專利名稱：：一種利用原位合成微流體芯片的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物中非編碼小RNA的檢測和鑒定方法，尤其涉及采用芯片檢測已知miRNA的方法。技術(shù)背景MicroRNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核生物中的非編碼小RNA，它們通過與靶標(biāo)mRNA序列互補(bǔ)而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在植物生長發(fā)育的基因表達(dá)調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用。保守性是miRNAs功能的指示器，保守miRNAs在保守基因的調(diào)節(jié)過程中扮演著非常重要的角色，如葉和花的形態(tài)學(xué)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。不保守miRNAs可能在特定的植物物種中扮演著更多特定的角色，如棉花纖維的分化和延伸。miRNA在動物或者植物的不同種群中都存在高度的保守性。例如，在動物中miRNAs，如miR7和miR18在從蠕蟲到人類都是保守的。miRNAs的保守性在植物中也同樣存在，研究發(fā)現(xiàn)一些植物miRNAs不僅存在于單子葉和雙子葉植物中，而且也存在于蕨類和苔類植物中。miRNA的種間保守性特征為根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道預(yù)測其它植物中的miRNA提供了可能，但至今還沒有公開報(bào)道這方面的系統(tǒng)方法。根據(jù)SangermiRbase數(shù)據(jù)庫(Release7.1，http:〃microrna.sanger.ac.uk/sequences/)，至[J2006年為止已纟圣在!以南芥04ra6/c/ops/51f/za//a"a)、大豆(G7yc/"eOTocc)、苜蓿(JWec/fcago&""(:0(/1//")、水稻(Oyzasa/tw)、毛果楊(戶opw/w""'c/7ocarpa)、高粱(5bz-g7z謂6z'co/or)、甘蓆(iSacc/wr簡c^a'朋ra附)和玉米(Zeama")等8種高等植物中報(bào)道了731條前體miRNA，分布于68個保守的miRNA家族中。以上miRNA主要是根據(jù)miRNA結(jié)構(gòu)特征通過生物信息學(xué)方法推測得到，其中只有少部分miRNA得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。目前獲得植物中miRNA存在信息的方法，主要是根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的植物基因組序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)推測。其確定標(biāo)準(zhǔn)是1)序列必須能折疊出發(fā)夾結(jié)構(gòu)，且發(fā)夾中不存在突環(huán)；2)miRNA成熟序列必須位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的臂；3)miRNA與其對側(cè)的miRNA+存在少于6個堿基的失配；4)pre-miRNA具有3075。/。的A+U含量；5)預(yù)測得到的發(fā)夾結(jié)構(gòu)具有較高的minimalfreeenergyindex(MFEIs)和較低的negativeminimalfreeenergies(MFEs)。但是這些推測得到的miRNA需要通過試驗(yàn)驗(yàn)證才能確定。目前對基于生物信息學(xué)手段得到的miRNA(或其他sNC-RNA)進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證，或?qū)τ谖催M(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測的物種中的miRNA(或其他sNC-RNA)進(jìn)行鑒定和檢測的方法還比較欠缺。以miRNA為例，迄今為止進(jìn)行驗(yàn)證的方法有基因克隆、Northern雜交、RT-PCR鑒定等。基因克隆方法對完全未知的生物物種的miRNA主要是采用(試劑盒)提取小于200nt(或50nt)的單鏈RNA(ssRNA)，用3'和5'接頭連接，或用RACE試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增獲得其全長cDNA，然后與載體連接、克隆、測序。對于其他sNC-RNA其基因克隆方法也是一樣。該方法由于涉及到小RNA操作，而單鏈RNA極容易降解，在操作上對實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)要求較高。尤其是，不同miRNA表達(dá)豐度存在差異，采用該方法往往容易獲得那些高豐度的miRNA的克隆，對于低豐度表達(dá)的miRNA則不容易獲得其克隆產(chǎn)物。用該方法獲得一條新的miRNA，連接、擴(kuò)增、克隆及其鑒定、測序和序列比較的時間至少需要2天以上。用該方法獲得一個物種樣品的大部分miRNA需要耗費(fèi)較長時間、人力和試劑。Northern雜交方法首先，在獲得miRNA的cDNA克隆或通過DNA合成方法獲得待檢測的miRNA(如經(jīng)過生物信息學(xué)手段己經(jīng)預(yù)測到)的cDNA序列，然后對該cDNA克隆進(jìn)行同位素或熒光標(biāo)記，通過提取樣品中的小RNA或總RNA，進(jìn)行電泳分離，獲得小RNA條帶，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(將RNA轉(zhuǎn)到雜交膜上)、用上述標(biāo)記探針雜交，根據(jù)有無雜交信號來確定樣品中該miRNA的存在和含量。由于miRNA較小(目前發(fā)現(xiàn)的miRNA均在22nt左右)，作為同位素標(biāo)記探針的雜交效率比較低，尤其是轉(zhuǎn)膜雜交條件下，檢測的靈敏度和特異性不容易保證。顯然該方法每次雜交只能檢測一條miRNA(或sNC-RNA)，用其檢測同一物種中所有可能存在的miRNA，需要制備相當(dāng)量的探針進(jìn)行相同參數(shù)的雜交試驗(yàn)。比如，需要檢測某一物種中可能存在的100個miRNA，就需要制備100條對應(yīng)的探針，進(jìn)行100次獨(dú)立的雜交試驗(yàn)。但是該方法一次雜交可以檢測數(shù)個樣品。該方法目前廣泛用于對少數(shù)樣品中已知miRNA的檢測。RT-PCR方法在miRNA序列已知的條件下，可以用ssRNA的RT-PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行檢測。但是，miRNA比較短小，不是非常適合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增效率和特異性難以保證。目前采用了在miRNA兩端加上已知接頭后再進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增或用實(shí)時熒光定量PCR(Real-TimePCR)來增加其靈敏度和進(jìn)行量化分析。但是，用以上方法同樣每次PCR反應(yīng)只能檢測一條miRNA(或sNC-RNA)，比如，需要檢測某一物種中可能存在的100個miRNA，則需要制備100對特異性引物，進(jìn)行100次獨(dú)立的PCR試驗(yàn)。用該方法獲得一條新的miRNA，逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增及其電泳檢測(RT-PCR)或數(shù)據(jù)分析(Real-TimePCR)的時間至少需要2天以上。芯片檢測是基于雜交方法建立起來的高通量檢測技術(shù)。原位合成芯片檢測的特點(diǎn)是1)對單個探針進(jìn)行定位定量合成；2)同一條探針在不同的芯片位點(diǎn)上分別合成，在同一雜交環(huán)境下同時雜交，保證了結(jié)果的重復(fù)性；3)探針原位合成和雜交的條件用計(jì)算機(jī)控制，因此，不同芯片的雜交結(jié)果能夠橫向比較，便于進(jìn)行量化分析與比較；4)同一張芯片可以用兩種熒光染料(如Cy3和Cy5)分別標(biāo)記不同的樣品，使得雜交結(jié)果可以平行比較；5)標(biāo)記樣品可以在條件實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對數(shù)千個探針進(jìn)行同時雜交，其雜交信號結(jié)果可以在條件實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行歸一化處理。因此，與現(xiàn)有核酸雜交檢測方法相比，原位合成芯片具有靈敏度高、高通量和簡便快捷的優(yōu)點(diǎn)。原位合成微流體芯片方法所制備的探針在純度、密度和均一性方面明顯優(yōu)于其它芯片方法，并已成功應(yīng)用于人類小RNA的定量研究。高通量、高靈敏度的基因芯片方法的開發(fā)，使之可能成為一種最理想的有效檢測miRNA表達(dá)的方法。2004年，Liu等首次用該方法在哺乳動物的不同腫瘤細(xì)胞中檢測到了245個miRNA，而且被Northern雜交，RT-PCR所證實(shí)。之后，基因芯片技術(shù)在miRNA的快速鑒定和表達(dá)研究中的應(yīng)用取得了快速發(fā)展。2005年，Bentwich等運(yùn)用miRNA芯片技術(shù)，檢測人類細(xì)胞內(nèi)的miRNA表達(dá)圖譜，克隆到了89條新miRNA。但是，以上研究僅限于對一個物種已經(jīng)報(bào)道的miRNA進(jìn)行高通量檢測，至今還沒有用現(xiàn)有物種已知的miRNA去檢測、發(fā)現(xiàn)其它物種的未知miRNA的報(bào)道。主要參考文獻(xiàn)1.段成國，王春晗，郭惠珊.microRNA對植物生長發(fā)育和病毒侵染的調(diào)控.科學(xué)通報(bào)，2006,(04):369-377.2.馬立人，蔣中華.生物芯片.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2001-2171.3ZhangBH,PanXP，WangQL，WIdentificationandcharacterizationofnewplantmicroRNAsusingESTanalysis.CellRes，2005，15:336-360.4.SunkarR,GirkeT,Zhu,JK.IdentificationandcharacterizationofendogenoussmallinterferingRNAsfromrice.NucleicAcidsRes,2005,33:4443-4454.5.LiuCQCalinGA，MeloonB,a/.Anoligonucleotidemicrochipforgenome-widemicroRNAprofilinginhumanandmousetissues.ProcNatlAcadSciUSA,2004,101(26):9740-9744.BentwichI,AvnielA，KarovY,Wa/.IdentificationofhundredsofconservedandnonconservedhumanmicroRNAs.NatGenet,2005,37(7):766-770,
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種原位合成微流體芯片，利用該芯片的高通量檢測方法，可用于生物信息學(xué)方法預(yù)測獲得的miRNA(和其它sNC-RNA)的驗(yàn)證，也可用于新的植物物種中miRNA(和其它sNC-RNA)的檢測、鑒定，還可用于不同處理?xiàng)l件下(如病毒侵染條件下)miRNA(和其它sNC-RNA)變化關(guān)系的測定。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種利用原位合成微流體芯片的檢測方法，包括以下步驟1)、利用現(xiàn)有模式植物上公開報(bào)道的非編碼小RNA的序列，優(yōu)選miRNA的序列信息，依據(jù)其正義鏈或其負(fù)義鏈序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸雜交探針，用于制作植物sNC-RNA或miRNA的檢測芯片；2)、用原位合成方法制備寡聚核苷酸芯片，并通過與DNA互補(bǔ)探針雜交以檢測其特異性和靈敏度；3)、從待檢測植物中提取小于50核苷酸堿基的小RNA，進(jìn)行末端標(biāo)記后與上述芯片中的探針雜交，獲得芯片雜交的結(jié)果，進(jìn)行定性和定量分析。作為本發(fā)明的利用原位合成微流體芯片的檢測方法的改進(jìn)步驟l)為收集源自高等植物的miRNA序列或者是根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測的序列；然后通過序列比對，去除冗余序列后獲得成熟非編碼小RNA序列；再根據(jù)上述非編碼小RNA序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)探針，探針包括成熟miRNA的互補(bǔ)序列及其相同的序列，探針大小為全長的或近全長的非編碼小RNA。作為本發(fā)明的利用原位合成微流體芯片的檢測方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟2)為先采用原位合成技術(shù)在微流體芯片上合成序列互補(bǔ)探針在原位合成微流體芯片上，依次合成化學(xué)修飾過的寡聚核苷酸探針序列和延伸臂片段，所述寡聚核苷酸探針序列為miRNA互補(bǔ)序列、單鏈cDNA;所述延伸臂片段使與其連接的寡聚核苷酸探針序列片段離片基有一定的距離，延伸臂為在miRNA探針基部的825個堿基的非特異性序列，是己知動物或人類基因組序列中與植物miRNA同源性低于25X的序列；然后再進(jìn)行芯片質(zhì)量檢測對合成好的芯片在芯片掃描儀上進(jìn)行熒光分析，以檢測芯片本身的熒光本底；用質(zhì)控cDNA或體外轉(zhuǎn)錄獲得的小RNA進(jìn)行末端標(biāo)記后與芯片進(jìn)行雜交，包括用已知樣品進(jìn)行標(biāo)記、雜交和檢測，以分析芯片特異性、靈敏度和重復(fù)性。作為本發(fā)明的利用原位合成微流體芯片的檢測方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟3)為選用以下兩種方法中的任意一種方法A、用常規(guī)方法或試劑盒從待檢測植物中提取小于50nt的RNA，用末端標(biāo)記試劑進(jìn)行末端標(biāo)記后與上述芯片探針進(jìn)行雜交，用掃描儀(如GenePix4000B,MolecularDevice)掃描芯片，獲得雜交圖譜；方法B、用芯片分析軟件獲取每個探針的熒光信號強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)誤，信號值經(jīng)過背景噪音減除后，通過調(diào)整該掃描通道下的平均信號值到同一水平對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理；對以上獲得的數(shù)據(jù)可以進(jìn)行橫向或縱向的比較分析，相同合成條件下獲得的芯片，其雜交數(shù)據(jù)也可以進(jìn)行對比分析，確定檢測結(jié)果。為了獲得本發(fā)明的利用原位合成微流體芯片的檢測方法，發(fā)明人根據(jù)其它植物上報(bào)道的miRNA序列設(shè)計(jì)探針，并用原位合成方法制備微流體基因芯片，以實(shí)現(xiàn)在一張芯片上檢測數(shù)百種(甚至上千種)植物miRNA(和其它sNC-RNA)。本發(fā)明的技術(shù)路線如圖l所示，具體表述如下1)、收集其它模式植物上公開報(bào)道的非編碼小RNA(smallnon-codingRNA,sNC-RNA)，尤其是miRNA的序列信息。源自高等植物的miRNA序列主要來自以下網(wǎng)站http:〃microma.sanger.ac.uk/sequences。截至2006年，已有擬南芥、大豆、苜蓿、水稻、毛果楊、高梁、甘蔗和玉米等8種植物報(bào)道了miRNA。2)、通過序列比對，除去那些冗余序列亦即對于在不同物種上出現(xiàn)的序列完全相同的miRNA(或其它sNC-RNA)只保留一條序列。常見的植物miRNA探針序列見表1所示。3)、根據(jù)以上成熟的miRNA(或其它sNC-RNA)的序列，設(shè)計(jì)互補(bǔ)探針；探針包括成熟miRNA的互補(bǔ)序列及其相同的序列，探針大小為全長的或近全長的miRNA(或其它sNC-RNA)。4)、在原位合成微流體芯片上，依次合成延伸臂(812nt)和化學(xué)修飾過的寡聚核苷酸探針序列即miRNA互補(bǔ)序列，均為單鏈cDNA。延伸臂為重復(fù)的連續(xù)的T或連續(xù)的A，或?yàn)橹参锝M織中未見出現(xiàn)的其它序列；寡聚核苷酸探針的化學(xué)修飾是為了保護(hù)探針不被核酸酶識別和降解，如將采用所有甲基化的A。5)、芯片質(zhì)量檢測對合成好的芯片在芯片掃描儀上進(jìn)行熒光分析，以檢測芯片本身的熒光本底;用質(zhì)控cDNA或體外轉(zhuǎn)錄獲得的小RNA進(jìn)行末端標(biāo)記后與芯片進(jìn)行雜交，包括用已知樣品進(jìn)行標(biāo)記、雜交和檢測，以分析芯片特異性、靈敏度和重復(fù)性。6)、應(yīng)用方法A、用常規(guī)方法(或試劑盒)從待檢測植物中提取小于50nt的RNA，用末端標(biāo)記試劑(如TaKaRa—大連寶生物公司5'末端標(biāo)記試劑盒)進(jìn)行末端標(biāo)記后與上述芯片探針進(jìn)行雜交，用掃描儀(如GenePix4000B,MolecularDevice)掃描芯片，獲得雜交圖譜。B、用芯片分析軟件(如Array-Pro分析軟件美國MediaCybernetics公司)，獲取每個探針的熒光(Cy3或Cy5)信號強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)誤。信號值經(jīng)過背景噪音減除后，通過調(diào)整該掃描通道下的平均信號值到同一水平對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。對以上獲得的數(shù)據(jù)可以進(jìn)行橫向或縱向的比較分析，相同合成條件下獲得的芯片，其雜交數(shù)據(jù)也可以進(jìn)行對比分析，確定檢測結(jié)果。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>ath-miR170GATATTGACACGGCTCAATCAath-miR171aGATATTGGCGCGGCTCAATCAath-miR171bCGTGATATTGGCACGGCTCAAath-miR172aATGCAGCATCATCAAGATTCTath-miR172b*GTGAATCTTAATGGTGCTGCath-miR172cCTGCAGCATCATCAAGATTCTath-miR172eATGCAGCATCATCAAGATTCCath-miR173GTGATTTCTCTCTGCAAGCGAAath-miR319aGGGAGCTCCCTTCAGTCCAAath-miR319cAGGAGCTCCCTTCAGTCCAAath-miR390aGGCGCTATCCCTCCTGAGCTTath-miR391TGGCGCTATCTCTCCTGCGAAath-miR393aGATCAATGCGATCCCTTTGGAath-miR394aGGAGGTGGACAGAATGCCAAath-miR395aGAGTTCCCCCAAACACTTCAGath-miR395bGAGTCCCCCCAAACACTTCAGath-miR396aCAGTTCAAGAAAGCTGTGGAAath-miR396bAAGTTCAAGAAAGCTGTGGAAath-miR397aCATCAACGCTGCACTCAATGAath-miR397bCATCAACGATGCACTCAATGAath-miR398aAAGGGGTGACCTGAGAACACAath-miR398bCAGGGGTGACCTGAGAACACAath-miR399aCAGGGCAAATCTCCTTTGGCAath-miR399bCAGGGCAACTCTCCTTTGGCAath-miR399dCGGGGCAAATCTCCTTTGGCAath-miR399eCGAGGCAAATCTCCTTTGGCAath-miR399fCCGGGCAAATCTCCTTTGGCAath-miR400GTGACTTATAATACTCTCATAath-miR401TGTCGGTCGACACCAGTTTCGath隱miR402CAGAGGTTTAATAGGCCTCGAAath-miR403CGAGTTTGTGCGTGAATCTAAathmiR404GCTGCCGCAACCGCCAGCGTTAATath-miR405aAGTTATGGGTTAGACCCAACTCATath-miRCTGGATTACAATAGCATTCTAath-miR407ACCAAAAGTATATGATTTAAAath-miR408GCCAGGGAAGAGGCAGTGCATath-miR413GTGCAGAACAAGAGAAACTATath-miR414TGACGATGATGATGAAGATGAath-miR415ATGTTCTGTTTCTGCTCTGTTath-miR416TGAACAGTGTACGTACGAACCath-miR417TCGAACAAATTCACTACCTTCath-miR418GGTCAGTTCATCATCACATTAath-miR419CAACATCCTCAGCATTCATAAath-miR420TGCATTTCCGTGATTAGTTTAath-miR426CGTAAGGACAAATTTCCAAAAath-miR447aCAACAAAACATCTCGTCCCCAAath-miR447cCAACAAAAGATGTCGTCCCCAAath-miR771GAGGGCTACCACAGAGGCTCAath-miR772GTATGGGCGGAGTAGGAAAAAath-miR773GAGACAAAAGCTGGAAGCAAAath-miR774GATGGCCATATGGGTAACCAAath-miR775TTGGCACTGCTAGACATCGAAath-miR776AACATCAATAGAAGACTTAGAath陽miR777AGCAACGAAACTCAATGCGTAath-miR778CGGTGTACATAAACCAAGCCAath-miR779ATGAGCAGCAACATAGCAGAAath-miR780TGCCAGATATTCACGAAGAAAath-miR781TAAGTATCCAGAAAACTCTAAath-miR782AAGAACATCCAAGGTGTTTGTath-miR783GAACATGAACGAGCAAAGCTTgma-miR156bTGTGCTCTCTCTCTTCTGTCAgma-miR319cAGGAGCTCCTTTCAGTCCAAmtr陽miR171GATATTGGCACGACTCAATCAmtr-miR395aGAGTTCCCCCAAACACTTCATmtr-miR395bGAGTTCCCCCAAATACTTCATmtr-miR395gGAGTTCCCCCAAACACTTCAAmtr-miR395hAAGTTCCCCCAAACACTTCATmtr-miR395pGAGTTCCCCCAAACGCTTCAAmtr-miR399aCTGGGCAAATCTCCTTTGGCAmtr-miR399bCAGGGCAGCTCTCCTTTGGCAmtr-miR399dTAGGGCAGCTCTCCTTTGGCAosa-miR1561TATGCTCACTCTCTTCTGTCGosa-miR159aCAGAGCTCCCTTCAATCCAAAosa-miR159cTGGAGCTCCCTTCAATCCAATosa-miR159dCGGAGCTCCCTTCAATCCAATosa-miR159eAGGAGCTCCCTTCAATCCAATosa-miR159fTAGAGCTCCCTTCAATCCAAGosa-miR160eCGGCATACAGGGAGCCAGGCAosa-miR160fTGGCATTCAGGGAGCCAGGCAosa-miR162bCTGGATGCAGAGGCTTATCGAosa-miR164cTGCACGTACCCTGCTTCTCCAosa-miR164dAGCACGTGCCCTGCTTCTCCAosa-miR164eCTCACGTGCCCTGCTTCTCCAosa-miR166eGGGGAATGAAGCCTGGTTCGAosa-miR166gGAGGAATGAAGCCTGGTCCGAosa-miR166iGAGGAATGAAGCCTGATCCGAosa-miR166kAGGGATTGAAGCCTGGTCCGAosa-miR166mAGGGAATGAAGCCTGGTCCGAosa-miR167dCAGATCATGCTGGCAGCTTCAosa-miR168aGTCCCGATCTGCACCAAGCGAosa-miR168bTTCCCGAGCTGCACCAAGCCTosa-miR169dCCGGCAATTCATCCTTGGCTAosa-miR169eCCGGCAAGTCATCCTTGGCTAosa-miR169fTAGGCAAGTCATCCTTGGCTA<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注表l中ath:擬南芥；gma:大豆；mtr:苜蓿；OSa:水稻；ptC:毛果楊；sbi:高粱；S0f:甘蔗；zma:玉米。對于根據(jù)生物信息學(xué)方法預(yù)測得到的miRNA(或其它sNC-RNA)檢測芯片構(gòu)建，完全參照以上步驟。但是，不需要收集已知序列，而直接利用預(yù)測得到的miRNA(或其它sNC-RNA)序列及其互補(bǔ)序列作為探針。本發(fā)明在原位合成微流體芯片上合成11~23個堿基，優(yōu)選9~21個堿基的單鏈cDNA作為雜交探針，以上探針序列分別與成熟的植物miRNA(或其它sNC-RNA)完全互補(bǔ)。本發(fā)明的特點(diǎn)在于不需要進(jìn)行ncRNA的基因克隆而檢測和鑒定這些miRNA和其它非編碼小RNA;同時，本項(xiàng)目利用芯片雜交的高通量特征，可以同時檢測一個樣品中的數(shù)千個miRNA;同一張芯片可以用Cy3和Cy5分別標(biāo)記兩個樣品，進(jìn)行平行檢測，因此可以比較樣品之間的量化變化，或根據(jù)雜交信號強(qiáng)弱對不同處理樣品的miRNA表達(dá)進(jìn)行量化比較。本發(fā)明所檢出的miRNA是物種間保守的和序列已知的，序列未知的miRNA不能用本方法檢測。本發(fā)明的方法是原位合成微流體芯片在檢測植物miRNA方面的應(yīng)用，是收集現(xiàn)有植物物種已知的miRNA合成檢測芯片，用于檢測其它植物物種未報(bào)道的miRNA(和其它sNC-RNA)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為與現(xiàn)有核酸雜交、RT-PCR檢測方法檢測待檢測的植物miRNA相比，原位合成芯片檢測方法具有靈敏度高、高通量和簡便快捷的優(yōu)點(diǎn)。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是植物sNC-RNA檢測芯片制備的技術(shù)路線示意圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、植物sNC-RNA的制備及其對番茄miRNA的檢測通過公共數(shù)據(jù)庫SangermiRbase(2005Version6.0)獲得了7個物種(擬南芥、水稻、大豆、苜蓿、甘蔗、高粱和玉米)的513條miRNA中的165條非冗余序列信息和511條miRNA+中的365條非冗余miRNA傘序列信息；5SRibosomeRNADatabase和NCBI數(shù)據(jù)庫4個物種(擬南芥、水稻、玉米和番莉)的7條序列信息；tRNADatabaseinterface數(shù)據(jù)庫5個物種(擬南芥、水稻、玉米、大豆和番茄)的113條序列信息；Non-codingRNAdatabase數(shù)據(jù)庫5個物種(擬南芥、水稻、玉米、大豆和番茄)的349條序列信息。針對較短序列的miRNA和miRNA*(21~29nt)，探針設(shè)計(jì)為其原始序列的互補(bǔ)鏈，較長序列5SrRNA、tRNA、ncRNA(42~303nt)，用探針設(shè)計(jì)軟件Arraydesigner2(PREMIERBiosoft)設(shè)計(jì)了長度均為25nt，GC含量4060。/。，自身無二級結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，每條序列篩選27條作為備用探針。寡核苷酸探針委托美國Atactic公司采用^ParafloTM技術(shù)在31x128矩陣的微流體芯片上原位合成(530條miRNA、miRNA+和65條番茄小分子RNA探針具有3個重復(fù)區(qū)，908條其它7個物種的小分子RNA探針具有2個重復(fù)區(qū))。利用植物小分子RNA芯片分析了不同物種、不同類型的小分子RNA在健康番茄和CMV侵染組織樣品中的表達(dá)。雜交結(jié)果顯示(1)設(shè)計(jì)的番茄探針中，5SrRNA、tRNA和ncRNA的序列檢出率均為100%;(2)在設(shè)計(jì)的其它物種的探針中，5SrRNA序列檢出率為100%，tRNA序列檢出率為70.00%，其它sNC-RNA序列檢出率為11.11%。實(shí)施例2、番茄miRNA檢測芯片及番莉miRNA對黃瓜花葉病毒(CMV)侵染的反應(yīng)利用番茄miRNA芯片檢測番茄miRNA及其互補(bǔ)序列(miRNA*)的表達(dá)對植物病毒侵染的反應(yīng)通過公共數(shù)據(jù)庫SangermiRbase(2005Version6.0)獲得了7個物種(擬南芥、水稻、大豆、苜蓿、甘蔗、高粱和玉米)的513條miRNA中的165條非冗余序列信息和511條miRNA*(miRNA的互補(bǔ)序列)中的365條非冗余0^咖八*序列信息。在微流體芯片上設(shè)置6個重復(fù)區(qū)，分別研究番茄受CMV侵染和不侵染對照的miRNA響應(yīng)。T-test檢驗(yàn)方法分析CMV侵染和健康番茄組織小RNA樣品中的基因差異表達(dá)(芯片PO.01)顯示-51條番茄miRNA序列存在顯著性差異表達(dá)，其中上調(diào)序列32，下調(diào)序列19。此外，一些miRNA申在CMV侵染的番茄樣品中出現(xiàn)了異常積累。此外，我們發(fā)現(xiàn)miR159/319家族(ath-miR159b、ath-miR159c、ath-miR319c、osa-miR159a、osa-miR159c、osa-miR159d、osa-miR159e和osa-miR159f)，miR160家族(ath-miR160a)，miR390家族(ath-miR390a)的部分miRNA成員沒有發(fā)生差異表達(dá)。實(shí)施例3、用原位合成微流體芯片鑒定甘蔗microRNA:將Sanger數(shù)據(jù)庫中收錄、報(bào)道的擬南芥、大豆、苜蓿、水稻、毛果楊、高粱、甘蔗和玉米等8種高等植物中的731條前體miRNA序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)它們對應(yīng)231條成熟miRNA。因此，本研究設(shè)計(jì)231條特異性探針，并采用原位合成技術(shù)制作植物miRNA微流體芯片。利用該芯片首次對甘蔗幼苗中表達(dá)的成熟miRNA和miRNA互補(bǔ)序列(miRNA*)進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)前人根據(jù)EST序列推測到可能存在于甘蔗中的16條前體miRNA中的15條分別對應(yīng)于本研究的9條探針而被檢測到。另外102條在其它植物上報(bào)道的成熟miRNA在甘蔗中被首次發(fā)現(xiàn)。以上111條探針對應(yīng)的成熟miRNA分布在30個保守miRNA家族中。本研究驗(yàn)證了有關(guān)甘蔗miRNA的存在，其結(jié)果說明miRNA在高等植物具有高度保守性和普遍分布。實(shí)施例4、用植物miRNA芯片測定番茄miRNA對不同致病性表型的響應(yīng)的結(jié)果基于miRNA物種間高保守特性，我們采用原位合成技術(shù)，構(gòu)建了植物miRNA檢測芯片。參照SangermiRbase9.0數(shù)據(jù)庫(2006)，芯片包含8個物種的294條miRNA和633條miRNA^^序列相應(yīng)的探針。為了證明芯片雜交的可靠性，對芯片檢測結(jié)果的特異性和芯片上重復(fù)矩陣的檢測重復(fù)性進(jìn)行了分析。錯配探針均無雜交信號，說明芯片具有較強(qiáng)的檢測特異性。同時，從重復(fù)區(qū)域隨機(jī)選取部分探針對應(yīng)點(diǎn)，比較其檢測信號強(qiáng)度差異，結(jié)果CV值介于P/『5。/。，說明芯片檢測重復(fù)性極佳。番茄miRNA對不同致病性表型的響應(yīng)的結(jié)果顯示利用本研究構(gòu)建的第二代miRNA芯片，檢測不同的CMV株系及其攜帶不同衛(wèi)星RNA侵染35d番茄miRNA的響應(yīng)情況，顯示存在顯著性的差異表達(dá)，且多數(shù)miRNA與致病性表型存在密切聯(lián)系。芯片檢測出的82條miRNA中有30條miRNA表達(dá)差異顯著(經(jīng)CyclicLOWESS方法規(guī)一化，f檢驗(yàn)P<0.01,且倍性檢驗(yàn)>2)，占36.6%，分屬于12個miRNA家族。其中，miR167、miR168和miR396家族在擬南芥中的研究結(jié)果己經(jīng)證實(shí)與植物抗病性、葉柄形成及與逆境脅迫有關(guān)。對芯片檢測結(jié)果進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)miR398、miR390、miR403和miR168家族中部分成熟miRNA隨著致病性表型的加重表達(dá)量逐漸增大，miR319、miR396和miR156家族中部分成熟miRNA隨著致病性表型的加重表達(dá)量逐漸減少。以上結(jié)果說明不同致病性的CMV侵染番茄，引起寄主miRNA表達(dá)量的變化具有明顯差異，通過后者參與致病性表型發(fā)生。實(shí)施例5、用原位合成微流體芯片鑒定半夏microRNA:三葉半夏(i^e//z'flemafe(Thunb.)Breit)為天南星科(」racefle)半夏屬多年生草本植物，是我國一種名貴的中藥材，但是迄今為止還沒有該藥用植物序列和基因組學(xué)的系統(tǒng)研究，也極少有關(guān)于其序列和編碼小RNA的報(bào)道。我們以Sanger數(shù)據(jù)庫中收錄的擬南芥等8種高等植物中的231條成熟miRNA作為探針，用原位合成技術(shù)制作植物miRNA微流體芯片。利用該芯片對三葉半夏不同種群和不同發(fā)育階段成熟miRNA的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)123條在其它植物上報(bào)道的成熟miRNA在三葉半夏均有存在發(fā)現(xiàn)。它們分布在31個保守miRNA家族中。柳葉型、桃葉型和心葉型三種葉型的三葉半夏miRNA種群數(shù)量基本一致。但是，23條miRNA(如miRNA169)在半夏的生長發(fā)育過程中變化較大，它們與半夏珠芽形成、塊莖膨大和倒苗現(xiàn)象關(guān)系密切，如miRNA172b在半夏塊莖形成過程中快速積累。對照例1:人工合成miR166a、miR159a、miR165a*(該miRNA的互補(bǔ)序列，下同)、miR162a*和miR172a的DNA雜交探針，委托上海生工合成并進(jìn)行同位素末端標(biāo)記。通過提取〈50nt的RNA，進(jìn)行Northern雜交。采用包括以上探針的植物miRNA檢測芯片進(jìn)行對比試驗(yàn)。結(jié)果顯示Northern雜交方法3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中均獲得了miR166a、miR159a、miR165a"口miR162a+的雜交信號，但是，只有1次獲得了miR172a的雜交信號。植物miRNA檢測芯片的3次雜交的9個重復(fù)中均檢測到miR166a、miR159a、miR165a*、miR162a+和miR172a的雜交信號，其中miR172a的雜交信號均低于miR166a，約為其1/4。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1、一種利用原位合成微流體芯片的檢測方法，其特征是包括以下步驟1)、利用現(xiàn)有模式植物上公開報(bào)道的非編碼小RNA的序列，優(yōu)選miRNA的序列信息，依據(jù)其正義鏈或其負(fù)義鏈序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸雜交探針，用于制作植物sNC-RNA或miRNA的檢測芯片；2)、用原位合成方法制備寡聚核苷酸芯片，并通過與DNA互補(bǔ)探針雜交以檢測其特異性和靈敏度；3)、從待檢測植物中提取小于50核苷酸堿基的小RNA，進(jìn)行末端標(biāo)記后與上述芯片中的探針雜交，獲得芯片雜交的結(jié)果，進(jìn)行定性和定量分析。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用原位合成微流體芯片的檢測方法，其特征是，所述步驟l)為收集源自高等植物的miRNA序列或者是根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測的序列；然后通過序列比對，去除冗余序列后獲得成熟非編碼小RNA序列；再根據(jù)上述非編碼小RNA序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)探針，探針包括成熟miRNA的互補(bǔ)序列及其相同的序列，探針大小為全長的或近全長的非編碼小RNA。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用原位合成微流體芯片的檢測方法，其特征是，所述步驟2)為先采用原位合成技術(shù)在微流體芯片上合成序列互補(bǔ)探針在原位合成微流體芯片上，依次合成化學(xué)修飾過的寡聚核苷酸探針序列和延伸臂片段，所述寡聚核苷酸探針序列為miRNA互補(bǔ)序列、單鏈cDNA;所述延伸臂片段使與其連接的寡聚核苷酸探針序列片段離片基有一定的距離，延伸臂為在miRNA探針基部的825個堿基的非特異性序列，是已知動物或人類基因組序列中與植物miRNA同源性低于25X的序列；然后再進(jìn)行芯片質(zhì)量檢測對合成好的芯片在芯片掃描儀上進(jìn)行熒光分析，以檢測芯片本身的熒光本底；用質(zhì)控cDNA或體外轉(zhuǎn)錄獲得的小RNA進(jìn)行末端標(biāo)記后與芯片進(jìn)行雜交，包括用已知樣品進(jìn)行標(biāo)記、雜交和檢測，以分析芯片特異性、靈敏度和重復(fù)性。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用原位合成微流體芯片的檢測方法，其特征是，所述步驟3)為選用以下兩種方法中的任意一種方法A、用常規(guī)方法或試劑盒從待檢測植物中提取小于50nt的RNA，用末端標(biāo)記試劑進(jìn)行末端標(biāo)記后與上述芯片探針進(jìn)行雜交，用掃描儀(如GenePix4000B,MolecularDevice)掃描芯片，獲得雜交圖譜；方法B、用芯片分析軟件獲取每個探針的熒光信號強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)誤，信號值經(jīng)過背景噪音減除后，通過調(diào)整該掃描通道下的平均信號值到同一水平對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理；對以上獲得的數(shù)據(jù)可以進(jìn)行橫向或縱向的比較分析，相同合成條件下獲得的芯片，其雜交數(shù)據(jù)也可以進(jìn)行對比分析，確定檢測結(jié)果。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用原位合成微流體芯片的檢測方法，包括以下步驟1)利用現(xiàn)有模式植物上公開報(bào)道的非編碼小RNA的序列，優(yōu)選miRNA的序列信息，依據(jù)其正義鏈或其負(fù)義鏈序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸雜交探針；2)用原位合成方法制備寡聚核苷酸芯片；3)從待檢測植物中提取小于50核苷酸堿基的小RNA，進(jìn)行末端標(biāo)記后與上述芯片中的探針雜交，獲得芯片雜交的結(jié)果，進(jìn)行定性和定量分析。本發(fā)明的檢測方法，可用于生物信息學(xué)方法預(yù)測獲得的miRNA(和其它sNC-RNA)的驗(yàn)證，也可用于新的植物物種中miRNA(和其它sNC-RNA)的檢測、鑒定，還可用于不同處理?xiàng)l件下(如病毒侵染條件下)miRNA(和其它sNC-RNA)變化關(guān)系的測定。文檔編號C12Q1/68GK101285100SQ20081006012公開日2008年10月15日申請日期2008年3月11日優(yōu)先權(quán)日2008年3月11日發(fā)明者尹雪鴻,朗秋蕾,杜志游,楊文征,竺錫武,陳集雙,高曉蓮申請人:浙江理工大學(xué)