專(zhuān)利名稱(chēng)：：大姚黃芩組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生
技術(shù)領(lǐng)域：
，主要是產(chǎn)自云南楚雄州大姚縣的大姚黃芩的組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：大姚黃苳(6b"eJZ2rfa^w'朋aHan(iMazz)為云南省楚雄州具有地方特色的彝藥，彝藥名稱(chēng)為賒卡齊，是彝藥制藥工業(yè)的重要原料之一。以根入藥，性寒，味苦。能消熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎。用于濕溫、暑溫胸悶嘔惡，濕熱痞滿，瀉痢，黃疸，肺熱咳嗽，高熱煩渴，血熱吐衄，癰腫疫毒，胎動(dòng)不安?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明其具有抗菌、解熱及降壓作用，近年來(lái)藥理實(shí)M證明黃芩具有明顯的抗前列腺增生作用，很有可能成為理想的抗前列腺增生藥。由于野生資源有限，多年來(lái)生產(chǎn)上通常用分株和種子進(jìn)行大姚黃苓的繁殖。長(zhǎng)期以來(lái)，在大姚黃苳種植中存在只種不選，自繁自種，導(dǎo)致品種退化，病蟲(chóng)害嚴(yán)重，農(nóng)藥使用較多，無(wú)公害得不到保證等問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的正是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足而提供一種大姚黃苳組織培養(yǎng)的方法，以利用組織培養(yǎng)方法誘導(dǎo)大姚黃苳不定芽形成并再生植株，以擴(kuò)大繁殖系數(shù)，利用人工方法培育脫病脫毒復(fù)壯的優(yōu)良品種大姚黃苳，實(shí)現(xiàn)大姚黃芩的無(wú)公害生產(chǎn)。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的-大姚黃芩組織培養(yǎng)方法，其特征在于，方法步驟如下-①取大姚黃苳的莖尖為外植體，經(jīng)清洗消毒后，切取莖尖頂部0.20.3厘米；或者取莖段為外植體，經(jīng)清洗消毒后，切成0.51.5厘米的小莖段，每段帶1一2片真葉；對(duì)蓮尖或莖段進(jìn)行清洗消毒，是用洗淀劑溶液浸泡5射中，自來(lái)水沖5假后，用70%酒精浸泡1030秒，510%次氯酸鈉浸泡715分鐘，用無(wú)菌水沖洗810次；②將莖尖或小莖段接種到MS+BA0.050.5mg/L+NM0.050.5mg/Li咅養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)一周后形成愈傷組織；③將大姚黃苓的愈傷組織或小莖段接種到MS+BA0.5-3.0mg/L+NM0.05-0.5mg/L培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)15-30天，形成不定芽；④將大姚黃芩的不定芽形成的無(wú)根苗接種到1/2MS+NM0.51.0mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)812天，至試管苗生根。以上步驟中，所有的培養(yǎng)基均經(jīng)121QC滅菌1520力H中，培養(yǎng)時(shí)光照強(qiáng)度2000IX光照時(shí)間1214小時(shí)/天，培織度18土2t。本發(fā)明研究過(guò)程中，對(duì)不同激素配比對(duì)誘導(dǎo)大姚黃芩的莖尖和莖,生不定芽的影響進(jìn)行了對(duì)比研究，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，以6-BA、NM激素不同配比誘導(dǎo)大姚黃芩的莖段產(chǎn)生不定芽，其結(jié)果見(jiàn)表1(接種30天后觀察統(tǒng)計(jì))。表1.不同的激素配比及濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響激素配比及接種數(shù)愈傷誘導(dǎo)率不定誘導(dǎo)率出現(xiàn)單株不定芽備注濃度(m^L)形成數(shù)芽數(shù)時(shí)間不定芽數(shù)長(zhǎng)勢(shì)<table>complextableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>根據(jù)表1的結(jié)果，培養(yǎng)基為MS+BA0.5+NM0.5時(shí)，形成大量愈傷組織，愈傷誘導(dǎo)率高達(dá)100%;培養(yǎng)基為MS+BA1.03.0mg/L+NM0.5mg/L時(shí)，直接形成不定芽，誘導(dǎo)率均為100%，以BA3.Omg/L的培養(yǎng)基上的不定芽出現(xiàn)時(shí)間最早，增殖系數(shù)較高，但苗太弱。培養(yǎng)在BA濃度為lmg/L的培養(yǎng)基上的外植體，不定芽出現(xiàn)的時(shí)間稍晚35天，但增殖系數(shù)適中，不定芽長(zhǎng)勢(shì)最好。本發(fā)明研究過(guò)程中，還研究了不同培養(yǎng)基以及不同NM濃度對(duì)誘導(dǎo)大姚黃苳試管苗生根的影響。以MS和1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，用NAA的不同濃度作對(duì)比，對(duì)大姚黃苳試管苗生根培養(yǎng)進(jìn)行試驗(yàn)對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。表2.不同基本培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)大姚黃苳試管苗生根的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表3的結(jié)果表明，培養(yǎng)基為1/2MS+NM0.51.0mg/L時(shí)，試管苗10天生根，根多而且苗壯。綜上所述，以大姚黃苳的莖尖或莖段為夕卜植體，培養(yǎng)基為MS+BA0.5+NM0.5時(shí)愈傷組織形成，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100%;培養(yǎng)基為MS+BA1mg/L+NAA0.5mg/L時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)率可達(dá)100%，單株不定芽數(shù)為1015個(gè)，不定芽長(zhǎng)勢(shì)最好；發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基為1/2MS+NM0.51.0mg/L時(shí)，試管苗10贓右生根，根多而且苗壯。本發(fā)明方法大姚黃苳組織培養(yǎng)的誘導(dǎo)率高，培育的試管苗根多且苗壯，實(shí)現(xiàn)了用組織培養(yǎng)方法誘導(dǎo)大姚黃芩不定芽形成并再生植株，擴(kuò)大了繁殖系數(shù)。由于對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行了精選，并進(jìn)行了清洗消毒和莖尖培養(yǎng)，因此培育的再生植株能脫毒脫病。本發(fā)明首次利用人工方法培育出優(yōu)良品種大姚黃苳，可實(shí)現(xiàn)大姚黃芩的無(wú)公害生產(chǎn)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一自楚雄星升藥業(yè)公司藥園采得大姚黃苳，為降低初始培養(yǎng)的污染率，采回后種于花盆中，放置于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，每天用3%多菌靈噴布，進(jìn)行一周的預(yù)培養(yǎng)。之后，按下述方法步驟培養(yǎng)大姚黃苳組織①取大姚黃芩的莖尖為外植體，經(jīng)清洗消毒后，切取莖尖頂部0.2厘米；或者取莖段為外植體，經(jīng)清洗消毒后，切成0.5厘米的小莖段，每段帶l片真葉；對(duì)莖尖或莖段進(jìn)行清洗消毒，使采用洗淀劑溶液浸泡5^Ht，自來(lái)水沖5射中后，用70%酒精浸泡10秒，5%次氯酸鈉浸泡15分鐘，用無(wú)菌水沖洗8次。②將莖尖或小莖段接種到MS+BA0.05mg/L+NM0.05mg/L培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)一周后形成愈傷組織；③將大姚黃芩的愈傷組織或小莖段接種到MS+BA0.5mg/L+NM0.05mg/L培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)30天，形成不定芽；④將大姚黃芩的不定芽形成的無(wú)根苗接種到1/2MS+NM0.5呢/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天，至試管苗生根。以上步驟中，所有的培養(yǎng)基均經(jīng)12lt滅菌15分鐘，培養(yǎng)時(shí)光照強(qiáng)度2000LX，光照時(shí)間14小時(shí)/天，培^M度18±2°C。實(shí)施例二將大姚黃芩采回后種于花盆中，放置于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，每天用3%多菌靈噴布，進(jìn)行一周的預(yù)培養(yǎng)。然后按下述方法步驟培養(yǎng)大姚黃苳組織①取大姚黃芩的莖尖為外植體，經(jīng)清洗消毒后，切取莖尖頂部0.3厘米；或者取莖段為外植體，經(jīng)清洗消毒后，切成1.5厘米的小蓮段，每段帶2片真葉；對(duì)莖尖或莖段進(jìn)行清洗消毒，是用洗淀劑溶液浸泡5^H中，自來(lái)水沖5分鐘后，用70%酒精浸泡30秒，10%次氯勝內(nèi)浸泡7分鐘，用無(wú)菌水沖洗10次；②將莖尖或小莖段接種到MS+BA0.5rag/L+NM0.5mg/L培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)一周后形成愈傷組織；③將大姚黃芩的愈傷組織或小莖段接種到MS+BA3.0mg/L+NM0.5mg/L培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)15天，形成不定芽；④將大姚黃苳的不定芽形成的無(wú)根苗接種到l'/2MS+NM"1.0mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天，至試管苗生根。以上步驟中，所有的培養(yǎng)基均經(jīng)121°C滅菌20分鐘，培養(yǎng)時(shí)光照強(qiáng)度2000LX，光照時(shí)間12小時(shí)/天，培^Sit18士2t。實(shí)施例三-將大姚黃苳采回后種于花盆中，放置于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，每天用3%多菌靈噴布，進(jìn)行一周的預(yù)培養(yǎng)。然后按下述方法步驟培養(yǎng)大姚黃苳組織①取大姚黃苳的莖尖為外植體，經(jīng)清洗消毒后，切取莖尖頂部0.3厘米；或者取莖段為外植體，經(jīng)清洗消毒后，切成l厘米的小莖段，每段帶2片真葉；對(duì)莖尖或莖段進(jìn)行清洗消毒，是用洗淀劑溶液浸泡5分鐘，自來(lái)水沖5射中后，用70%酒精浸泡20秒，8%次氯酸鈉浸泡10分鐘，用無(wú)菌tK沖洗9次；②將莖尖或小莖段接種到MS+BA0.25mg/L+NAA0.25mg/L培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)一周后形成愈傷組織；(D將大姚黃芩的愈傷組織或小莖段接種到MS+BA2.0mg/L+NM0.2mg/L培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)20天，形成不定芽；④將大姚黃芩的不定芽形成的無(wú)根苗接種到1/2MS+NM0.8呢/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，至試管苗生根。以上步驟中，所有的i咅養(yǎng)基均經(jīng)121QC滅菌1520分鐘，培養(yǎng)時(shí)光照強(qiáng)度2000LX，光照時(shí)間13小時(shí)/天，培，度18±2QC。權(quán)利要求1、大姚黃芩組織培養(yǎng)方法，其特征在于，方法步驟如下①取大姚黃芩的莖尖為外植體，經(jīng)清洗消毒后，切取莖尖頂部0.2～0.3厘米；或者取莖段為外植體，經(jīng)清洗消毒后，切成0.5～1.5厘米的小莖段，每段帶1-2片真葉；對(duì)莖尖或莖段進(jìn)行清洗消毒，是用洗淀劑溶液浸泡5分鐘，自來(lái)水沖5分鐘后，用70％酒精浸泡10～30秒，5～10％次氯酸鈉浸泡7～15分鐘，用無(wú)菌水沖洗8～10次；②將莖尖或小莖段接種到MS+BA0.05～0.5mg/L+NAA0.05～0.5mg/L培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)一周后形成愈傷組織；③將大姚黃芩的愈傷組織或小莖段接種到MS+BA0.5～3.0mg/L+NAA0.05～0.5mg/L培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)15～30天，形成不定芽；④將大姚黃芩的不定芽形成的無(wú)根苗接種到1/2MS+NAA0.5～1.0mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～12天，至試管苗生根。以上步驟中，所有的培養(yǎng)基均經(jīng)121℃滅菌15～20分鐘，培養(yǎng)時(shí)光照強(qiáng)度2000LX，光照時(shí)間12～14小時(shí)/天，培養(yǎng)溫度18±2℃。全文摘要大姚黃芩組織培養(yǎng)方法。取大姚黃芩的莖尖為外植體，清洗消毒后切取莖尖頂部0.2～0.3厘米；或者取莖段為外植體，清洗消毒后切成0.5～1.5厘米的小莖段，每段帶1-2片真葉；將莖尖或小莖段接種到MS+BA0.05～0.5mg/L+NAA0.05～0.5mg/L培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)形成愈傷組織；將愈傷組織或小莖段接種到MS+BA0.5～3.0mg/L+NAA0.05～0.5mg/L培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)形成不定芽；將不定芽形成的無(wú)根苗接種到1/2MS+NAA0.5～1.0mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至試管苗生根。本發(fā)明可誘導(dǎo)大姚黃芩不定芽形成并再生植株，以擴(kuò)大繁殖系數(shù)，利用人工方法培育脫病脫毒復(fù)壯的優(yōu)良品種大姚黃芩。文檔編號(hào)C12N5/04GK101353638SQ20081005887公開(kāi)日2009年1月28日申請(qǐng)日期2008年9月2日優(yōu)先權(quán)日2008年9月2日發(fā)明者范樹(shù)國(guó),璐邱申請(qǐng)人:楚雄師范學(xué)院