專利名稱：：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物技術(shù)，涉及一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)的方法。這種方法能有效地純化胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞和提高其體外的擴(kuò)增能力。技術(shù)背景人足月胎盤中存在一種具有多分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞。相關(guān)的研究已經(jīng)表明這種干細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。這種干細(xì)胞被稱為胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，將在醫(yī)學(xué)上具有細(xì)胞移植和組織工程化的重大利用價(jià)值。由于目前還尚未發(fā)現(xiàn)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞專一的特異性標(biāo)記分子，因此該干細(xì)胞的分離純化采用的還是間接的方法傳統(tǒng)的方法是釆用灌流方法通過(guò)臍血管沖出胎盤殘留血液后，在分離血液中單個(gè)核細(xì)胞、并進(jìn)行貼附培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，利用間充質(zhì)干細(xì)胞的貼附性在細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)貼壁形成紡錘形的成纖維狀細(xì)胞，并經(jīng)過(guò)傳代貼壁來(lái)逐步純化間充質(zhì)干細(xì)胞。另一類方法是剪切胎盤組織，并用膠原酶或胰酶消化組織后收集分散細(xì)胞，再行貼附培養(yǎng)方法進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞分離和純化。這兩種方法簡(jiǎn)單方便，但是這種方法分離的細(xì)胞實(shí)質(zhì)是多種細(xì)胞的混合物，而非克隆化的間充質(zhì)干細(xì)胞。這種多細(xì)胞混合物的繼代培養(yǎng)和擴(kuò)增能力較低，難以形成真正的間充質(zhì)干細(xì)胞株系。雖然目前尚不清楚胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記分子，但公認(rèn)為其表現(xiàn)為CD3r、CD3《、CD45'、CD29+、CD73+、CD90+、CD105+和CD166+。根據(jù)這些特點(diǎn)，如果能在細(xì)胞原代貼附培養(yǎng)、積聚一定的細(xì)胞數(shù)量基礎(chǔ)上，再利用特異的抗體標(biāo)記免疫磁珠進(jìn)行分選，則能有效地提高胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的純化率。在胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增方面，目前一般采用的是含有一定比例(如10-20%等)血清(如胎牛血清等)的培養(yǎng)基(如DMEM-LG等)進(jìn)行貼壁培養(yǎng)擴(kuò)增，也有人使用成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-2)等促進(jìn)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。但是，考慮到將來(lái)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床移植應(yīng)用的需要，采用無(wú)血清培養(yǎng)基以及臨床級(jí)細(xì)胞生長(zhǎng)因子具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。
發(fā)明內(nèi)容為了有效提高胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的體外純化率和擴(kuò)增能力，本發(fā)明的目的是提供一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)取胎盤母體側(cè)蛻膜，剪碎后用0.1%IV型膠原酶消化并收集細(xì)胞，以DMEM(Dulbeco'sModifiedEagleMedium)培養(yǎng)基(含10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，杭州)和2mML-谷氨酰胺(Sigma,上海)進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，再行負(fù)、正向免疫分選結(jié)合的方法純化胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得CD3《CD105+細(xì)胞，在無(wú)血清體外培養(yǎng)體系中繼代擴(kuò)增培養(yǎng)。本發(fā)明對(duì)貼壁培養(yǎng)后收獲的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞第一步行負(fù)向純化，即進(jìn)行陰性免疫篩選。所用的陰性免疫篩選是采用CD34標(biāo)記磁珠(MACS,MiltenyiBiotechInc.，上海)分選，獲得CD34—細(xì)胞。本發(fā)明對(duì)再次貼壁培養(yǎng)后收獲的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞第二步行正向純化，即進(jìn)行陽(yáng)性免疫篩選。所用的陽(yáng)性免疫篩選是采用CD105標(biāo)記磁珠(MACS，MiltenyiBiotechInc.,上海)分選，獲得CD3《CD105+細(xì)胞。本發(fā)明所述的無(wú)血清體外培養(yǎng)體系，含有無(wú)血清培養(yǎng)基和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(FGF-2，Sigma，上海)，其中無(wú)血清培養(yǎng)基含有DMEM/F12(Dulbeco'sModifiedEagleMedia/NutrientMixtureF-12)培養(yǎng)液(GIBCO，上海)、L-谷氨酰胺、P-巰基乙醇和非必需氨基酸(Sigma,上海)，其組成比例為DMEM/F12培養(yǎng)液lmML-谷氨酰胺O.lmMp-巰基乙醇1%非必需氨基酸。無(wú)血清培養(yǎng)基與FGF-2比例為無(wú)血清培養(yǎng)基5ng/mlFGF畫2。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述方法在胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)中應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是(1)本發(fā)明提供的技術(shù)中采用收集胎盤母體側(cè)蛻膜組織細(xì)胞后，先進(jìn)行原代細(xì)胞的貼壁擴(kuò)增，然后再行抗體標(biāo)記免疫磁珠分選，這樣每次只需少量原代細(xì)胞(1X1()S個(gè)細(xì)胞)就可以達(dá)到比較好的分選效果。(2)采用正、負(fù)向免疫分選相結(jié)合的方法進(jìn)一步提高了胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的純化率。由此方法純化的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有比較高的增殖潛能和分化潛能。與未分選的貼壁紡錘狀細(xì)胞相比，其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期可以提前2-4天，并且最快可以在5天的時(shí)間內(nèi)完成細(xì)胞單層的形成；而未分選的細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中鋪層較慢，細(xì)胞生長(zhǎng)期可達(dá)9天之久。(3)采用含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子的新培養(yǎng)體系能有效地提高了胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增能力，并且不含血清的培養(yǎng)系統(tǒng)將有利于臨床安全移植應(yīng)用。(4)新分選技術(shù)和培養(yǎng)體系不但對(duì)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有明顯的擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)，并且擴(kuò)增的細(xì)胞具備多分化潛能。圖1為原代第一代和雙向分選后第一代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)。圖2為原代第三代和雙向分選后第一代細(xì)胞的擴(kuò)增能力比較。圖3為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞定向誘導(dǎo)。具體實(shí)施方式本發(fā)明結(jié)合具體實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1本發(fā)明方法采取的一個(gè)具體方法是取胎盤母體側(cè)蛻膜，剪碎小塊胎兒蛻膜側(cè)胎盤組織，0.1y。IV型膠原酶消化后收集細(xì)胞，以細(xì)胞培養(yǎng)基(含DMEM、10%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺)進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。1、細(xì)胞在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)鋪層后，棄去培養(yǎng)液及懸浮的細(xì)胞。用Tryspin-EDTA消化并收獲貼壁的紡錘狀細(xì)胞。收獲的細(xì)胞用PBS洗滌一次后懸浮在PBS中。然后按MACS公司提供的操作說(shuō)明，用吸附CD14單克隆抗體-磁珠分離系統(tǒng)(MACS,MiltenyiBiotechInc.,上海)從懸浮細(xì)胞中分選CD3《細(xì)胞。收集的CD3《細(xì)胞再行貼壁培養(yǎng)鋪層后，收獲細(xì)胞，并經(jīng)PBS洗滌一次后，再用吸附CD105單克隆抗體-磁珠分離系統(tǒng)(MACS,MiltenyiBiotechInc.，上海)分選CD34-CD105+細(xì)胞。2、分選的CD3fCD105+細(xì)胞在含有FGF-2的無(wú)血清培養(yǎng)體系(DMEM/F12培養(yǎng)液、lmML-谷氨酰胺、O.lmMp-巰基乙醇、1%非必需氨基酸、5ng/mlFGF-2)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。實(shí)施例2分離純化效率用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定不同分離純化技術(shù)獲得細(xì)胞中不同標(biāo)記性細(xì)胞表面抗原的比例見(jiàn)表l。表l.不同分離純化技術(shù)獲得細(xì)胞中不同標(biāo)記性細(xì)胞表面抗原的比例(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>原代的胎盤母體側(cè)蛻膜細(xì)胞中CD34+、CD45+、CD105+和CD29+細(xì)胞分別平均為7.22%、11.65%、47.14%和34.62°/。，說(shuō)明原代貼壁紡錘狀細(xì)胞中以間充質(zhì)細(xì)胞為主。經(jīng)過(guò)2次傳代貼壁培養(yǎng)后，CD34+細(xì)胞和CD45+細(xì)胞有所減少，而CD90+和CD105細(xì)胞有所增加，但是其中還含有少量CD34+細(xì)胞和CD45+細(xì)胞。經(jīng)過(guò)CD14單克隆抗體和CD105單克隆抗體-磁珠系統(tǒng)分選，獲得的細(xì)胞基本上為CD34-CD45—CD105+CD29+細(xì)胞。根據(jù)上述平行代(原代第三代和分選第一代)比較，經(jīng)過(guò)雙向分選的細(xì)胞更具間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原特征。實(shí)施例3不同分選方法獲得的細(xì)胞形態(tài)參見(jiàn)圖1，IV型膠原酶消化的胎兒蛻膜側(cè)胎盤組織細(xì)胞在接種后24小時(shí)可以見(jiàn)到長(zhǎng)梭形細(xì)胞貼壁，并且成放射狀或同心圓狀排列。大量的集落出現(xiàn)在接種4天后，然后逐漸在培養(yǎng)瓶底部鋪層。在Teflen-25培養(yǎng)瓶中細(xì)胞擴(kuò)增形成單層需要14-16天時(shí)間。圖1A顯示在倒置顯微鏡下，細(xì)胞呈梭形，IOXIO倍。細(xì)胞經(jīng)2次傳代后，細(xì)胞呈顯著的纖維狀細(xì)胞，細(xì)胞接種后經(jīng)過(guò)8-9天形成細(xì)胞單層(圖1B)。經(jīng)過(guò)CD34和CD105單克隆抗體-磁珠系統(tǒng)分選的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(CD3《CD105+)在新的無(wú)血清培養(yǎng)體系(人參皂甙多糖/DMEM-LG/10%FBS)下進(jìn)行第1代擴(kuò)增培養(yǎng)，在Teflen-25培養(yǎng)瓶中經(jīng)過(guò)5-6天形成了細(xì)胞單層。圖1C顯示在倒置顯微鏡下，細(xì)胞呈纖維形，IOXIO倍。分選細(xì)胞貼壁擴(kuò)增后完全表現(xiàn)為細(xì)長(zhǎng)的纖維狀，并且在顯微鏡下看不見(jiàn)其他任何雜質(zhì)細(xì)胞的存在。實(shí)施例4擴(kuò)增能力比較分析收獲原代第三代細(xì)胞，在不作任何篩選的情況下直接進(jìn)行新的無(wú)血清培養(yǎng)體系下的擴(kuò)增能力測(cè)定，同時(shí)也進(jìn)行含血清培養(yǎng)體系下分選第一代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)。上述兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果再與新的無(wú)血清培養(yǎng)體系下分選第一代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)進(jìn)行比較，細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)動(dòng)態(tài)參見(jiàn)圖2，其中一^一表示無(wú)血清培養(yǎng)體系下原代第三代細(xì)胞，一令一表示含血清培養(yǎng)體系下分選第一代細(xì)胞，一畫一表示無(wú)血清培養(yǎng)體系下分選第一代細(xì)胞。從圖2的比較結(jié)果分析，在培養(yǎng)的第l-9天內(nèi)，兩種培養(yǎng)體系下的分選第一代細(xì)胞都明顯具有生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)分選細(xì)胞貼壁后快速生長(zhǎng)，在培養(yǎng)的第3天開始出現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，至第5天基本上達(dá)到鋪層；未分選的細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)快速的時(shí)期比較滯后，大約在第5出現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，至第8-9天才達(dá)到鋪層。在無(wú)血清培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的第一代分選細(xì)胞平均鋪層時(shí)間為6.3天，在含血清培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的第一代分選細(xì)胞平均鋪層時(shí)間為6.1天，兩種培養(yǎng)體系之間無(wú)顯著性差異(尸>0.05)。說(shuō)明無(wú)血清培養(yǎng)體系完全可以替代含血清培養(yǎng)體系來(lái)支持胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的體外闊增培養(yǎng)。在無(wú)血清培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的未分選第三代細(xì)胞平均鋪層時(shí)間為8.4天。說(shuō)明在相同的培養(yǎng)體系下，分選細(xì)胞比未分選細(xì)胞具有更強(qiáng)的體外擴(kuò)增能力。實(shí)施例5胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化取分選后第3代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，制備制成單細(xì)胞懸液，以2乂104個(gè)/培養(yǎng)皿接種于直徑30mm的培養(yǎng)皿進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到鋪層80-90%時(shí)，用脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液(DMEM—LG培養(yǎng)液，10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100g/ml鏈霉素，10ng/ml胰島素，lpM地塞米松，0.5mMl-甲基-3-異丁基-黃嘌呤，lOOpMH引哚美辛)進(jìn)行脂肪細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化；用成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液(DMEM—LG培養(yǎng)液，10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100g/ml鏈霉素，0.1|iM地塞米松，10mMP-甘油磷酸鈉，50pM2-磷酸-抗壞血酸)進(jìn)行成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)；用軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液(DMEM—LG培養(yǎng)液，10%胎牛血清，10ng/ml類胰島素生長(zhǎng)因子I(IGF-I)、10ng/ml轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子卩l(xiāng)(TGF-卩1)和50|ig/ml的維生素C(VC))進(jìn)行軟骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)；用神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)液(DMEM—LG培養(yǎng)液，2%二甲基亞砜，200^iM丁化羥基苯甲醚(BHA)，lpM氫化可的松，10ng/mlIGF-I，0.5,全反式維甲酸(ATRA))進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞定向誘導(dǎo)。參見(jiàn)圖3A，在脂肪細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，第7天起光鏡下可見(jiàn)黃色的圓形脂滴沉著的細(xì)胞，外形變?yōu)閳A形，橢圓形，細(xì)胞核被脂滴擠于一側(cè)。油紅O染色示胞核呈藍(lán)色，脂滴呈紅色。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪細(xì)胞的比例逐漸增高。圖3A中，為油紅O染色后含有脂滴的細(xì)胞，25X10倍。參見(jiàn)圖3B，在成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，一般從第5天開始，可以看到細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榱⒎叫?，折光性?qiáng)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，立方形的細(xì)胞比例逐漸增高。細(xì)胞繼續(xù)增殖，形成復(fù)層。改良鈣鈷法堿性磷酸酶染色的誘導(dǎo)細(xì)胞胞漿深棕色或深黑色，其中充滿致密的黑色沉淀。圖3B中，為改良鈣鈷法堿性磷酸酶染色后的細(xì)胞，25X10倍。參見(jiàn)圖3C，經(jīng)軟骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)21天后，細(xì)胞產(chǎn)生了大量的二型膠原蛋白。用EnViskm二步免疫組化技術(shù)檢測(cè)II型膠原蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞顯示陽(yáng)性紅色反應(yīng)。圖3C中，為EnVision二步免疫組化染色的細(xì)胞，25X10倍。參見(jiàn)圖3D，細(xì)胞在神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程中梭形細(xì)胞的比例在明顯下降，并開始轉(zhuǎn)變?yōu)檩^為典型的神經(jīng)元表型特征，如胞體呈現(xiàn)高折光率，且伸出長(zhǎng)的分支，并在末端有錐狀體出現(xiàn)，可能為神經(jīng)元細(xì)胞的曲張?bào)w。誘導(dǎo)后第6天有神經(jīng)元特異性烯醇化酶的顯著表達(dá)。圖3D中，為表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶的細(xì)胞，25X10倍。實(shí)例總結(jié)(1)本分選技術(shù)有效地富集了胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)原代貼壁培養(yǎng)后進(jìn)行CD34陰性反應(yīng)和CD105陽(yáng)性反應(yīng)篩選，CD90陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到85.6%，CD105陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到92.3。/。，并且基本上排除了CD34和CD45陽(yáng)性細(xì)胞。(2)分選的細(xì)胞具有擴(kuò)增和繼代培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)經(jīng)本分選技術(shù)分選的細(xì)胞具有顯著的擴(kuò)增能力。分選細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期比未分選細(xì)胞要提前2-4天，由此導(dǎo)致分選細(xì)胞的快速貼壁和形成細(xì)胞單層，并在5-6天之內(nèi)完成一個(gè)世代的鋪層。(3)新無(wú)血清擴(kuò)增培養(yǎng)體系有效促進(jìn)了胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增效率-在細(xì)胞分選后的培養(yǎng)中，設(shè)計(jì)的新無(wú)血清培養(yǎng)體系對(duì)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁和擴(kuò)增具有和含血清培養(yǎng)基相當(dāng)?shù)淖饔茫⑶铱砂踩褂糜谂R床移植。(4)擴(kuò)增的分選細(xì)胞具有分化多潛能性分選細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增數(shù)代后仍具備分化多潛能性，能定向誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。權(quán)利要求1.一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)取胎盤母體側(cè)蛻膜，剪碎后用0.1％IV型膠原酶消化并收集細(xì)胞，以含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和2mML-谷氨酰胺進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，再行負(fù)、正向免疫分選結(jié)合的方法純化胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得CD34-CD105+細(xì)胞，再在體外無(wú)血清培養(yǎng)體系中繼代擴(kuò)增培養(yǎng)，其中所述負(fù)向純化是行陰性免疫篩選，所述正向純化是行陽(yáng)性免疫篩選，所述無(wú)血清體外培養(yǎng)體系含有無(wú)血清培養(yǎng)基和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征是所述無(wú)血清培養(yǎng)基含有DMEM/F12培養(yǎng)液、L-谷氨酰胺、p-巰基乙醇和非必需氨基酸，其組成比例為DMEM/F12培養(yǎng)液lmML-谷氨酰胺:O.lmMP-巰基乙醇1%非必需氨基酸，無(wú)血清培養(yǎng)基與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2的比例為l:5ng/ml。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征是所述的陰性免疫篩選是采用CD34標(biāo)記磁珠分選，獲得CD34—細(xì)胞。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征是所用的陽(yáng)性免疫篩選是采用CD105標(biāo)記磁珠分選，獲得CD34-CD105+細(xì)胞。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法在純化胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞中應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法在胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)中應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，采用收集胎盤母體側(cè)蛻膜組織細(xì)胞后，先進(jìn)行原代細(xì)胞的貼壁擴(kuò)增，再行正、負(fù)向免疫分選結(jié)合的方法純化胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得CD34^-CD105⁺細(xì)胞，在無(wú)血清體外培養(yǎng)體系中繼代擴(kuò)增培養(yǎng)。本發(fā)明方法每次只需少量原代細(xì)胞(1×10⁵個(gè)細(xì)胞)就可以達(dá)到比較好的分選效果，可進(jìn)一步提高了胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的純化率。所用培養(yǎng)體系不但對(duì)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有明顯的擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)，并且擴(kuò)增的細(xì)胞具備多分化潛能?？稍诩兓ケP間充質(zhì)干細(xì)胞和體外擴(kuò)增培養(yǎng)中應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N5/08GK101270349SQ20081006126公開日2008年9月24日申請(qǐng)日期2008年3月20日優(yōu)先權(quán)日2008年3月20日發(fā)明者王金福,石東燕,袁文佶申請(qǐng)人:浙江大學(xué)