專利名稱：：檢測芯片的制備方法及利用該芯片檢測病原體的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于微生物檢測技術，尤其是乳與乳制品中病原微生物的核酸檢測技術；特別是涉及一種可同時檢測12個食品樣本中病原體的方法及所用芯片。
背景技術：
：食源性病原菌常造成群發(fā)性的傷害，給人們的身體健康及生命財產造成了一定的危害。據世界衛(wèi)生組織(WHO)不完全統計報告，2000年全球有210萬人死于腹瀉，大部分歸因于食物和飲用水中致病菌的污染。據國家衛(wèi)生部統計，2000年共收到重大食物報告達150起，導致6237人中毒、135人死亡；2001年共發(fā)生重大食物中毒事件185起，導致15715人中毒，146人死亡。判斷是否為細菌性食源性疾病的依據主要包括流行病學調査、病人的潛伏期和特有的中毒表現以及實驗室診斷，而實驗室診斷能最終能確定食源性疾病的病因；所以針對食品中病原微生物進行快速檢測，能用于解決控制食品質量以及保證食品安全等這些當今的主要問題。隨著社會生產力的發(fā)展和人類社會的不斷進步，食品中病原微生物的檢測出現了一些新的問題和挑戰(zhàn)，各國和各地區(qū)政府以及相關的國際機構都出臺了相應的食品檢測控制模式，隨之出現了很多與之相對應的食品安全檢測新技術和新方法。病原體檢測技術一直是國內和國際上研究的熱點，也是食品安全監(jiān)管體系的重要組成部分。傳統的乳與乳制品的微生物檢測采用國家標準規(guī)定的檢測方法，就是將含病原菌的乳制品涂平板，然后用培養(yǎng)基培養(yǎng)到一定程度后，在電鏡、顯微鏡下觀察，根據菌落的顏色、形態(tài)等生化指標進行分辨。該方法優(yōu)點是成本低，曾一度被認為是微生物檢測的經典方法，是后來各種檢測方法的基礎平臺，在各個國家均被認可，但缺點也很明顯，首先時間上需要很長時間，一般為2—7天；對一些表型特征變異的菌株，用傳統的形態(tài)學經驗很難辨別，受主觀的經驗影響較大。免疫學方法中最常用的是Elisa、免疫沉淀和抗體印跡等方法，其優(yōu)點是可以通過酶聯的方法將信號放大，從而檢測到微量的病原體。然而免疫法依賴抗原抗體的特異性反應來檢測目的樣本中的病原體，因此，實驗的靈敏度很大程度上依賴于抗體的好壞一方面，制作抗體是一個耗時耗力的工作，而且即使抗體制作的再好，也會由于抗原表面決定簇類似的原因，使結果出現交叉反應；另一方面，有些病原變異極快，如禽流感病毒，存在很多的亞型，并且經常變異，從而使抗體失效，不能檢測新的抗原。由于免疫法是基于抗原抗體反應的，因而，在前期樣品處理過程也較為麻煩，為了檢測不同的病原菌，需要用不同的處理方法，而且不同pH值、不同濃度、不同狀態(tài)的樣本都會對結果產生較大的影響。在靈敏度方面也存在一個極限，一旦低于這個極限，免疫法就難以檢測。自從PCR技術于1985年發(fā)明以來，由于其高度敏感性、特異性等特點使其在食品微生物檢測中得到了廣泛應用，而且由此衍生出了多種方法進行檢測。現在經常應用的有實時熒光定量PCR、免疫PCR、反轉錄PCR和多重PCR等，它們都是針對食品中病原菌的特異性靶基因(通常是致病基因)進行檢測，而集保守性和可變性于一體的23SrRNA基因幾乎存在于所有細菌中，真細菌的16SrRNA和23SrRNA保守性非常強，被稱之為"細菌進化的活化石"。但這種保守性也是相對的，也就是說在16SrRNA和23SrRNA序列上存在著每種細菌特異性片段，這也為細菌的檢測提供了理論依據；另外16S23S區(qū)間序列的擴增也可以鑒別出16S不能鑒別的、非常接近的菌種和種內細菌之間的鑒別。如近期由中國檢驗檢疫科學研究院研究成功的《豬鏈球菌多重PCR檢測方法》在北京通過了專家鑒定。該方法將檢測豬鏈球菌的時間從過去的4天減少到了4小時。并首次建立了具有自主知識產權的豬鏈球菌16S核糖體、莢膜多糖(CPS)的特異性引物。然而由于PCR反應非常靈敏，容易因污染而導致假陽性結果。并且，每次PCR或realtimePCR只能對1種基因成分進行檢測，效率低，周期長。基因芯片具有高通量檢測的優(yōu)點，僅靠一個實驗就能檢測出大量的未知菌，所以基因芯片技術在微生物研究領域的成功經驗為其應用于食品微生物特別是致病菌的檢測打下了基礎。目前也已經有部分用于食品檢測的芯片，然而，這些芯片也有以下一些缺點和不足1、雖然能做到高通量檢測病原，但一般一張芯片只能檢測一種樣本的所有病原體；2、熒光標記目前一般有兩種，一種是在擴增的同時加入Cy-dCTP，但由于Cy是一個大分子，空間位阻較大，因此在鏈延伸過程中不容易結合上去；另一種方法是先合成帶熒光基團的引物，這種方法也具有較大的缺點首先，帶熒光的引物不易保存，放久了就會發(fā)生熒光淬滅；其次，合成帶熒光的引物價格較貴，而且擴增不同的基因就需要不同的引物，就需要合成許多帶熒光的引物；最后，由于引物帶有熒光，一旦純化，或洗滌步驟未做好，則結果中會出現假陽性，或者背景信號局部很高等情況。
發(fā)明內容本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種檢測芯片的制備方法及利用該芯片檢測病原體的方法，該檢測方法步驟簡潔、易于操作，且檢測結果正確率高。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種檢測芯片的制備方法，包括以下步驟-1)、設計細菌的寡核苷酸探針每種細菌至少含兩條探針，各探針利用常規(guī)軟件進行設計，每條探針均必須符合以下條件長度為5060mer，Tm值差異在5度之內，各探針內部發(fā)夾結構《5個、GC含量為40%55%、重復的單一堿基的連續(xù)《5個，分子最穩(wěn)定的二級結構配對堿基長度少于6bp;2)、芯片制備-將步驟l)所得的探針與Comingprintbuffer等體積比混合后，利用點樣儀點制芯片；將所得的芯片在預雜交液進行預雜交，再清洗、干燥后；得檢測芯片。作為本發(fā)明的檢測芯片的制備方法的改進大腸菌群的探針為SEQIDNO:1SEQIDNO:4中的任意一種；乳酸菌的探針為SEQIDNO:5SEQIDNO:8中的任意一種；沙門氏菌的探針為SEQIDNO:9SEQIDNO:13中的任意一種；志賀氏菌的探針為SEQIDNO:14SEQIDNO:15中的任意一種；金黃色葡萄球菌的探針為SEQIDNO:16SEQIDNO:20中的任意一種；霉菌的探針為SEQIDNO:21SEQIDNO:24中的任意一種；酵母的探針為SEQIDNO:25SEQIDNO:28中的任意一種。作為本發(fā)明的檢測芯片的制備方法的進一步改進步驟2)中的預雜交液由20XSSC100ml、10%SDS4ml、10%BSA40ml和ddH20276ml組成。本發(fā)明還同時提供了利用上述方法制備的芯片檢測多個食品樣本中病原體的方法，包括以下步驟1)、設計引物-從數據庫中獲得上述每種細菌的基因組序列，然后利用常規(guī)軟件設計對應每種細菌的引物；每對引物均需符合以下條件使擴增產物在200bp左右，引物與引物之間配對堿基長度少于6bp;CG含量為4055。/。；Tm差異在5'C之內；2)、待測樣品中DNA的提取，得提取液；3)、靶基因的多重PCR擴增將步驟2)的提取液做為PCR模板，分別利用步驟l)所得的引物進行多重PCR擴增；得擴增產物；4)、芯片雜交檢測先利用熒光染料標記擴增產物；再將上述標記后的擴增產物與芯片雜交；5)、雜交結果的檢測與分析用掃描儀掃描上述雜交后的芯片，利用常規(guī)軟件對結果進行分析。作為本發(fā)明的檢測多個食品樣本中病原體的方法的改進大腸桿菌的引物對為SEQIDNO:29SEQIDNO:36這4對引物中的任意一對；乳酸菌的引物對為SEQIDNO:37SEQIDNO:44這4對引物中的任意一對；沙門氏菌的引物對為SEQIDNO:45SEQIDNO:54這5對引物中的任意一對；志賀氏菌的引物對為SEQIDNO:55SEQIDNO:58這2對引物中的任意一對；金黃色葡萄球菌的引物對為SEQIDNO:59SEQIDNO:68這5對引物中的任意一對；霉菌的引物對為SEQIDNO:69SEQIDNO:76這4對引物中的任意一對；酵母的引物對為SEQIDNO:77SEQIDNO:84這4對引物中的任意一對。在本發(fā)明的檢測芯片的制備方法中，利用Armydesigner4.2軟件進行設計所得的各探針序列具體如表1所示表l、探針序列<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發(fā)明的檢測芯片的制備方法，是利用BLAST軟件對所設計的探針進行序列比對，排除與非目的序列比對分值超過40的探針，并經過預實驗，再次排除出現假陽性假陰性的探針；最終得到了上述表l所示的探針序列。本發(fā)明的利用芯片檢測病原體的方法，各類菌的上下游序列如表2所示:表2、引物序列(l).Coliformbacteria大腸菌群<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(2)丄actobacillus乳酸菌<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(3).Salmoneila沙門氏菌<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(4).Shigella志賀氏菌<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(5).Staphylococcusaureus金黃色葡萄球菌<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(6).Mold霉菌<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(7).Yeast酵母<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>上述引物序列是通過從NCBI數據庫中獲得各菌的基因組序列，然后利用primer5.5軟件進行設計而獲得的。采用本發(fā)明方法制備的芯片具有高密度的特點，每平方厘米超過4000點，因此利用圍欄將芯片隔成12個獨立的亞矩陣，每個亞矩陣能點制至少30X30的點陣，以每個點兩個重復計算，則我們的芯片，就能同時檢測12個樣本，每個亞矩陣能檢測每個樣本中450種不同病原體，從而大大降低了檢測成本。本發(fā)明的利用芯片檢測病原體的方法，使用了間接熒光標記技術，即引進了胺酰dUTP的間接標記技術，直到雜交前，才將熒光染料標記上去。這樣，只需合成普通的引物，在普通的條件下完成擴增，等樣品量到達一定量后，一起染色，雜交，鑒定。而利用熒光染料標記引物的方法，由于引物、擴增產物由于帶有熒光標記，因此各操作步驟都需盡量在避光條件下進行，且產物需要盡快雜交、檢測以防熒光淬滅，因此不易存放。同吋，熒光信號強度比其他標記方法也大大增強了，因為，在兩個引物上各加一個熒光標記的方法，這樣的PCR產物，最多只帶有兩個熒光基團(上下游引物各一個)；另一種方法是在dNTP中摻入一定比例的Cy—dNTP,但由于空間位阻的關系，分子較小的dNTP會競爭性的優(yōu)先加到聚合鏈上，導致PCR產物中真正含熒光基團的分子非常少，而我們先將小分子胺酰dUTP摻入到dNTP中，就會大大增加dUTP被加到聚合鏈上的概率，然后再將熒光染料標記上去，這樣一個200bp的PCR產物，帶有的熒光基團，是前兩種方法的5—10倍。因此，大大增加了產物的信號，從而也間接增強了檢測的靈敏度。下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖1是一張多樣本檢測芯片的示意圖；此芯片被分隔為12個亞矩陣，每個亞矩陣點制8X8的點，每個亞矩陣能檢測一種樣本的所有病原體；圖2是圖1中的其中一個亞矩陣的示意圖，共8X8個點，右上角為陰性探針，其余三個角為陽性探針，其他為28條特異性病原體檢測探針。三個角的陽性探針，用于質量控制以及肉眼觀察芯片掃描后的圖片時的定位作用。具體實施方式參照上述附圖，對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細說明。實施例l、一種檢測芯片的制備方法，依次進行以下步驟1)、設計細菌的寡核苷酸探針從NCBI數據庫中獲得大腸桿菌、乳酸菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、霉菌和酵母這7種菌的基因組序列，然后利用Arraydesigner4.2軟件進行設計，所得的探針序列具體如表1所示。每種細菌選用如表l所示的全部探針，即大腸桿菌選用SEQIDNO:1SEQIDNO:4所示的這4條探針，其余細菌以此類推。2)、芯片制備-選用表1所示的28條探針，以及l(fā)條陰性(序列為GGCA-3)，l條陽性探針(GAPDH:TAC-3)，共計30條探針。每條探針重復點樣兩次。陰性探針兩個點，點在右上角，陽性探針，分別點在另外的三個角，每張芯片點12個亞矩陣，每個亞矩陣為8X8個點陣。濃度67mM的探針與Comingprintbuffer按照1:1體積(即各取2.5pl)混合后進行點樣。用OmniGridAccent高通量芯片點樣儀點制芯片(點間距250um，點直徑100um)。保持50%的濕度過夜，然后將芯片在于42度預熱的預雜交液中(20XSSClOOrnl，10%(V/V)SDS4ml，10%(V/V)BSA40ml，ddH20276ml,Total420ml)預雜交40min，再立即用水洗2min，異丙醇清洗2min，再用玻片離心機800rpm甩干，得檢測芯片，備用。實施例2、一種檢測多個食品樣本中病原體的方法，選用實施例l所得的檢測芯片，依次進行以下步驟1)、設計引物從NCBI數據庫中獲得大腸桿菌、乳酸菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、霉菌和酵母這7種菌的基因組序列，然后利用primer5.5軟件進行設計，上述每種細菌所對應的引物序列具體如表2所示。2)、待測樣品中DNA的提取，以12種乳液或液體狀的乳制品作為待測樣品，每種待測樣品分別依次進行以下步驟-①、取50ml樣品，4°C，1000-2000rpm離心20min,棄上層懸浮物；②、加10mlPBS,輕輕震蕩將沉淀重新懸浮，4'C，1000-2000rpm離心20min,棄上層懸浮物；③、重復2)以除去乳脂和乳蛋白；、待乳脂和乳蛋白除干凈后，5000Xg離心10min，棄上清；⑤、加入22(^l的TEN(lmLlMTris，pH7.2;0.2mL0.5MEDTA.pH8.0;0.5844gNaCl;加水至100mL)和3pl1NNaOH，劇烈振蕩，直到沉淀完全懸浮，如果不融，可按22:3的比例加入TEN和NaOH，直到完全懸浮為止。◎、將1.5mL的離心管置于95'C的水浴鍋中加熱8min，然后放入冰盒中冷卻。⑦、檢測DNA濃度。3)、靶基因的多重PCR擴增-將步驟2)所得的每種待測樣品DNA的提取液分別利用步驟1)所得每種菌的所有引物進行多重PCR擴增；具體步驟如下25(alPCR反應體系中，含有10XPCR緩沖液(含15mMMg離子)，aadUTP/dNTP(10mM，含2mM胺酰標記的dUTP)2.0^1，TaqDNA聚合酶(2U/ml)0.5^1，引物(20pmol/pl)各0.5^，待測樣品的DNA提取液l^d，加不含核酸酶的水補足到25pl)。PCR循環(huán)參數94。C預變性5min;94。C變性30秒，58。C退火30秒，72。C延伸25秒，共35個循環(huán)。得擴增產物。因此，每種待測樣品DNA的提取液能對應得到7種擴增產物。4)、芯片雜交檢測①、熒光染料標記擴增產物將粉末狀染料每包(lmg)用72^1DMSO溶解，然后分裝，-2(TC暗處存放。對每種待測樣品分別進行如下工作將上述步驟3)所得的7種擴增產物的每種中各取10pl進行混合，然后按2pl染料/每10nl產物的量加入熒光染料混勻，在黑暗室溫環(huán)境下放置l小時。并進行純化、洗脫，并濃縮至7pl;得雜交探針。因此，一共得到12種探針。②、樣品與芯片雜交將上述步驟①所得的每種待測樣品的雜交探針分別進行如下處理先將蓋片蓋到芯片上，再將得到的雜交探針與2XF雜交液(250W20XSSC;250ri去離子甲酰胺；10W10%SDS)混合，在98'C變性2分鐘，然后迅速置于冰上。5min后取出，稍稍離心，然后用移液槍吸取，從蓋片上的小孔加入液體，液體會隨著張力，擴散到探針陣列區(qū)域。每個樣品加到一個亞矩陣，在58度雜交2h。然后分別用洗脫液1(2XSSC，0.1%SDS，需42。C預熱)、洗脫液2(0.5XSSC，0.01%SDS，需42。C預熱)、洗脫液3(0.06XSSC)各洗5min。再用玻片離心機800rpm甩干。5)、雜交結果的檢測與分析-用AgilentG2505B掃描儀掃描上述雜交后的芯片，利用genepix軟件對結果進行分析。具體結果如下表3所示表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>為了充分證明本發(fā)明方法的正確性，發(fā)明人將實施例2所用的12種樣品根據國標要求涂平板培養(yǎng)。具體結果如表4所示表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>樣品4(FY06)原奶，取自富陽市某奶場25ml牛奶中未檢出樣品4(FY07)原奶，取自富陽市某奶場25ml牛奶中未檢出樣品4(FY08)原奶，取自富陽市某奶場只檢出大腸桿菌30MPN/訓ml樣品9(TL01)原奶，取自桐盧市某奶場25ml牛奶中未檢出樣品10(TL02)原奶，取自桐盧市某奶場25ml牛奶中未檢出樣品11(TL03)原奶，取自桐盧市某奶場25ml牛奶中未檢出樣品12純奶，經121度高溫20分鐘25ml牛奶中未檢出兩種方法顯示，志賀菌、霉菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌均為陰性結果，而大腸桿菌的檢測結果也基本符合。然而用本實驗方法檢出的乳酸菌，用傳統的平板法則都未能檢出，其原因有可能是核酸法比平板法更為靈敏，也有可能是原奶的生產場地，運用了抗生素，而導致傳統的平板法不能正常培養(yǎng)細菌，而產生陰性結果。但從整體上計算，本實驗的最終檢測結果與涂平板法一致性達95%以上。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。序列表SEQIDNO:15-CACGCTGATATGTAGGTGAAGTGATTTACTCATGGAGCTGAAATCAGTCGAAGATACCA-3SEQIDNO:25-CTTTGGTTTCGCTCAATACTACATCTTTACTCACTGTAGCCTGATAAGTAATCCCACCA-3SEQIDNO:3SEQIDNO:4SEQIDNO:55-CGGCAATTTAAAACAATTAATACAATGATATCCAGTTTTCAAAGAACAAAGTCGCACCC-3SEQIDNO:65-TTAAGTGAATACATAGCTTAAGGAGGGAACACGCAGTGAACTGAAACATCTAAGTAGCT-3SEQIDNO:75-TAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTT-3SEQIDNO:85-TCAAAACTGGCTATCATTGTTTAATTGCTGCCTTGAACTTAACGTACTTGTCATCGAAA-3SEQIDNO:95-TTTGATTTGATGCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGTCGTGTCCTTTGGTATTAATCC-3SEQIDNO:105-GAGAGCTGAAACAAAGACTCTTTATACGGAAGAATGGCACTCTTATCCCAACCGAATTT-3SEQIDNO:115-GGATTTAGTGCTAACGGCACAGGCTGCATAAACCAGTTTACCTTCGAAATGAATAGTAC-3SEQIDNO:125-ATTATTATCTATACGCTGTTCACTTTCCAGAAATTCTCTTATCGTCGGTAAGGCACGCT-3SEQIDNO:135-TTACGCATAATTACGATGGCTCCTCATTCATACTGCATATCGAAATACATGACCGCCGT-3SEQIDNO:145-GTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTATCTCATCCACAAAATGGAGAGTTCTGACTTTATC-3SEQIDNO:155-CTCAGTCTGTTATCGCTGGCTTTAAGTACAGTTAAGGACGGAGGGAGTTCTGGCAGAGA-3SEQIDNO:165-ACTATATACTGTTGGATCTTCAGAACCACTTCTATTTACGCCGTTATCTGTTTGTGATG-3SEQIDNO:175-ACCACCAGCATAATAAACAACTTCAAATGGATTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAGATAG-3SEQIDNO:185-ATACTCAGTTGTAAAGCCATGATGCTCGTAACCATGTGATTTAAACAAGTTTACTAGGG-3SEQIDNO:19SEQIDNO:205-ATGACCAGCTTCGGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCTTTTACATACAGAACACAAT-3SEQIDNO:215-GGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTT-3SEQIDNO:225-TTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAATAAGGATTGACAGAT-3SEQIDNO:235-CGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACG-3SEQIDNO:245-GTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCT-3SEQIDNO:255-GCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTGCTAATTGGCATAC-3SEQIDNO:265-CAGAGGTGAAATTCTTAGATTTACTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGA-3SEQIDNO:275-GTAAGGAACCAAACAGATCTATCAACCCAGATGAAGCTGTTGCTTACGGTGCTGCTGTT-3SEQIDNO:285-CTGAAGTTTCCGATGTCGGTAACGCTATCTTGGATGGTGCTGACTGTGTTATGTTGTCT-3SEQIDNO:29ACACAGGTGGTCAGGTAGAGSEQIDNO:30CGTCCACTTTCGTGTTTGCSEQIDNO:31TGCGACAACCTCTCCAGTAGSEQIDNO:32GTCACAGAGCCGTTATCCTTGSEQIDNO:33GCCGTAATGATGCGATAATAGCSEQIDNO:34GGTGTTCTGGTGGCTAAAGTGSEQIDNO:35TGTTTATGGCGGTTTTATTTGCSEQIDNO:36AGGTACTGGATTTGATTGTGACSEQIDNO:37ATCACCCTCAAGCACCCTAACSEQIDNO:38CGTCCTTCATCGGCTCCTAGSEQIDNO:39ACTGGAAGCCGATGAAGGACSEQIDNO:40TTCGCTCGCCGCTACTTGSEQIDNO:41AAGTCGGAATCGCTAGTAATCGSEQIDNO:42ATCCAGCCGCAGGTTCTCSEQIDNO:43AGTAAGAGCGCGAAGTGGSEQIDNO:44CTCTCAAAACTGGCTATCATTGSEQIDNO:45CAACTTGCGGAGCGTCTACSEQIDNO:46TGCTACCTTGCTGATGGATTGSEQIDNO:47TCCTTCAGTATCGCAACATCAGSEQIDNO:48TACCCGTAGGTCCGATTTCCSEQIDNO:49GGTTGCGGCTGATCCTACTCSEQIDNO:50GTGTTGGTGTTATCTGCCTGACSEQIDNO:51CGATGAATTACGCTCACAACACSEQIDNO:52GGGCAACCAGCACTAACGSEQIDNO:53CCGACTCGGTGGTCTATCSEQIDNO:54CGATGCCGTACAGGATATSEQIDNO:55CGAAATTCTGGAGGACATTGCSEQIDNO:56TCATTCTCTTCACGGCTTCTGSEQIDNO:57CCCGCACATACAAGAACTTAACSEQIDNO:58GCAAGGAAGATGGAAGAGAAGGSEQIDNO:59AAAGGGCAATACGCAAAGAGGSEQIDNO:60TAACCGTATCACCATCAATCGCSEQIDNO:61AGCACATAACAAGCGAGATAACSEQIDNO:62CGGTCAATGCCATGATTTAATGSEQIDNO:63TCGAATCGTGGTCCAGTAATGSEQIDNO:64AGGTTTAATACGCCCATCCATCSEQIDNO:65GGTGGTGTAACTGAGCATAATGSEQIDNO:66CCGTTTCATAAGGCGAGTTGSEQIDNO:67GGTACACGATATTCTTCACGACSEQIDNO:68TCTGGGGATAATGAAGGGAAACSEQIDNO:69GGGGAACCAGGACTTTTACTGSEQIDNO:70GAAAACATCCTTGGCGAATGCSEQIDNO:71TATGGTCGCAAGGCTGAAACSEQIDNO:72TCGTTCGTTATCGCAATTAAGCSEQIDNO:73GTCCGTGCCCGTGTAAAGSEQIDNO:74GCTTCCCTTTCAACAATTTCACSEQIDNO:75GCCAATCCTACAGAGCATGTGSEQIDNO:76GATGAAGAACGCAGCGAAATGSEQIDNO:77CGGGGAAACTGCGAATGGSEQIDNO:78AGGGCAGAAATTTGAATGAACCSEQIDNO:79GGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGSEQIDNO:80TCACTGTACTTGTTCGCTATCGSEQIDNO:81GGCATCAGTATTCAGTTGTCAGSEQIDNO:82TTCAGCCTTGCGACCATACSEQIDNO:83GTCTTGGTCGGTGGTTCTACSEQIDNO:84GAGCGACATCCAACAACAATAG權利要求1、一種檢測芯片的制備方法，其特征是包括以下步驟1)、設計細菌的寡核苷酸探針每種細菌至少含兩條探針，各探針利用常規(guī)軟件進行設計，每條探針均必須符合以下條件長度為50～60mer，Tm值差異在5度之內，各探針內部發(fā)夾結構≤5個、GC含量為40％～55％、重復的單一堿基的連續(xù)≤5個，分子最穩(wěn)定的二級結構配對堿基長度少于6bp；2)、芯片制備將步驟1)所得的探針與Corningprintbuffer等體積比混合后，利用點樣儀點制芯片；將所得的芯片在預雜交液進行預雜交，再清洗、干燥后；得檢測芯片。2、根據權利要求l所述的檢測芯片的制備方法，其特征是所述大腸菌群的探針為SEQIDNO:1SEQIDNO:4中的任意一種；所述乳酸菌的探針為SEQIDNO:5SEQIDNO:8中的任意一種；所述沙門氏菌的探針為SEQIDNO:9SEQIDNO:13中的任意一種；所述志賀氏菌的探針為SEQIDNO:14SEQIDNO:15中的任意一種；所述金黃色葡萄球菌的探針為SEQIDNO:16SEQIDN0:20中的任意一種；所述霉菌的探針為SEQIDNO:21SEQIDNO:24中的任意一種；所述酵母的探針為SEQIDNO:25SEQIDNO:28中的任意一種。3、根據權利要求1或2所述的檢測芯片的制備方法，其特征是所述步驟2)中的預雜交液由20XSSClOOrnl、10%SDS4ml、10%BSA40ml和ddH20276ml組成。4、利用權利要求13中任意一種方法制備的檢測芯片檢測多個食品樣本中病原體的方法，其特征是包括以下步驟1)、設計引物從數據庫中獲得上述每種細菌的基因組序列，然后利用常規(guī)軟件設計對應每種細菌的引物；每對引物均需符合以下條件使擴增產物在200bp左右，引物與引物之間配對堿基長度少于6bp;CG含量為4055n/。；Tm差異在5度之內；2)、待測樣品中DNA的提取，得提取液；3)、靶基因的多重PCR擴增將步驟2)的提取液作為PCR模板，分別利用步驟l)所得的引物進行多重PCR擴增；得擴增產物；4)、芯片雜交檢測先利用熒光染料標記擴增產物；再將上述標記后的擴增產物與芯片雜交；5)、雜交結果的檢測與分析用掃描儀掃描上述雜交后的芯片，利用常規(guī)軟件對結果進行分析。5、根據權利要求4所述的檢測多個食品樣本中病原體的方法，其特征是所述大腸桿菌的引物對為SEQIDNO:29SEQIDNO:36這4對引物中的任意一對；所述乳酸菌的引物對為SEQIDNO:37SEQIDNO:44這4對引物中的任意一對；所述沙門氏菌的引物對為SEQIDNO:45SEQIDNO:54這5對引物中的任意一對；所述志賀氏菌的引物對為SEQIDNO:55SEQIDNO:58這2對引物中的任意一對；所述金黃色葡萄球菌的引物對為SEQIDNO:59SEQIDNO:68這5對引物中的任意一對；所述霉菌的引物對為SEQIDNO:69SEQIDNO:76這4對引物中的任意一對；所述酵母的引物對為SEQIDNO:77SEQIDNO:84這4對引物中的任意一對。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測芯片的制備方法，包括以下步驟1)設計細菌的寡核苷酸探針；2)芯片制備。本發(fā)明還同時公開了利用上述檢測芯片檢測多個食品樣本中病原體的方法，包括以下步驟1)設計引物；2)待測樣品中DNA的提取，得提取液；3)靶基因的多重PCR擴增；4)芯片雜交檢測；5)雜交結果的檢測與分析。本發(fā)明的檢測方法步驟簡潔、易于操作，且檢測結果正確率高。文檔編號C12Q1/04GK101240347SQ20081006012公開日2008年8月13日申請日期2008年3月11日優(yōu)先權日2008年3月11日發(fā)明者華楊,洪旭濤,謙袁,暉邵,陳偉光,項春生申請人:浙江大學