專利名稱：：不同區(qū)域普洱茶曬青毛茶的分子鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子標(biāo)記
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)不同區(qū)域普洱茶曬青毛茶的分子鑒別技術(shù)。
背景技術(shù)：
：普洱茶以其獨(dú)特品質(zhì)風(fēng)格和保健功效而舉世注目，"普洱茶"已作為證明商標(biāo)(地理標(biāo)志)正式啟用。普洱茶的原料必須是云南大葉種阿薩姆茶(0^//&^^朋";w:aMaw/cfl)的曬青毛茶。普洱茶是指中國(guó)云南省西部、南部和中部等地用云南大葉種阿薩姆茶的曬青毛茶經(jīng)精制整理或蒸壓成形后儲(chǔ)存陳化后獲得的茶品(稱為生茶、茶餅)，以及20世紀(jì)70年代以來經(jīng)技術(shù)改革創(chuàng)新，采用云南大葉種曬青毛茶經(jīng)過增濕渥堆及后熟陳化后獲得的茶品(稱為熟茶)。普洱茶的原產(chǎn)地是云南省臨滄地區(qū)、普洱市和西雙版納州三個(gè)地區(qū)，因此，其他地區(qū)生產(chǎn)的茶品均不能稱之為"普洱茶"。普洱茶的原料即云南大葉種阿薩姆茶的曬青毛茶是決定普洱茶品質(zhì)的主要因素之一。由于普洱茶的馳名和價(jià)格的優(yōu)勢(shì)，市場(chǎng)上假冒產(chǎn)品較多，并且由于原料的產(chǎn)地不同，使得普洱茶在口感等有較大差異，在價(jià)格上也有較大的差異。由來自古茶園的云南大葉種阿薩姆茶的曬青毛茶生產(chǎn)的普洱茶的價(jià)格要比來自臺(tái)地茶園的云南大葉種阿薩姆茶的曬青毛茶生產(chǎn)的普洱茶的價(jià)格要高得多(老樹茶均價(jià)為100￥/，2007年;臺(tái)地茶均價(jià)為10￥/kg,2007年)；來自于不同區(qū)域的古茶園的曬青毛茶生產(chǎn)的普洱茶在價(jià)格上也有較大差異，如原料來自勐海班章區(qū)域的古茶園的曬青毛茶(1000Y/kg，2007年)比原料來自臨滄等區(qū)域的古茶園的曬青毛茶(100Y/kg，2007年)的普洱茶價(jià)格高得多。因此，科學(xué)地鑒別普洱茶原料來源，鑒別不同區(qū)域普洱茶曬青毛茶，對(duì)鑒別普洱茶原料的真?zhèn)巍㈣b別普洱茶生茶(茶餅)的真?zhèn)?，打擊假冒古茶園原料的大量出現(xiàn)，保護(hù)廣大消費(fèi)者的利益，保證普洱茶商譽(yù)和普洱茶產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展具有重要價(jià)值。曬青毛茶是茶葉經(jīng)過最初加工后的稱謂，云南曬青毛茶是大葉種茶樹鮮葉經(jīng)殺青、揉捻后，采用太陽光曬干而成的。古茶園(山)茶葉也稱老樹茶，它制于百年以上的古老茶園，云南省現(xiàn)有古老茶園60萬畝，在古老茶園中林茶草構(gòu)成一個(gè)和諧的生態(tài)系統(tǒng)，造就"遠(yuǎn)看是森林、走近是茶園"的美妙景像，古老茶園中的茶樹病蟲不會(huì)發(fā)生災(zāi)害性、突發(fā)性的危害，不需用藥防治，也不需進(jìn)行修剪及中耕施肥等管理，是一種地道的天然產(chǎn)品。臺(tái)地茶園茶葉(即臺(tái)地茶園生產(chǎn))也稱臺(tái)地茶，是指采制于新中國(guó)成立后發(fā)展建立的密植條栽茶園，云南省現(xiàn)有該類茶園近200多萬畝，該類茶園突出的是"集中連片、高產(chǎn)"，事先未考慮搭建"和諧的林茶草生態(tài)系統(tǒng)"，伴隨的是"噴藥施肥、中耕修剪"，今后的目標(biāo)是"改造"，提高轉(zhuǎn)換將之建設(shè)成為"有機(jī)茶園"、"無公害茶園"。用古茶園茶葉即老樹茶所制作的普洱茶，品質(zhì)優(yōu)良，價(jià)格居高不下；不同古茶園茶葉制作的普洱茶，品質(zhì)風(fēng)格和價(jià)格也不同。而古茶園產(chǎn)量有限，這就導(dǎo)致了假冒古樹茶的大量出現(xiàn)。目前，分子生物學(xué)技術(shù)在食品的真?zhèn)舞b別上的應(yīng)用發(fā)展迅速，為打擊偽劣造假食品開辟了新途徑。以DNA水平為基礎(chǔ)的分子檢測(cè)鑒別技術(shù)，包括PCR技術(shù)、RFLP技術(shù)、RAPD技術(shù)、AFLP技術(shù)、SSR和ISSR技術(shù)、多位點(diǎn)小衛(wèi)星DNA指紋技術(shù)和微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)、基因芯片技術(shù)以及SNP技術(shù)等。由于曬青毛茶在加工過程中，經(jīng)歷日曬、殺青、揉捻和蒸煮等過程，DNA的提取相對(duì)來說較為困難。Singh(SinghMetal.IsolationandPCRamplificationofgenomicDNAfrommarketsamplesofdrytea.PlantMol.Biol.Rep.199917:171-178)報(bào)道，成功提取了綠茶DNA，并能成功用于RAPD分析，而曬青毛茶實(shí)際上屬于綠茶。周楊(周楊等，不同年代云南普洱茶DNA提取分離方法初探.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006，21(3):396-398)曾報(bào)道采用的改進(jìn)的CTAB微量提取法,可以得到高質(zhì)量的不同年代的云南普洱茶DNA，其中包含曬青毛茶。本文作者通過摸索，已經(jīng)成功地提取到曬青毛茶的總DNA，能滿足AFLP擴(kuò)增的需要。陳亮等(陳亮等，應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記鑒定野生茶樹種質(zhì)資源研究，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2002，35(10):1186-1191)應(yīng)用RAPD標(biāo)記對(duì)原產(chǎn)于云南等地的24份野生茶樹資源進(jìn)行分子鑒定研究。結(jié)果表明,RAPD標(biāo)記在鑒定茶樹種質(zhì)資源方面非常有效。有3種獨(dú)立的方法可以用于茶樹種質(zhì)資源的分子鑒定:特殊的標(biāo)記；特異的譜帶類型；不同引物提供譜帶類型的組合。16個(gè)特異標(biāo)記的存在和3個(gè)特異標(biāo)記的缺失可以鑒定14份資源；Singh用從市場(chǎng)上購(gòu)來的10個(gè)不同品牌的紅茶、綠茶，提取DNA，用RAPD鑒別，并認(rèn)為該方法用來證明某著名品牌的茶葉的來源，有極大的應(yīng)用性。Matsumoto(MatsumotoSetal.DifferentiationofJapanesegreenteacultivarsasrevealedbyRFLPanalysisofphenylalanineammonialyaseDNA.TheoreticalandAppliedGenetics2002，104:998-1002)用RFLP技術(shù)，以PAL基因?yàn)樘结樿b別日本綠茶的遺傳差異，集合2種限制性內(nèi)切酶，2.3kb的探針能從阿薩姆種茶中鑒別出日本綠茶。Dhiman(DhimanB.etal.Moleculardetectionofcashewhusk(Anacardiumoccidentale)adulterationinmarketsamplesofdrytea(Camelliasinensis).Letter…PlantaMed2003,69:882-884)報(bào)道從5SrRNA基因片段設(shè)計(jì)了種間的特異PCR探針，并成功地檢測(cè)到在茶葉樣品中的摻雜的假貨腰果殼。從上述報(bào)道可看出，分子標(biāo)記在茶樹種質(zhì)和產(chǎn)品鑒別是可行的。普洱茶不同區(qū)域曬青毛茶的鑒別技術(shù)是非常復(fù)雜的，梁名志等(梁名志等，老樹茶與臺(tái)地茶品質(zhì)比較研究.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006,21(4):493-497)以云南省的普洱茶的蒸青茶、曬青茶為樣品，從感官審評(píng)、內(nèi)含品質(zhì)化學(xué)成分和礦物質(zhì)元素檢測(cè)分析展開對(duì)比研究,得出:(l)老樹茶口感要優(yōu)于臺(tái)地茶,與品質(zhì)化學(xué)成分有關(guān)聯(lián)。(2)從理化成分與礦物質(zhì)含量來看，老樹茶與臺(tái)地茶各有千秋,不能簡(jiǎn)單、武斷地講誰優(yōu)誰劣、誰好誰差。說明老樹茶與臺(tái)地茶確有差異，但很難用感官審評(píng)、內(nèi)含品質(zhì)化學(xué)成分和礦物質(zhì)元素檢測(cè)等方法來區(qū)分。AFLP分子標(biāo)記技術(shù)(即擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性，AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,AFLP技術(shù))與上述技術(shù)相比具有DNA需要量少、檢測(cè)效率高、多態(tài)性高、可靠性好、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。AFLP分子標(biāo)記技術(shù)己在動(dòng)物學(xué)、植物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究上應(yīng)用。在植物學(xué)研究中的應(yīng)用主要在種質(zhì)資源鑒定、指紋圖譜構(gòu)建等。目前，還沒有應(yīng)用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)普洱茶曬青毛茶進(jìn)行分子鑒別，也沒有用AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)不同區(qū)域普洱茶曬青毛茶進(jìn)行分子鑒別。本發(fā)明人特別通過引物的選擇和開創(chuàng)性地利用AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)不同區(qū)域普洱茶曬青毛茶進(jìn)行分子鑒別。通過2006年和2007年兩次查新檢索，目前在國(guó)內(nèi)外未發(fā)現(xiàn)有對(duì)不同區(qū)域普洱茶曬青毛茶及其它茶類的AFLP-毛細(xì)管電泳分子鑒別的相關(guān)報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)著名古茶園"普洱茶"原料的真?zhèn)巍⒉煌瑓^(qū)域的老樹茶(即古茶園生產(chǎn)的茶葉)曬青毛茶、老樹茶與臺(tái)地茶(臺(tái)地茶園生產(chǎn)的茶葉)曬青毛茶難以用傳統(tǒng)的感官審評(píng)或理化分析等方法鑒別的問題，提供了一種不同區(qū)域普洱茶曬青毛茶的分子鑒別方法。本發(fā)明目的旨在:①建立著名古茶園的曬青毛茶的AFLP-毛細(xì)管電泳標(biāo)準(zhǔn)圖譜(以下簡(jiǎn)稱古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)，據(jù)此區(qū)分不同區(qū)域的古茶園曬青毛茶；②建立著名古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜，據(jù)此區(qū)分臺(tái)地茶園曬青毛茶，為普洱茶原產(chǎn)地保護(hù)奠定科學(xué)數(shù)據(jù)，促進(jìn)普洱茶的持續(xù)健康發(fā)展。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中用感官審評(píng)或理化分析等方法難以鑒別古茶園"普洱茶"原料的真?zhèn)?、不同區(qū)域的老樹茶曬青毛茶、老樹茶曬青毛茶與臺(tái)地茶曬青毛茶的問題。本發(fā)明收集了普洱茶主要產(chǎn)區(qū)云南西雙版納州、普洱市和臨滄地區(qū)以及云南周邊國(guó)家緬甸、老撾和泰國(guó)的曬青毛茶，采用本發(fā)明"不同區(qū)域普洱茶曬青毛茶的分子鑒別方法"對(duì)其進(jìn)行分析。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果是成功地建立了普洱茶產(chǎn)地的9個(gè)著名古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜，能鑒別著名古茶園普洱茶的真?zhèn)?，并成功區(qū)別不同古茶園曬青毛茶，打擊假冒偽劣產(chǎn)品。(2)通過建立的上述古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜，能把古茶園曬青毛茶與其它臺(tái)地茶園曬青毛茶區(qū)分開來。(3)本發(fā)明所用的AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)，一對(duì)引物可擴(kuò)增出200多個(gè)位點(diǎn)，位點(diǎn)差異在lbp都能檢測(cè)到，更容易檢測(cè)出材料的細(xì)微差異。(4)本發(fā)明采用高效自動(dòng)化技術(shù)，降低了人為操作帶來的誤差，易于對(duì)擴(kuò)增樣本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析，提高了數(shù)據(jù)的可靠性。(5)本發(fā)明通過對(duì)39個(gè)曬青毛茶的AFLP-毛細(xì)管電泳，39個(gè)曬青毛茶的AFLP毛細(xì)管電泳圖譜都有差異，可以通過以下途徑來區(qū)分不同來源的普洱茶曬青毛茶。①?gòu)牡湫偷闹饕卣鞣搴腿旧盘?hào)的最高值和次高值來區(qū)別；如產(chǎn)于普洱市的景邁茶的E-AAC/M-CTG216bp特征峰；產(chǎn)于臨滄地區(qū)的勐庫(kù)茶的E-AAC/M-CTG114bp特征峰，產(chǎn)于普洱市瀾滄縣瀾滄大山的E-AAC/M-CTG210bp特征峰；產(chǎn)于老撾的老撾豐沙里的E-AAC/M-CTG210bp特征峰；②從峰形圖的整個(gè)形狀來區(qū)分；③與對(duì)照的峰形圖比較來區(qū)分。本發(fā)明方法的技術(shù)方案如下本發(fā)明的主要儀器CEQ8000毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(BeckmanCoulter);臺(tái)式冷凍離心機(jī)(BeckmanCoulter);PCR儀(MJResearch(Waltham,MA，USA)PTC200-we11thermalcycler);紫外分光光度計(jì)(UV-2550型，SHIMADZU公司)、凝膠成像系統(tǒng)等。本發(fā)明技術(shù)方案除以下特殊說明外，均采用常規(guī)的AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)。本發(fā)明的分子鑒別方法，由樣本DNA的提取、選擇接頭和預(yù)擴(kuò)引物、AFLP引物篩選、AFLP擴(kuò)增、AFLP-毛細(xì)管電泳檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理和分析六個(gè)步驟組成，按以下步驟進(jìn)行1、樣本DNA的提取樣本各l.Og，分別按照改進(jìn)的CTAB法(DoyleJ.DNAprotocolsforplants-CTABtotalDNAisolation.In:HewittGM,JohnstonA,eds.Moleculartechniquesintaxonomy.Berlin:Springer,1991,283-293.)提取總DNA(見第二章)。提取的總DNA樣本經(jīng)RNA酶A純化后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm下的光密度值，以確定其純度和濃度，并將總DNA濃度稀釋到200ng/ul，用于PCR反應(yīng)。2、選擇接頭和預(yù)擴(kuò)引物RNA酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI酶、MseI酶、T4連接酶、Taq酶、dNTP、PCRreactionbuffer,均購(gòu)自上海生工和寶生物公司；EcoRl接頭、MseI接頭和引物由貝克曼庫(kù)爾特(BeckmanCoulter)公司購(gòu)自TAKALA公司,見表1表1.EcoRI，Msel接頭與預(yù)擴(kuò)引物序列接頭或引物序列EcoRI接頭5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3，3'-CTGACGCATGGTTAA-5'Msel接頭5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'3'-TACTCAGGACTCATS'EcoRI預(yù)擴(kuò)引物5'-GACTGCGTACCAATTC-3'(EO)5'-GACTGCGTACCAATTCA-3'(El)Msel預(yù)擴(kuò)引物5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'(MO)5'隱GATGAGTCCTGAGTAAA國(guó)3'(Ml)3、AFLP引物篩選選擇性擴(kuò)增引物參照黃意歡(黃意歡，2004.茶樹分子遺傳圖譜構(gòu)建及多酚氧化酶基因的SNP研究.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文)，黃福平(黃福平，2005.茶樹遺傳多樣性分析與遺傳圖譜構(gòu)建.浙江大學(xué)博士學(xué)位論文)等文獻(xiàn)報(bào)道從E37M32，E37M47,E41M42,E41MSS,E41M47，E-AACM-CAT,E-ACTM-CTC，E-ACTM-CTC等引物中篩選出了E-AAC/M-CTG和E-AAC/M-CTA兩對(duì)擴(kuò)增多態(tài)性最高的引物，用于AFLP分析。其序列如下E國(guó)AAC:5'-GACTGCGTACCAATTCAAC-3'M-CTG:5'-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3'M-CTA:5'-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3'4、AFLP擴(kuò)增樣本DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI、MseI分別酶切；雙酶切產(chǎn)物加入EcoRI和MseI接頭序列和T4連接酶進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物加入EcoRl和MseI引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)?4'C預(yù)變性2min，然后進(jìn)入循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94'C變性20sec，56'C退火30sec，72r延伸2min，共20個(gè)熱循環(huán)，最后60。C延伸30min，4'C冷卻后取出；預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍后，加入選定的引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增為兩段循環(huán)，94t:預(yù)變性2min后，第一段循環(huán)為94。C變性20sec，66-56。C退火30sec，72。C延伸2min，共10個(gè)熱循環(huán)。其中，退火溫度從66。C開始，每個(gè)循環(huán)降rC。第二段循環(huán)為94。C變性20sec，56。C退火30sec，72'C延伸2min，共20個(gè)循環(huán)，最后60"C延伸30min，冷卻后取出檢測(cè)。擴(kuò)增反應(yīng)在MJResearch(Waltham，MA，USA)PTC200-we11thermalcycler上，參照GIBCOBRL(GIBCOBRL.InstructionmanualAFLPTManalysissystem,AFLPstartprimerkit.VersionB,2003)進(jìn)行。5、AFLP-毛細(xì)管電泳檢測(cè)選擇性擴(kuò)增樣本檢測(cè)在貝克曼庫(kù)爾特(BeckmanCoulter)公司CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)上完成。上樣液甲酰胺10ul，Sizestandard-6000.2ul，Sample3ul(稀釋10倍)；電壓:6KV，電流:4Ma時(shí)間:50min。該系統(tǒng)采用熒光標(biāo)記和毛細(xì)管電泳分離技術(shù)，擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率毛細(xì)管中電泳分離，激光激發(fā)熒光采集數(shù)據(jù)，電泳結(jié)果通過軟件自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析并轉(zhuǎn)化為"o、l"原始數(shù)據(jù)矩陣備用。同時(shí)，導(dǎo)出電泳分離圖譜。6、數(shù)據(jù)處理和分析得到的原始數(shù)據(jù)矩陣，用POPGENEversion1.32(YehFC.etal.,MicrosoftWindows-basedfreewareforpopulationgeneticanalysis.Release1.31.Edmonton:UniversityofAlberta.1999.)軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析；居群遺傳多樣性以常規(guī)的多態(tài)位點(diǎn)百分率(P)、Nei's(NeiM.Analysisofgenediversityinsubdividedpopulations,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1973,70:3321-3323.)基因多樣性指數(shù)(期望雜合度)(He)、Shannon多樣性指數(shù)(Ho)和基因多樣度(Ht)度量，經(jīng)POPGENEversion1.32分析得到上述數(shù)據(jù)。同時(shí)，進(jìn)行電泳分離圖譜的特征峰比對(duì)分析。圖1樣品佛香茶引物E-AAC/M-CTGAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜圖2樣品佛香茶引物E-AAC/M-CTAAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜圖3樣品紫娟引物E-AAC/M-CTGAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜圖4樣品紫娟引物E-AAC/M-CTAAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜圖5樣品普洱1引物E-AAC/M-CTGAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜圖6樣品普洱1引物E-AAC/M-CTAAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜圖7樣品勐混引物E-AAC/M-CTGAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖8樣品勐混引物E-AAC/M-CTAAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖9樣品布朗山引物E-AAC/M-CTGAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖10樣品布朗山引物E-AAC/M-CTAAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖11樣品曼邁引物E-AAC/M-CTGAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖12樣品曼邁引物E-AAC/M-CTAAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖13樣品南糯山竹林引物E-AAC/M-CTGAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖14樣品南糯山引物E-AAC/M-CTAAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖15樣品老班章引物E-AAC/M-CTGAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖16樣品老班章引物E-AAC/M-CTAAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖17樣品巴達(dá)引物E-AAC/M-CTGAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖18樣品巴達(dá)引物E-AAC/M-CTAAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖19樣品勐庫(kù)茶引物E-AAC/M-CTGAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖20樣品勐庫(kù)茶引物E-AAC/M-CTAAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖21樣品白鶯山引物E-AAC/M-CTGAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖22樣品白鶯山引物E-AAC/M-CTAAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖23樣品景邁引物E-AAC/M-CTGAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖24樣品景邁引物E-AAC/M-CTAAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜(古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜)圖25樣品1引物的E-AAC/M-CTAAFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜圖26樣品1引物的E-AAC/M-CTA重復(fù)實(shí)驗(yàn)的AFLP選擇性擴(kuò)增電泳圖譜實(shí)施例本發(fā)明的主要實(shí)驗(yàn)儀器CEQ8000毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(BeckmanCoulter);臺(tái)式冷凍離心機(jī)(BeckmanCoulter);PCR儀(MJResearch(Waltham,MA,USA)PTC200-wellthermalcycler);紫外分光光度計(jì)(UV-2550型，SHIMADZU公司)、凝膠成像系統(tǒng)。1、樣本的收集總共收集了樣本39個(gè)，分別來自普洱茶的原產(chǎn)地西雙版納州、普洱市、臨滄地區(qū)、以及國(guó)外老撾、緬甸和泰國(guó)39個(gè)不同的區(qū)域等。西雙版納州的茶樣有19個(gè)，其中臺(tái)地茶4個(gè)、老樹茶6個(gè)；普洱市的茶樣有6個(gè)，其中臺(tái)地茶5個(gè)、老樹茶l個(gè)；臨滄地區(qū)的茶樣7個(gè)，其中臺(tái)地茶3個(gè)、老樹茶4個(gè)；老撾的茶樣2個(gè)；緬甸的茶樣2個(gè)，泰國(guó)的茶樣3個(gè)。詳見表3-l、表3-2和表3-3。序號(hào)l-8(即樣品l-9)，序號(hào)18-19(即臨滄l-2)，序號(hào)23(即老茶樹)的茶樣為從勐海市場(chǎng)上收購(gòu)，不知其明確的來源；序號(hào)30(即二嘎子)的茶樣為為大理茶種C.序號(hào)10(即佛香茶)的茶樣是云抗10號(hào)與福鼎白毛茶的雜交后代，為中小葉種；其余樣本，都是云南大葉種(aw^〃z'flW"e"w'svar.a^o脂'ca阿薩姆茶)所制曬青毛茶。即序號(hào)9-20的茶樣都是臺(tái)地茶(臺(tái)地茶園生產(chǎn))，序號(hào)21-22、序號(hào)24-32的茶樣都是老樹茶(古茶園生產(chǎn))。為了保證結(jié)果的重復(fù)性，進(jìn)行了部分樣品的重復(fù)試驗(yàn)，見圖25-圖26。2、選擇接頭和預(yù)擴(kuò)引物RNA酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI酶、MseI酶、T4連接酶、Taq酶、dNTP、PCRreactionbuffer,均購(gòu)自上海生工和寶生物公司；EcoRl接頭、MseI接頭和引物由貝克曼庫(kù)爾特(BeckmanCoulter)公司購(gòu)自TAKALA公司，見表1。3、樣本DNA的提取樣本各l.Og，分別按照改進(jìn)的CTAB法(DoyleJ.DNAprotocolsforplants-CTABtotalDNAisolation.In:HewittGM,JohnstonA,eds.Moleculartechniquesintaxonomy.Berlin:Springer,1991，283-293.)提取總DNA(見第二章)。提取的總DNA樣本經(jīng)RNA酶A純化后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm下的光密度值，以確定其純度和濃度，并將總DNA濃度稀釋到200ng/ul，用于PCR反應(yīng)。4、AFLP引物篩選選擇性擴(kuò)增引物參照黃意歡(黃意歡，2004.茶樹分子遺傳圖譜構(gòu)建及多酚氧化酶基因的SNP研究.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文)，黃福平(黃福平，2005.茶樹遺傳多樣性分析與遺傳圖譜構(gòu)建.浙江大學(xué)博士學(xué)位論文)等文獻(xiàn)報(bào)道從E37M32，E37M47,E41M42，E41MSS，E41M47，E-AACM-CAT,E-ACTM-CTC，E-ACTM-CTC等引物中篩選出了E-AACM-CTC和E-AACM-CTG兩對(duì)擴(kuò)增多態(tài)性最高的引物，用于AFLP分析。其序列如下E-AAC:5'-GACTGCGTACCAATTCAAC-3，M-CTG:5'-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3'M國(guó)CTA:5'-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3'5、AFLP擴(kuò)增樣本DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI、MseI分別酶切；雙酶切產(chǎn)物加入EcoRI和MseI接頭序列和T4連接酶進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物加入EcoRI和MseI引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)?4'C預(yù)變性2min，然后進(jìn)入循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94。C變性20sec，56"C退火30sec，72'C延伸2min，共20個(gè)熱循環(huán)，最后60。C延伸30min，4"冷卻后取出；預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍后，加入選定的引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增為兩段循環(huán)，94'C預(yù)變性2min后，第一段循環(huán)為94r變性20sec，66-56t:退火30sec，72。C延伸2min，共10個(gè)熱循環(huán)。其中，退火溫度從66。C開始，每個(gè)循環(huán)降rC。第二段循環(huán)為94。C變性20sec，56t退火30sec，72。C延伸2min，共20個(gè)循環(huán)，最后60'C延伸30min，冷卻后取出檢測(cè)。擴(kuò)增反應(yīng)在MJResearch(Waltham,MA,USA)PTC200-wellthermalcycler上，參照GIBCOBRL(GIBCOBRL.InstructionmanualAFLPTManalysissystem,AFLPstartprimerkit.VersionB，2003)進(jìn)行。6、AFLP-毛細(xì)管電泳檢測(cè)選擇性擴(kuò)增樣本檢測(cè)在貝克曼庫(kù)爾特(BeckmanCoulter)公司CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)上完成。上樣液甲酰胺10ul，Sizestandard-6000.2ul，Sample3ul(稀釋10倍)；電壓:6KV，電流:4Ma時(shí)間:50min。該系統(tǒng)釆用熒光標(biāo)記和毛細(xì)管電泳分離技術(shù)，擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率毛細(xì)管中電泳分離，激光激發(fā)熒光采集數(shù)據(jù)，電泳結(jié)果通過軟件自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析并轉(zhuǎn)化為"O、l"原始數(shù)據(jù)矩陣備用。同時(shí)，導(dǎo)出電泳分離圖譜。7、數(shù)據(jù)處理和分析得到的原始數(shù)據(jù)矩陣，用POPGENEversion1.32(YehFC.etal.，MicrosoftWindows-basedfreewareforpopulationgeneticanalysis.Release1.31.Edmonton:UniversityofAlberta.1999.)軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析；居群遺傳多樣性以常規(guī)的多態(tài)位點(diǎn)百分率(P)，Nei's(NeiM.Analysisofgenediversityinsubdividedpopulations,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1973,70:3321-3323.)基因多樣性指數(shù)(期望雜合度)(He)，Shannon多樣性指數(shù)(Ho)和基因多樣度(Ht)度量，經(jīng)POPGENEversion1.32分析得到上述數(shù)據(jù)。同時(shí)，進(jìn)行電泳分離圖譜的特征峰比對(duì)分析。8、結(jié)果與分析(1)DNA提取與AFLP引物組合的擴(kuò)增結(jié)果兩對(duì)選中的AFLP弓I物共擴(kuò)增出可重復(fù)的426條帶，檢測(cè)出420個(gè)多態(tài)性(P=98.58%)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增的總帶數(shù)為213條，多態(tài)性條帶210。引物E-AAC/M-CTG的P=98.21%，引物E-AAC/M-CTA的P=99.01%，見表2。表2所用引物組合及其檢測(cè)效率引物組合擴(kuò)增位點(diǎn)多態(tài)性位多態(tài)性比_^__E隱AAC/M-CTG22321998.21E隱AAC/M-CTA20320199.01總計(jì)Total42642098.58平均Average_^_^12_(2)AFLP-毛細(xì)管電泳圖譜分析從圖1-圖26，表明傳統(tǒng)的DNA電泳圖譜通過AFLP-毛細(xì)管電泳技術(shù)轉(zhuǎn)化為容易鑒別的峰形圖，不同的樣品的峰形圖，整個(gè)峰形圖輪廓、最高峰、次高峰、峰值大小等都有差別，據(jù)此峰形圖，可以從典型的主要特征峰和染色信號(hào)的最高值和次高值；從峰形圖的整個(gè)形狀；與對(duì)照的峰形圖比較將其與其他材料區(qū)別出來。兩對(duì)引物39個(gè)樣品AFLP-毛細(xì)管電泳圖譜都有一定的差異，見圖1圖26，表3-l、表3-2、表3-3、表4-l、表4-2、表4-3?？捎靡韵虏町?，進(jìn)行鑒別:'①引物E-AAC/M-CTG的特征峰區(qū)別(見表3-l、表3-2、表3-3及相應(yīng)AFLP電泳圖譜)二嘎子茶(序號(hào)30)96bp特征峰；佛香茶(序號(hào)10)的234bp特征峰；紫娟(序號(hào)11)的83bp特征峰；景邁茶(序號(hào)32)的216bp特征峰；勐庫(kù)茶(序號(hào)28)的132bp特征峰，瀾滄大山(序號(hào)17)的210bp特征峰；老撾豐沙里(序號(hào)34)的l'71bp，210bp特征峰；緬甸2(序號(hào)36)的152bp、267bp特征峰。②引物E-AAC/M-CTA的特征峰區(qū)別(見表4-1、表4-2、表4-3及相應(yīng)AFLP電泳圖譜)緬甸2(序號(hào)36)的176bp和332bp特征峰，景邁茶(序號(hào)32)的177bp、219bp、283bp特征峰等。③對(duì)于圖形比較類似的樣品，可以依據(jù)染色信號(hào)的最高值和次高值來進(jìn)行比較區(qū)別，如勐海格朗和(序號(hào)24)、老班章(序號(hào)25)、巴達(dá)(序號(hào)26)，他們的引物E-AAC/M-CTA最高值都是337bp，但次高值分別為176bp、132bp、169bp。因而可成功的將三者區(qū)分出來。表5是隨機(jī)抽取的8個(gè)茶樣的兩對(duì)引物的特征峰區(qū)別簡(jiǎn)表，通過簡(jiǎn)表即可一目了然地鑒別出8個(gè)不同的茶樣。表58個(gè)茶樣的引物E-AAC/M-CTG和引物E-AAC/M-CTA特征峰區(qū)別<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>單位為堿基對(duì)bp;*代表染色信號(hào)最高值；#代表染色信號(hào)次高值。⑤建立了普洱茶原產(chǎn)地的9個(gè)著名古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜(見圖7-圖24)根據(jù)39個(gè)樣品的39張AFLP-毛細(xì)管電泳圖譜，建立了西雙版納州的勐海老班章、勐海南糯山、勐海曼邁、勐海巴達(dá)、勐海布朗山、勐海勐混，臨滄地區(qū)的勐庫(kù)和白鶯山，普洱市的景邁9個(gè)著名古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜(見圖7-圖24)，據(jù)此可區(qū)分這9個(gè)不同區(qū)域的古茶園曬青毛茶；通過建立的上述9個(gè)著名古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜，還可將這9個(gè)古茶園曬青毛茶與其它臺(tái)地茶園曬青毛茶區(qū)分開來。通過對(duì)39個(gè)樣品的AFLP-毛細(xì)管電泳圖譜的認(rèn)真分析，每一張圖譜都有各自的特征，完全可以據(jù)此分辨出不同區(qū)域的樣品。與牝同時(shí)，重復(fù)性試驗(yàn)表明，見圖25~圖26，AFLP-毛細(xì)管電泳圖譜有非常高的重復(fù)性。因此，本發(fā)明成功地建立了不同區(qū)域普洱茶曬青毛茶的分子鑒別方法。為制定普洱茶曬青毛茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、打擊普洱茶的假冒偽劣產(chǎn)品，普界茶原產(chǎn)地保護(hù)奠定了必備的科學(xué)數(shù)據(jù)和技術(shù)保障，促進(jìn)了普洱茶的可持續(xù)健康發(fā)展。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表3-239個(gè)曬青毛茶引物E-MC/M-CTG的毛細(xì)管電泳圖譜主要峰值<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表4-139個(gè)曬青毛茶引物E-MC/M-CTA的毛細(xì)管電泳圖譜主要峰值<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表4-239個(gè)曬青毛茶引物E-MC/M-CTA的毛細(xì)管電泳圖譜主要峰值<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表4-339個(gè)曬青毛茶引物E-MC/M-CTA的毛細(xì)管電泳圖譜主要峰值<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>單位為堿基對(duì)bp;*代表染色信號(hào)最高值；tt代表染色信號(hào)次高值權(quán)利要求1、一種不同區(qū)域普洱茶曬青毛茶的分子鑒別方法，由樣本DNA的提取、選擇接頭和預(yù)擴(kuò)引物、AFLP引物篩選、AFLP擴(kuò)增、AFLP-毛細(xì)管電泳檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理和分析六個(gè)步驟組成，其特征在于(1)在AFLP引物篩選中，篩選出E-AAC/M-CTG和E-AAC/M-CTA兩對(duì)擴(kuò)增多態(tài)性最高的引物，用于AFLP分析，其序列如下，E-AAC5’-GACTGCGTACCAATTCAAC-3’M-CTG5’-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3’M-CTA5’-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3’；(2)在AFLP-毛細(xì)管電泳檢測(cè)中，選擇性擴(kuò)增樣本檢測(cè)在CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)上完成；其上樣液甲酰胺10ul，Sizestandard-6000.2ul，稀釋10倍的Sample3ul；電壓6KV，電流4Ma，時(shí)間50min；其擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率毛細(xì)管中電泳分離，激光激發(fā)熒光采集數(shù)據(jù)，電泳結(jié)果通過軟件自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析并轉(zhuǎn)化為“0、1”原始數(shù)據(jù)矩陣備用；同時(shí)，導(dǎo)出電泳分離圖譜。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在樣本DNA的提取中，樣本各取1.0g，分別按照改進(jìn)的CTAB法提取總DNA，提取的總DNA樣本經(jīng)RNA酶A純化后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm下的光密度值，以確定其純度和濃度，并將總DNA濃度稀釋到200ng/ul，用于PCR反應(yīng)。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于EcoRI接頭的核苷酸序列為5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3，、3'-CTGACGCATGGTTAA-5';MseI接頭的核苷酸序列為5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'、3'-TACTCAGGACTCATS';EcoRI預(yù)擴(kuò)引物的核苷酸序列為5'-GACTGCGTACCAATTC-3'(EO)、5'-GACTGCGTACCAATTCA國(guó)3'(El);MseI預(yù)擴(kuò)引物的核苷酸序列為5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'(MO)、5'-GATGAGTCCTGAGTAAA-3'(Ml)。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在AFLP擴(kuò)增中，樣本DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI、MseI分別酶切；雙酶切產(chǎn)物加入EcoRI和MseI接頭序列和T4連接酶進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物加入EcoRl和MseI引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)?4'C預(yù)變性2min，然后進(jìn)入循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94'C變性20sec，56'C退火30sec，72。C延伸2min，共20個(gè)熱循環(huán)，最后6(TC延伸30min，4'C冷卻后取出；預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍后，加入選定的引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增；選擇性擴(kuò)增為兩段循環(huán)，94"C預(yù)變性2min后，第一段循環(huán)為94r變性20sec，66-56。C退火30sec，72。C延伸2min，共10個(gè)熱循環(huán)；其中，退火溫度從66'C開始，每個(gè)循環(huán)降TC;第二段循環(huán)為94'C變性20sec，56'C退火30sec，72。C延伸2min，共20個(gè)循環(huán)，最后6(TC延伸30min，冷卻后取出檢測(cè)；擴(kuò)增反應(yīng)在MJResearchPTC200-we11thermalcycler上05、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于得到的原始數(shù)據(jù)矩陣，用POPGENEversion1.32軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析，獲得居群遺傳多樣性以常規(guī)的多態(tài)位點(diǎn)百分率(P)，Nd's基因多樣性指數(shù)He，Shannon多樣性指數(shù)Ho，基因多樣度Ht;同時(shí)，'進(jìn)行電泳分離圖譜的特征峰比對(duì)分析。全文摘要本發(fā)明公開一種不同區(qū)域普洱茶曬青毛茶的分子鑒別方法，屬分子標(biāo)記
技術(shù)領(lǐng)域：
。該方法由樣本DNA的提取、選擇接頭和預(yù)擴(kuò)引物、AFLP引物篩選、AFLP擴(kuò)增、AFLP-毛細(xì)管電泳檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理和分析六個(gè)步驟組成。AFLP引物為E-AAC/M-CTG和E-AAC/M-CTA兩對(duì)擴(kuò)增多態(tài)性最高的引物。選擇性擴(kuò)增樣本檢測(cè)在CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)上完成，電壓為6KV。本發(fā)明的一對(duì)引物可擴(kuò)增出200多個(gè)位點(diǎn)，位點(diǎn)差異在1bp都能檢測(cè)到；建立了西雙版納老班章、臨滄勐庫(kù)、普洱景邁等9個(gè)著名古茶園的AFLP標(biāo)準(zhǔn)圖譜，據(jù)此能鑒別不同區(qū)域的普洱茶曬青毛茶、著名古茶園普洱茶的真?zhèn)?，為普洱茶原產(chǎn)地保護(hù)提供了技術(shù)保障。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101353701SQ200810058670公開日2009年1月28日申請(qǐng)日期2008年7月11日優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日發(fā)明者季鵬章,俊張,黃興奇申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所