy小鼠空腹血糖水平表(mmol/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2中可以看出，模型對照組和空載體組的血糖水平在免疫組第二次免疫后第8周時超過正常值。而免疫組血糖水平基本處于發(fā)病值(7.0mmol/L)邊緣。說明免疫組有效地保護(hù)了KKAy小鼠，避免了血糖水平的升高。表4KKAy小鼠體重表(X±Sg)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>從表4中可以看出，在16周以前，各組小鼠體重均逐漸增加，免疫組與模型對照組和空載體組小鼠體重比較沒有明顯差異(P>0.05)。說明免疫組對KKAy小鼠體重?zé)o影響。3.KKAy小鼠葡萄糖耐量檢測在第二次免疫后第12周時禁食8h后，內(nèi)眥靜脈叢采血測定血清葡萄糖含量，作為基礎(chǔ)對照(0min)，然后各組動物灌胃給予葡萄糖2g口kg-l，分別在此后的45，90和120min采血測定血清葡萄糖含量。繪制0120min的血清葡萄糖耐量的藥-時曲線，用梯形法計(jì)算各組藥時曲線下面積(AUC。~2)表5.RBP-4噬菌體抗原復(fù)合物免疫對糖尿病模型KKAy小鼠葡萄糖耐量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>與模型對照組相比，a:P〈0.05,b:P<0.01從表5中可以看出，免疫組對葡萄糖灌胃具有較好的耐受性。4.KKAy小鼠胰島素耐量檢測在第二次免疫后第12周時禁食動物禁食20h，斷尾取血用OnetouchII型試紙血糖儀(Jomon-Jomon公司)測基礎(chǔ)血糖，然后各組小鼠腹腔注射胰島素0.75U口kg-1，分別在注射胰島素后30，60，120min采血測血糖值。表6.人RBP-4噬菌體抗原復(fù)合物對KKAv小鼠胰島素耐量的影響劑量不同時間血清葡萄糖含量/mmol口L—1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>與模型對照組相比，a:P<0.05，b:P〈0.01從表6中可以看出，免疫組對胰島素注射具有較好的耐受性。權(quán)利要求1、一種2型糖尿病疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于經(jīng)過下列步驟(1)在蛋白編碼序列如下的人視黃醇結(jié)合蛋白-4的編碼序列前添加啟動密碼子ATGGAACGTGATTGCCGTGTGAGCAGCTTTCGTGTGAAAGAAAACTTTGATAAAGCGCGTTTTAGCGGCACCTGGTATGCGATGGCGAAAAAAGATCCGGAAGGCCTGTTTCTGCAGGATAACATTGTGGCGGAATTTAGCGTGGATGAAACCGGCCAGATGAGCGCGACCGCGAAAGGCCGTGTGCGTCTGCTGAACAACTGGGATGTGTGCGCGGATATGGTGGGCACCTTTACCGATACCGAAGATCCGGCGAAATTTAAAATGAAATATTGGGGCGTGGCGAGCTTTCTGCAGAAAGGCAACGATGATCATTGGATTGTGGATACCGATTATGATACCTATGCGGTGCAGTATAGCTGCCGTCTGCTGAACCTGGATGGCACCTGCGCGGATAGCTATAGCTTTGTGTTTAGCCGTGATCCGAACGGCCTGCCGCCGGAAGCGCAGAAAATTGTGCGTCAGCGTCAGGAAGAACTGTGCCTGGCGCGTCAGTATCGTCTGATTGTGCATAACGGCTATTGCGATGGCCGTAGCGAACGTAACCTGCTG；(2)將添加起始密碼子ATG的人RBP-4蛋白基因片段的5’端引入EcoRI的酶切位點(diǎn)GAATTC，3’端引入HindIII酶切位點(diǎn)AAGCTT，合成插入pGEM-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒RBP/T；(3)將合成構(gòu)建得到的質(zhì)粒RBP/T轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’感受態(tài)細(xì)胞，克隆擴(kuò)增，大量提取質(zhì)粒RBP/T；(4)從質(zhì)粒RBP/T上用EcoRI和HindIII雙酶切下目的片段，插入T7Select10-3b多克隆位點(diǎn)的EcoRI和HindIII之間，使其正好位于T710B基因的3’端，使人RBP-4蛋白與T710B表達(dá)成融合蛋白，構(gòu)建成為重組噬菌體RBP/T7。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的2型糖尿病疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(3)的質(zhì)粒RBP/T克隆擴(kuò)增方法是將合成構(gòu)建得到的質(zhì)粒RBP/T轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10F'感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB固體培養(yǎng)基平板Ampr，37'C倒置培養(yǎng)過夜，挑取LB固體培養(yǎng)基平板Ampr中的單菌落至裝有5mlLB液體培養(yǎng)基Ampr的試管中，于恒溫?fù)u床37°C，150rpm/min過夜培養(yǎng)，次日將該5ml菌液接種800mlLB液體培養(yǎng)基Ampr，于恒溫?fù)u床37'C，150rpm/min過夜培養(yǎng)，次日收獲菌液。用質(zhì)粒大量抽提試劑盒從克隆擴(kuò)增收獲的菌液中提取RBP/T重組質(zhì)粒。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的2型糖尿病疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟(4)的質(zhì)粒RBP/T雙酶切、融合蛋白構(gòu)建的方法是A、RBP/T重組質(zhì)粒EcoRI和HindIII雙酶切，大量提取得到的重組質(zhì)粒RBP/T用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系如下10XMbuffer120y1EcoRI60y1HindIII60nlRBP/T960ul總體積1200u137'C水浴60min，1%瓊脂糖凝膠電泳、用小量膠回收試劑盒回收目的片段；B、T7噬菌體載體的處理及準(zhǔn)備，將T7Select10_3b載體用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切，并回收酶切產(chǎn)物，T7Select10_3b載體雙酶切體系如下10XMBuffer2u1EcoRI1u1HindIIIlulT7Select10-3b5u1H2011u1總體積20y137'C水浴60min，按DNA片段純化的操作用小量膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物；C、RBP片段與T7載體的連接，RBP/T重組質(zhì)粒EcoRI和HindIII雙酶切電泳后的膠回收所得的目的片段與T7Select10-3b載體雙酶切后，回收所得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，其連接反應(yīng)體系為T7Select10_3b的回收產(chǎn)物0.5y1RBP/T質(zhì)粒EcoRI和HindIII雙酶切電泳后的膠回收產(chǎn)物2u1SolutionI2.5y1總體積5ul室溫連接過夜，得RBP/T7重組噬菌體。4、一種2型糖尿病疫苗的制備方法，其特征在于將人RBP-4蛋白與T710B表達(dá)成融合蛋白，并構(gòu)建成的重組噬菌體RBP/T7，在大腸桿菌株BLT5403中擴(kuò)增后，按收獲噬菌體，測定噬菌體的滴度，滴度按pfu/ml計(jì)數(shù)，數(shù)值上等于"噬斑數(shù)X稀釋倍數(shù)X10"，調(diào)整噬菌體濃度為所需滴度，按1:4000體積比加入甲醛，用常規(guī)方法滅活，得2型糖尿病疫苗。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的2型糖尿病疫苗的制備方法，其特征在于所述2型糖尿病疫苗的具體制備方法是①將甘油凍存的E.coliBLT5403菌株在LB固體培養(yǎng)基ampr平板上劃線接種，37匸過夜培養(yǎng)；②從平板上挑取單菌落接種5mlLB培養(yǎng)基，37°C、150rpm振蕩過夜；③過夜培養(yǎng)的E.coliBLT5403菌液按1:100比例分別接種5ral、500mlLB液體培養(yǎng)基ampr各一份，37°C、150rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.60.8，時間為3h，得新鮮E.coliBLT5403菌液，存放于4'C備用；接種50n1高滴度RBP/T7噬菌體種子至5ml新鮮E.coliBLT5403菌液，其0D600=0.60.8，37°C、150rpm培養(yǎng)13h至菌液澄清并出現(xiàn)細(xì)絲狀殘片；⑤將所得5ml噬菌體液接種至500ml新鮮E.coliBLT5403菌液，其OD600=0.60.8，37°C、150rpm培養(yǎng)l3h至菌液澄清并出現(xiàn)細(xì)絲狀殘片；⑥所得噬菌體液4。C離心10000rpm，10min，取上清，加入29.3g1M的固體NaCl，振搖至溶解，促進(jìn)細(xì)菌碎片沉淀，4'Clh或過夜；⑦4。C，10000rpm離心10min，收集上清加入50g10%的PEG8000，振蕩至完全溶解后，4。C過夜；⑧4。C，10000rpm離心30min，棄上清；⑨所得沉淀物用10ml噬菌體稀釋液，即lMNaCl，lOraMTris-HCl，pH8.0，lmMEDTA，劇烈抽提后，4°C、10000rpm離心15min，收集上清；⑩余下的沉淀物重復(fù)一次⑨步驟，即用10ral噬菌體稀釋液劇烈抽提后，4°C、10000rpm離心15min，收集上清，合并收集的上清之后保存。全文摘要本發(fā)明提供一種2型糖尿病疫苗的構(gòu)建和制備方法，將添加起始密碼子ATG的人RBP-4活性蛋白編碼基因插入T7噬菌體DNA衣殼蛋白10B編碼基因的3’端，使人RBP-4蛋白與T710B表達(dá)成融合蛋白，構(gòu)建成為重組噬菌體RBP/T7，并進(jìn)一步制備成重組噬菌體疫苗，免疫機(jī)體，刺激產(chǎn)生針對RBP-4的特異性抗體，調(diào)節(jié)體內(nèi)的RBP-4水平，從而達(dá)到控制血糖的目的。經(jīng)試驗(yàn)，構(gòu)建的重組噬菌體疫能夠有效降低KKAy小鼠血糖、甘油三酯和膽固醇，并能有效地保護(hù)KKAy小鼠，避免了其血糖水平的升高，同時增強(qiáng)了KKAy小鼠對葡萄糖灌胃和胰島素注射的耐受性。因此用它治療2型糖尿病，可徹底改變傳統(tǒng)藥物治療存在的諸多不足或問題。文檔編號C12N15/62GK101307314SQ20081005864公開日2008年11月19日申請日期2008年7月4日優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日發(fā)明者蕓蘭,段金梅,王海漩,胡云章,胡凝珠申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所