專利名稱：：一種能表達小分子干擾rna的dna質(zhì)粒及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，具體涉及一種能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：RNA干擾(RNAinterference,RNAi)現(xiàn)象是在1998年被Fire等人發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲(G^m^toZ^'toe/egflra)中，后來發(fā)現(xiàn)在植物、真菌、果蠅及哺乳動物細胞內(nèi)均存在這種現(xiàn)象；RNAi自發(fā)現(xiàn)之日起便成為了研究熱點，2001年被成功用于哺乳動物細胞。RNAi是生命最古老的基因免疫監(jiān)視機制，依靠RNAi可以實現(xiàn)維持生命健康、抵御病毒侵入、抗腫瘤發(fā)生以及維持遺傳穩(wěn)定等生命機體的基本活動，因此，對RNAi的研究及應(yīng)用受到了越來越多的科學(xué)家的青睞。RNAi技術(shù)是利用21nt或29nt的小分子干擾RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)對基因進行封閉，達到干擾或封閉目的基因的作用，同時使生物體出現(xiàn)相應(yīng)的表型缺失現(xiàn)象。由于siRNA作用的高效性及特異性，目前已經(jīng)成為功能基因組研究的主要工具。己有的實驗證實人工化學(xué)合成的siRNA能在體內(nèi)產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象，但它不能長期介導(dǎo)RNAi作用，用于基因治療時，體內(nèi)應(yīng)用siRNA易被核糖核酸酶(RNase)降解，且合成siRNA的量難以滿足動物或人體試驗的大量需求，因此這在一定程度上限制了其適用范圍；另外，RNAi還存在衰減現(xiàn)象，在較高級的哺乳動物或人類細胞中，細胞內(nèi)的RNAi現(xiàn)象在數(shù)天之后逐漸消失。這些問題的存在，限制了RNAi的眾多功能的發(fā)揮。目前制備siRNA的方法除了直接化學(xué)合成外，還有利用體外轉(zhuǎn)錄、Dicer(核酸水解酶)酶切雙鏈RNA獲得，以及制備siRNA表達框利用質(zhì)?；虿《颈磉_載體在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成siRNA;如中國專利號為ZL200510024242.5，名稱為"低氧誘導(dǎo)因子小干擾RNA質(zhì)粒"的發(fā)明專利，就公開了針對HIF-la設(shè)計的抑制性siRNA插入到PSilenceU6-1.0載體中構(gòu)建而成，而抑制性siRNA具有其SRQIDNO:1或SRQIDNO:2所表示的基因結(jié)構(gòu)；該發(fā)明的骨架載體為PSilenceU6-1.0，該發(fā)明的siRNA質(zhì)粒具有在細胞內(nèi)能穩(wěn)定高效地表達，使轉(zhuǎn)染效率較高，抑制效果顯著的優(yōu)點。因此利用RNAi的表達載體siRNA質(zhì)粒或為DNA質(zhì)粒，在細胞內(nèi)介導(dǎo)RNAi具有表達穩(wěn)定、持續(xù)時間長和抑制效果明顯等特征。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能穩(wěn)定高效表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒，是用全新廣譜的構(gòu)建載體為骨架所構(gòu)建的表達載體系統(tǒng)，該DNA質(zhì)粒在細胞內(nèi)介導(dǎo)RNAi具有表達穩(wěn)定、持續(xù)時間長和抑制效果明顯等特征。同時本發(fā)明還提供了該DNA質(zhì)粒的構(gòu)建方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒，以載體pBlueScript(BS)/U6為骨架，在所述載體BS/U6的j戸I和￡coRI的酶切位點上，插入同源酶切位點的長度為21nt的DNA耙序列構(gòu)建而成。所述載體BS/U6為在BS的《;wI和I的酶切位點上，插入同源酶切位點的U6啟動子構(gòu)建而成。所述DNA靶序列為報告基因(即綠色熒光蛋白基因g^)的編碼區(qū)的第101121位片段；g步的編號為Genebankno.U19281。所述DNA靶序列為腫瘤細胞內(nèi)源基因周期蛋白依賴性激酶2基因(cc^-2)的編碼區(qū)的第6686位片段；c汲-2的編號為Genebankno.NM001798。所述DNA靶序列為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1基因(^7附/-/)的編碼區(qū)的第85105位片段；d"W-7的編號為Genebankno.NM001379。一種能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括下述步驟1)以pmU6質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增反應(yīng)獲得在左側(cè)含有i^"I酶切位點和在右側(cè)含有I酶切位點的U6啟動子序列；2)將上述U6啟動子序列插入到同樣含有夂/7"I和I的酶切位點的BS上，然后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞E.co//TG1中，經(jīng)過篩選、擴增和抽提獲得載體BS/U6;3)應(yīng)用siRNAtargetfinder軟件分析篩選出含有I和￡coRI的酶切位點的長度為21nt的DNA靶序列，體外人工合成該DNA耙序列；4)將上述DNA靶序列插入到所述載體BS/U6的^7al和五coRl的酶切位點上，利用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提得到能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒。上述BS、pmU6和質(zhì)粒抽提試劑盒都可以市售得到。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于以載體BS/U6為骨架，在載體BS/U6的^wI和五coRI的酶切位點上，插入同源酶切位點的長度為21nt的DNA靶序列構(gòu)建獲得能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒；使DNA質(zhì)粒在細胞內(nèi)或體內(nèi)能穩(wěn)定、高效地表達siRNA，從而達到較高的傳染率和RNAi作用，能充分抑制靶蛋白，最高抑制率可以達到75%，而且本發(fā)明是以全新廣譜的構(gòu)建載體為骨架所構(gòu)建的表達載體系統(tǒng)，在該構(gòu)建載體BS/U6上可以構(gòu)建各種目的基因的表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒；且本發(fā)明的DNA質(zhì)粒在細胞內(nèi)介導(dǎo)RNAi具有表達穩(wěn)定、持續(xù)時間長和抑制效果明顯等優(yōu)點。圖l、為載體BS/U6結(jié)構(gòu)示意圖；其中U6表示啟動子，/Qe"I、v4戸I、五coRl分別表示酶切位點，LacZ表示P半乳糖苷酶基因啟動子，florigin和Co正lorigin分別表示質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)序列，Ampicillin表示氨芐西林抗生素篩選標記；圖2、為DNA質(zhì)粒的模型示意圖；其中U6promoter表示U6啟動子，21ntcodingseq表示21個核苷酸的DNA靶序列，6ntspace表示6個核苷酸的間隔序列，TTTTT表示轉(zhuǎn)錄終止識別信號；圖3、為BS/U6質(zhì)粒的瓊脂糖電泳圖；箭頭所指即為超螺旋質(zhì)粒DNA的位置。具體實施方式以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。實施例1一種能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒，以載體BS/U6為骨架，在載體BS/U6的I和￡coRI的酶切位點上，插入同源酶切位點的長度為21nt的她基因的編碼區(qū)的第101121位片段的DNA靶序列構(gòu)建而成，得到BS/U6/g^質(zhì)粒，該質(zhì)粒能在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄為siRNA，從而起到RNAi的作用。實施例2一種能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒，與實施例1基本相同，所不同的只是插入的DNA耙序列為a/左-2基因的編碼區(qū)的第6686位片段，得到BS/U6/cJ^-2質(zhì)粒。實施例3一種能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒，與實施例1基本相同，所不同的只是插入的DNA耙序列為c/mn"7基因的編碼區(qū)的第85105位片段，得到BS/U6/c/"m^質(zhì)粒。根據(jù)各種目的要求，本發(fā)明的DNA質(zhì)粒中DNA靶序列也可以為其他21nt的DNA片段，在此不一一列舉，只是它們的骨架載體都為BS/U6。實施例4一種能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括下述步驟1)以pmU6質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增反應(yīng)獲得在左側(cè)含有^MI的酶切位點和在右側(cè)含有j/7flI的酶切位點的U6啟動子序列，即形成含有U6啟動子的《;wI-U6-J;7flI的基因片段；2)將上述U6啟動子序列插入到同樣含有《p"I和I的酶切位點的BS上，然后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞五.co/z'TGl中，經(jīng)過氨芐西林抗生素篩選、在Eco/z'TGl中大量擴增，用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提獲得載體BS/U6，得到的載體BS/U6的示意結(jié)構(gòu)如圖1所示，瓊脂糖凝膠電泳的BS/U6產(chǎn)物如圖3所示；3)應(yīng)用siKNAtargetfmder軟件分析篩選出含有^戸I和￡coRI的酶切位點的長度為21nt的DNA靶序列她基因的編碼區(qū)的第101121位片段，用BLAST序列分析獲得的她片段與其它基因無同源性，體外人工合成g步片段(101121);4)將上述妳片段插入到載體BS/U6的々。I和￡coRI酶切位點上，利用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提得到如圖2模型所示的能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒:BS/U6/她。用同樣的方法可以構(gòu)建BSAJ6/c汰-2和BS/U6/d"加-7等質(zhì)粒。上述實施例中所用的BS和pmU6購于Invitrogen公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購于TaKaRa公司；￡.co/ZTG1感受態(tài)細胞為實驗室制備。在上述實施例的具體步驟中所用到的各種分子生物學(xué)方法如質(zhì)粒的提取、瓊脂糖凝膠電泳、分離回收DNA片段、感受態(tài)細胞制備、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞等均按《分子克隆實驗指南》中的方法進行操作，具體操作細節(jié)在此不作詳述。實施例5細胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗室分別培養(yǎng)人宮頸癌細胞(Hela)、人胚腎細胞(HEK293)、人結(jié)腸癌細胞(HT29)、人肺腺癌細胞(SPCA1)，用購于Invitrogen公司的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine)將本發(fā)明的BS/U6/她、BS/U6/c說-2禾nBS/U6/質(zhì)粒各自分別轉(zhuǎn)染到Hela、HEK293、H1299、SPCA1細胞中，在6孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)48小時，操作按照產(chǎn)品說明書操作規(guī)程完成。實施例6表達siRNA對靶蛋白抑制作用分析收集實施例5中的各培養(yǎng)細胞，用倒置熒光顯微鏡分別觀察各自的綠色熒光蛋白(她、c說-2、c"wW)的表達情況，數(shù)字攝像后經(jīng)過流式細胞儀(FACScalibur，BD公司)分別檢測g步、a^:-2、^m^在不同的培養(yǎng)細胞表達情況并計算對靶基因的抑制效率，得到附表l的結(jié)果。從表中可以看出本發(fā)明的各種DNA質(zhì)粒都能在各特征細胞內(nèi)穩(wěn)定高效表達出各自siRNA，如轉(zhuǎn)染48小時后對妳的抑制率為75%，而內(nèi)源靶蛋白a^-2和^w/j的最高抑制率分別61%和58%;也可以看出不同的小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒對不同的細胞的RNAi的作用不同，因此可以進一步篩選出針對性的DNA質(zhì)粒用于診斷、預(yù)防和治療人類的各種病變，為基因治療打下了基礎(chǔ)。表1:不同RNA干擾質(zhì)粒對在不同細胞株相應(yīng)靶蛋白的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1、一種能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒，其特征在于以載體pBlueScript/U6為骨架，在所述載體pBlueScript/U6的ApaI和EcoRI的酶切位點上，插入同源酶切位點的長度為21nt的DNA靶序列構(gòu)建而成。2、如權(quán)利要求1所述的一種能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒，其特征在于所述載體pBlueScript/U6為在pBlueScript的尺/7/71和j/aI的酶切位點上，插入同源酶切位點的U6啟動子構(gòu)建而成。3、如權(quán)利要求1所述的一種能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒，其特征在于所述DNA靶序列為報告基因的編碼區(qū)的第101121位片段。4、如權(quán)利要求1所述的一種能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒，其特征在于所述DNA靶序列為腫瘤細胞內(nèi)源基因周期蛋白依賴性激酶2基因的編碼區(qū)的第6686位片段。5、如權(quán)利要求1所述的一種能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒，其特征在于所述DNA靶序列為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1基因的編碼區(qū)的第85105位片段。6、一種權(quán)利要求1所述的能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于包括下述步驟1)以pmU6質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增反應(yīng)獲得在左側(cè)含有/QwI酶切位點和在右側(cè)含有^wI酶切位點的U6啟動子序列；2)將上述U6啟動子序列插入到同樣含有/QwI和J/flI的酶切位點的pBlueScript上，然后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞￡.co//TG1中，經(jīng)過篩選、擴增和抽提獲得載體pBlueScript/U6;3)應(yīng)用siRNAtargetfinder軟件分析篩選出含有々aI和￡coRI的酶切位點的長度為21nt的DNA靶序列，體外人工合成該DNA靶序列；4)將上述DNA靶序列插入到所述載體pBlueScript/U6的jpflI和￡coRI的酶切位點上，利用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提得到能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒。全文摘要本發(fā)明公開了一種能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，以載體BS/U6為骨架，在載體BS/U6的ApaI和EcoRI的酶切位點上，插入同源酶切位點的長度為21nt的DNA靶序列構(gòu)建獲得能表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒；使DNA質(zhì)粒在細胞內(nèi)或體內(nèi)能穩(wěn)定、高效地表達siRNA，從而達到較高的傳染率和RNAi作用，能充分抑制靶蛋白，最高抑制率可以達到75％，而且本發(fā)明是以全新廣譜的構(gòu)建載體為骨架所構(gòu)建的表達載體系統(tǒng)，在該構(gòu)建載體BS/U6上可以構(gòu)建各種目的基因的表達小分子干擾RNA的DNA質(zhì)粒；且本發(fā)明的DNA質(zhì)粒在細胞內(nèi)介導(dǎo)RNAi具有表達穩(wěn)定、持續(xù)時間長和抑制效果明顯等優(yōu)點。文檔編號C12N15/63GK101333539SQ20081006021公開日2008年12月31日申請日期2008年3月31日優(yōu)先權(quán)日2008年3月31日發(fā)明者樂燕萍,龍香娥,龔朝輝申請人:寧波大學(xué)