專利名稱：一種中國(guó)被毛孢生理小種的發(fā)現(xiàn)及工藝優(yōu)化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及優(yōu)良中國(guó)被毛孢生理小種的篩選及其產(chǎn)業(yè)化方法改進(jìn)。
(二) 背景4支術(shù)
冬蟲夏草與人參、鹿萆同被譽(yù)為中國(guó)三大寶，有"百藥之王，，的美稱，被 歷代醫(yī)家稱為"理諸虛百損之圣藥"。近年來(lái)，由于冬蟲夏草價(jià)格持續(xù)上漲，而 冬蟲夏草產(chǎn)量又在逐漸下降，市場(chǎng)上出現(xiàn)了各種各樣的，支冬蟲夏草和假冬蟲夏 草制品，真?zhèn)坞y辨。如何鑒別冬蟲夏草？如何使冬蟲夏草真正產(chǎn)業(yè)化，來(lái)解決 市場(chǎng)的供不應(yīng)求，緩解采挖冬蟲夏草帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境污染，成為了人們?nèi)找骊P(guān) 注的問(wèn)題。
蟲草屬有497種，中藥冬蟲夏草只是其中的一種，^立丁名全稱為Corf/ycej^ w'/7e/^" ( Berk. ) Sacc.,是以蟲草蝙蝠蛾幼蟲為宿主并長(zhǎng)成蟲型菌核和草型 子座的復(fù)合體(子座是高等真菌的有性器官)。冬蟲夏草產(chǎn)業(yè)化首決條件是確切 分離到冬蟲夏草菌。2005年10月29日，中國(guó)菌物學(xué)會(huì)在北京召開(kāi)了 "冬蟲夏 草及其無(wú)性型研討會(huì)"，與會(huì)專家就冬蟲夏草菌及其無(wú)性型科學(xué)名稱的正確使用 一致做出了下列結(jié)論
1. 冬蟲夏草菌的拉丁學(xué)名是Cor辦ce;^ W/2e/2w、，其無(wú)性型是中國(guó)被毛孢， 國(guó)際承認(rèn)的無(wú)性型拉丁學(xué)名為^/rsr"/" i"2./7e/7"'5" Liu，Guo，Yu et Zeng(1989)。冬蟲夏草頭孑包 (Cep力s/。5770W咖f/0"gc力。/7gx/3c30/7/a入蝙蟲畐蛾 ^皮毛孑包 (力e; /a/i)、 中華束絲孑包(5>/7/7e/z7af/i// s/z2e/2se)為中國(guó) 被毛孢的同種異名，且系不合格發(fā)表名稱，不為國(guó)際所承認(rèn)。
2. 中國(guó)擬青霉(戶ae"7o/z^ces s/加/^/s Chen, 1984 )不是冬蟲夏草菌的 無(wú)性型，而是不同于冬蟲夏草菌的另一種真菌，其有性型名稱尚不明確。
3. 蝙蝠蛾擬青霉(戶ae"7。7Z77ce5^力e一// Chen et Dai, 1989 )不是冬蟲 夏草菌的無(wú)性型，而是不同于冬蟲夏草菌的另一種真菌，其有性型名稱尚不明確。
此外，雖然下列菌種均未被納入上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程，但是，至靈膠嚢生產(chǎn)菌被孢 霉屬真菌，在親緣關(guān)系上是和子嚢菌相距甚遠(yuǎn)的結(jié)合菌門的成員，因此，與冬 蟲夏草菌無(wú)關(guān)。標(biāo)明為"人工冬蟲夏草菌絲粉"的心肝寶膠嚢的生產(chǎn)菌"粉紅
膠霉"則是一種真菌寄生菌；其膠霉屬(Gliocladium Corda )是肉座菌科 (Hypocreaceae)小火山5求赤殼菌屬(Sphaerostibella )的無(wú)性型，也不是冬蟲 夏草菌。根據(jù)上述分析，無(wú)論是至靈膠嚢、寧心寶膠嚢或心肝寶膠嚢的生產(chǎn)菌
均非冬蟲夏草菌的無(wú)性型。
以中國(guó)被毛孢為菌種發(fā)酵生產(chǎn)制品的出現(xiàn)(如百令膠嚢)，不但有效緩解了 冬蟲夏草市場(chǎng)供需矛盾，延緩草原環(huán)境惡化，而且使冬蟲夏草變得有名但不再 昂貴，能讓更多的老百姓享用得起。但是也存在許多不足，人們使用人工冬蟲 夏草制品后容易上火，少數(shù)產(chǎn)生胃腸道不良反應(yīng)，而天然冬蟲夏草性溫平，幾 乎很少發(fā)生，所以人工冬蟲夏草制品在療效上與天然冬蟲夏草存在一定的距離； 另外，人工冬蟲夏草發(fā)酵廢液的排放對(duì)環(huán)境也造成比較大的污染。解決這些問(wèn) 題， 一方面需要從優(yōu)良菌種的篩選著手，另一方面從發(fā)酵工藝上進(jìn)行改進(jìn)。
本發(fā)明就是發(fā)現(xiàn)一種優(yōu)良中國(guó)被毛孢生理小種及其產(chǎn)業(yè)化方法的改進(jìn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明使用細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息分析篩選出了一種中國(guó)被毛孢生理小種，并通 過(guò)改進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化工藝，所得產(chǎn)物與青藏高原那曲、玉樹產(chǎn)的冬蟲夏草從AM9、 RBL等細(xì)胞捕獲細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息的集成數(shù)據(jù)相同。
為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
1 .構(gòu)建天然冬蟲夏草標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息圖譜
U天然冬蟲夏草提取
稱取不同產(chǎn)地冬蟲夏草0. 09g,加lmL純凈水，浸泡30分鐘，超聲10分鐘， 沸水加熱20分鐘，離心，耳又上清液備用。2. 2提取液介入細(xì)胞培養(yǎng)
取不同產(chǎn)地冬蟲夏草提取液lOuL,加入鋪有103~ 104個(gè)/孔細(xì)胞的相對(duì)應(yīng)孔 內(nèi)，使用市售儀器獲取細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息，建立冬蟲夏草標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息圖譜。 2.中國(guó)被毛孢菌種篩選 2.1中國(guó)被毛孢菌絲體提取
稱取中國(guó)被毛孢菌絲體0. 09g,力口 lmL純凈水，浸泡30分鐘，超聲10分鐘，
沸水加熱20分鐘，離心，取上清液備用。
2. 2提取液介入細(xì)胞培養(yǎng)
取中國(guó)被毛孢菌絲體提取液lOuL,加入鋪有103~ 104個(gè)/孔細(xì)胞的相對(duì)應(yīng)孔 內(nèi)，以青藏高原那曲、玉樹等地產(chǎn)的天然冬蟲夏草為對(duì)照，使用市售儀器獲取 細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息，篩選接近天然冬蟲夏草圖譜的中國(guó)被毛孢生理小種。
3. 中國(guó)被毛孢生理小種發(fā)酵外液處理工藝改進(jìn)
按中國(guó)被毛孢常規(guī)發(fā)酵后，取發(fā)酵外液，濾液分別用300、 500、 1000、 2000、 3000、 4000分子量的超濾離心管或膜濃縮，冷凍千燥，得發(fā)酵外液干粉。取各 干粉0. 09g,加lmL純凈水溶解，取10uL加入鋪有103 ~ 104個(gè)/孔細(xì)胞的相對(duì)應(yīng) 孔內(nèi)，以青藏高原那曲、玉樹等地產(chǎn)的天然冬蟲夏草為對(duì)照，使用市售儀器獲 取細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息，篩選發(fā)酵外液接近天然冬蟲夏草圖譜的分子量段。
所述中國(guó)被毛孢常規(guī)發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單流程為斜面培養(yǎng)—種瓶培養(yǎng)—發(fā)酵灌 培養(yǎng)—發(fā)酵終點(diǎn)。
上述方法中，所述的細(xì)胞可以有很多種，比如AM9、 RBL等。
上述方法中，所述的獲取細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息的方法可以有很多種，比如RT-CES 實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析才企測(cè)系統(tǒng)等。
對(duì)不同產(chǎn)地的天然冬蟲夏草通過(guò)細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息方法分析，結(jié)果表明西藏那曲和青海玉樹出產(chǎn)的冬蟲夏草比較接近。以西藏那曲和青海玉樹出產(chǎn)的冬蟲 夏草作為對(duì)照，對(duì)不同中國(guó)被毛孢菌抹通過(guò)細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息方法分析，篩選出 同青藏高原那曲、玉樹產(chǎn)冬蟲夏草具有相同集成信息的菌林。以西藏那曲和青 海玉樹出產(chǎn)的冬蟲夏草作為對(duì)照，對(duì)發(fā)酵外液不同分子量段，通過(guò)細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài) 信息方法分析，篩選出發(fā)酵外液同青藏高原那曲、玉樹產(chǎn)冬蟲夏草具有相同集 成信息的分子量l殳。
中國(guó)被毛胞生理小種產(chǎn)業(yè)化工藝改進(jìn)結(jié)果取中國(guó)被毛胞生理小種常規(guī)發(fā) 酵物，固液分離，濾液取300 ~ 4000 ,史分子量的膜濃縮，濃縮液分別或與菌絲 體混合冷凍干燥或烘干，得中國(guó)被毛孢生理小種的發(fā)酵終產(chǎn)物。
本發(fā)明所述提供了 一種中國(guó)被毛孢生理小種的篩選及其產(chǎn)業(yè)化方法，其有 益效果主要體現(xiàn)在(1)本發(fā)明所述的分析方法是建立在大規(guī)模細(xì)胞生物學(xué)功 能基礎(chǔ)上，可以反應(yīng)不同中國(guó)被毛孢菌林同天然冬蟲夏草生物功能的接近程度， 為篩選更接近天然冬蟲夏草的中國(guó)被毛孢菌林提供參考。(2)本方法對(duì)天然冬 蟲夏草細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息獲取分析可以用來(lái)作為真、假冬蟲夏草制品的鑒別。(3) 中國(guó)被毛孢發(fā)酵物處理工藝的改進(jìn)，大大提高了產(chǎn)量，同時(shí)也減少了環(huán)境污染。
(四)


圖1、不同產(chǎn)地天然冬蟲夏草的A549細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息分析
圖2、以天然冬蟲夏草RBL細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息圖作為對(duì)照篩選中國(guó)被毛孢菌株
圖3、不同蟲草制品的RBL細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息分析
圖4、不同蟲草制品的RBL細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息分析
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不
僅限于此實(shí)施例1:不同產(chǎn)地天然冬蟲夏草的A549細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息分析 1.1不同產(chǎn)地的天然冬蟲夏草提取
取不同產(chǎn)地的天然冬蟲夏草，干燥、粉碎，稱取西藏那曲冬蟲夏草、西藏 林芝冬蟲夏草、青海海南州冬蟲夏草、青海玉樹冬蟲夏草、四川德格冬蟲夏草、 四川阿壩縣冬蟲夏草、云南玉龍雪山冬蟲夏草各0. 09g,力口 lmL純凈水，浸泡
30分鐘，超聲10分鐘，沸水加熱20分鐘，離心，取上清液備用。
1. 2提取液介入細(xì)胞培養(yǎng)
取不同產(chǎn)地的天然冬蟲夏草提取液10uL,加入鋪有5000個(gè)/孔的A549細(xì)胞 林的相對(duì)應(yīng)孔內(nèi)，使用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析檢測(cè)系統(tǒng)獲取細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息(見(jiàn)圖1)。 實(shí)施例2:中國(guó)凈皮毛孢生理小種的篩選
2.1中國(guó)被毛孢菌絲體提取
稱取1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)中國(guó)被毛孢菌種發(fā)酵菌絲體0. 09g，加 lmL純凈水，浸泡30分鐘，超聲10分鐘，沸水加熱20分鐘，離心3500轉(zhuǎn)/分
15分鐘，取上清液備用。
2. 2提取液介入細(xì)胞培養(yǎng)
取1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)中國(guó)被毛孢菌種菌絲體提取液10uL，加入 鋪有4000個(gè)/孔的RBL細(xì)胞^朱相對(duì)應(yīng)孔內(nèi)，以青藏高原那曲、玉樹等地產(chǎn)的天 然冬蟲夏草作為陽(yáng)性對(duì)照，使用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析檢測(cè)系統(tǒng)獲取細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息(見(jiàn)
圖2)。
實(shí)施例3:不同蟲草制品的細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息分析 3.1不同蟲草制品提取
稱不同蟲草制品百令膠嚢(批號(hào)021154 )、金水寶膠嚢(批號(hào)051101)、 天聊牌蟲草菌絲體膠嚢、至靈膠嚢、奇滋寶膠嚢、位元堂冬蟲夏草(西藏、天然野生)制品、東臺(tái)冬蟲夏草凍干粉、金蟲草養(yǎng)生膠嚢、寧心寶膠嚢各O. 09g,
加lmL純凈水，浸泡30分鐘，超聲10分鐘，沸水加熱20分鐘，離心，取上清
液備用。
3. 2提取液介入細(xì)胞培養(yǎng)
取不同蟲草制品提取液10uL，加入鋪有4000個(gè)/孔的RBL細(xì)胞抹的相對(duì)應(yīng) 孔內(nèi)，以青藏高原那曲、玉樹等地產(chǎn)的天然冬蟲夏草為對(duì)照，使用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分 析檢測(cè)系統(tǒng)獲取細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息(見(jiàn)圖3、 4)。
權(quán)利要求
1、一種用細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息鑒別各地冬蟲夏草、中國(guó)被毛孢(蝙蝠蛾被毛孢)和各種″蟲草″，篩選出的中國(guó)被毛孢生理小種，經(jīng)產(chǎn)業(yè)化所得的產(chǎn)物與青藏高原道地藥材的冬蟲夏草相同。
2、 權(quán)利要求1所述細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息是一種基于現(xiàn)代分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)而 建立的快速、微量、體外篩選模型的高通量技術(shù)方法，使用一種或多種分離自 人體或動(dòng)植物或微生物的各種組織和器官細(xì)胞，或永生化細(xì)胞，如A549、 RBL， 3T3, C0S7等細(xì)胞，被市售檢測(cè)儀器捕獲的各種細(xì)胞學(xué)的動(dòng)態(tài)信息，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué) 分析方法轉(zhuǎn)換成數(shù)學(xué)矩陣或數(shù)字或字母構(gòu)成的條碼表示，作為冬蟲夏草及其代 謝產(chǎn)物或其復(fù)方制品的各種生物功能或藥效的象征標(biāo)記或冬蟲夏草質(zhì)量高低的 識(shí)別標(biāo)志。
3、 權(quán)利要求1所述鑒別各地冬蟲夏草、中國(guó)被毛孢(蝙蝠蛾被毛孢)和各 種"蟲草"是以青藏高原道地藥材產(chǎn)地的西藏那曲和青海玉樹的冬蟲夏草從A549 獲取的細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息圖譜為標(biāo)準(zhǔn)比較各地冬蟲夏草、中國(guó)被毛孢(蝙蝠蛾被毛 孢)和市售的各種"蟲草"。
4、 權(quán)利要求1所述篩選出的中國(guó)被毛孢生理小種是指在從A549獲取的細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息圖譜為標(biāo)準(zhǔn)比較，與青藏高原道地藥材產(chǎn)地的西藏那曲和青海玉樹 的冬蟲夏草一致的冬蟲夏草菌種，并定名為中國(guó)被毛孢那曲玉樹生理小種#2-/^w"http://a "'i2e/7512.51扭朋《r/i^zi Guo， Fu & Ke。
5、 權(quán)利要求1所述產(chǎn)業(yè)化是指中國(guó)被毛孢那曲玉樹生理小種經(jīng)傳統(tǒng)液體培 養(yǎng)(發(fā)酵培養(yǎng))和固液分離，發(fā)酵培養(yǎng)外液使用膜分離截留技術(shù)，從發(fā)酵外液 中提取與冬蟲夏草相似作用的有效部位，和菌絲體合并或分別冷凍干燥或烘干 或噴霧干燥，共同制成保健食品或藥品或食品。
6、 權(quán)利要求l所述經(jīng)產(chǎn)業(yè)化所得的產(chǎn)物與青藏高原道地藥材的冬蟲夏草相 同是指在從RBL獲取的細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息圖譜為標(biāo)準(zhǔn)比較，中國(guó)被毛孢那曲玉樹生 理小種的產(chǎn)業(yè)化產(chǎn)品與青藏高原道地藥材產(chǎn)地的西藏那曲和青海玉樹的冬蟲夏 草一致。
7、 權(quán)利要求2所述冬蟲夏草質(zhì)量高低的識(shí)別標(biāo)志是指依據(jù)與道地藥材西藏 那曲和青海玉樹產(chǎn)的冬蟲夏草細(xì)胞圖譜的接近程度，用一個(gè)至十個(gè)星級(jí)表示冬蟲夏草的質(zhì)量高低。
8、 權(quán)利要求5所述發(fā)酵培養(yǎng)外液使用膜分離截留技術(shù)是指兩次使用有機(jī)膜， 截留分子量為300或500到3000或4000的物質(zhì)。
9、 權(quán)利要求5所述冷凍干燥或烘千或噴霧干燥是指中國(guó)被毛孢那曲玉樹生 理小種液體培養(yǎng)后經(jīng)固液分離所得的菌絲體和經(jīng)膜分離截留，分別或合并冷凍 干燥或烘干或噴霧干燥。
全文摘要
本發(fā)明是建立在細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)信息基礎(chǔ)上，鑒別青藏高原不同產(chǎn)地和真假冬蟲夏草或制品，篩選分離自青藏高原不同產(chǎn)地的冬蟲夏草菌種中國(guó)被毛孢(蝙蝠蛾被毛孢)。依據(jù)與道地藥材西藏那曲和青海玉樹產(chǎn)的冬蟲夏草細(xì)胞圖譜的接近程度，用一至十星級(jí)表示冬蟲夏草的質(zhì)量高低。同時(shí)，篩選出一種最接近天然冬蟲夏草細(xì)胞圖譜的中國(guó)被毛孢生理小種。本發(fā)明還涉及了中國(guó)被毛孢生理小種產(chǎn)業(yè)化方法的改進(jìn)，使用膜分離截留技術(shù)，從發(fā)酵外液中提取與冬蟲夏草相似作用的有效部位，和菌絲體合并或分別冷凍干燥，共同制成保健食品或藥品或食品。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101307352SQ200810061049
公開(kāi)日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2008年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月7日
發(fā)明者傅惠英, 柯傳奎, 柯越海, 鄭勇軍 申請(qǐng)人:柯傳奎