專利名稱：：一種鏈球菌特異性噬菌體裂解酶的生產方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種鏈球菌特異性噬菌體裂解酶的生產方法。技術背景鏈球菌屬(5^rep&""M)細菌為革蘭氏陽性菌，廣泛分布于自然界，其中包括種類繁多的致病菌和棲居于各種宿主(包括人類、馬、豬和牛)的共生性細菌。在宿主體內，鏈球菌通常在口、鼻孔和咽的粘膜表面定居。然而，在某些情況下，它們也可以棲居于皮膚、心臟或肌肉組織。鏈球菌屬可分為數個亞類根據其細胞壁抗原性的不同分為A、B、C等18個族；根據其溶解紅血球的能力分為甲型(不完全溶血)、乙型(完全溶血)和丙型(不溶血)。人類的致病鏈球菌包括化膿鏈球菌(5./y^"朋")、肺炎鏈球菌(5:/^ew^/^3e)和糞鏈球菌(6:/aocsa's)等，這些鏈球菌可致敗血癥、關節(jié)炎、腦膜炎、心內膜炎、腦炎、流產、多發(fā)性漿膜炎、膿疤病、風濕熱、猩紅熱、腎小球腎炎、急性咽炎(即"鏈球菌喉")、侵入性筋膜炎(有時被媒體描述為"食肉細菌")、支氣管肺炎和猩紅熱等臨床疾病，曾給人類帶來巨大的災難，有數以億計的人喪生于該類致病菌。據CDC(美國疾病防治中心)統計，目前美國每年發(fā)生約10，00015,000例侵入性A族鏈球菌所致疾病，導致超過2，000人死亡；每年發(fā)生50(Tl，500例壞死性筋膜炎和2，0003，000例鏈球菌性中毒性休克綜合癥，約20%的壞死性筋膜炎患者、60%的鏈球菌性中毒性休克綜合癥患者和1015%的其它形式侵入性A族鏈球菌性疾病患者死亡；另外，C族鏈球菌可以因皮膚割破而引起蜂窩織炎，特別是在老年或虛弱的個體中容易引起死亡；新生兒中這種細菌的嚴重感染率是2%。至3%。?？股氐膽?，使得該類疾病得到了一定的控制。但隨著人類對抗菌藥物的廣泛應用、耐藥性細菌的大量出現，多重耐藥菌的產生及傳播己成為全世界高度關注的問題。人們試圖通過不斷研制強效的新型抗菌藥物，或者通過加大抗生素劑量、增加用藥時間來抑制細菌日益復雜的耐藥性。但是，任何一種新型的抗菌藥物在臨床應用后，仍將面對細菌耐藥性的產生；而且，抗生素不容易通過粘膜表層，對抗生素過敏的人也越來越多。以鏈球菌為例，在法國，造成耳炎、腦膜炎和肺炎的鏈球菌其抗藥性發(fā)生率從20世紀80年代的1%上升到了如今的50%，且大有繼續(xù)上升趨勢；我國近年來致病性鏈球菌的抗藥性發(fā)生率亦呈明顯上升趨勢，20012002年杭州地區(qū)感染肺炎鏈球菌耐藥率調査表明，肺炎鏈球菌中對青霉素敏感的菌株僅占42.1%，對氯霉素和甲氨芐啶-磺胺異噁唑耐藥率為14.9%和48.1%，對紅霉素耐藥率竟達90.7%，明顯高于歐美國家；并且這些耐藥菌株往往呈多重耐藥性。這種情況若不加以控制，人類可能又將無奈地把鏈球菌型腦炎、肺炎等列為不治之癥。因此，開發(fā)出更為有效的治療藥物，降低甚至消除抗藥性，以防止這些疾病的再度流行，對國家的國計民生都是相當重要的。自從1915年英國細菌學家Twort和1917年法國細菌學家D'Herelle觀察到噬菌體以來，人們對噬菌體的研究日益深入。噬菌體(bacteriophage)是一類特異性感染細菌的病毒。其中，雙鏈DNA(dsDNA)噬菌體在感染細菌的后期會表達出一類細胞壁水解酶，即噬菌體裂解酶(bacteriophagelysins)。該酶通過水解細菌細胞壁肽聚糖上糖與肽間的酰胺鍵或肽內氨基酸殘基間的肽鍵而使細胞壁分解，又可使釋放的噬菌體再與宿主細菌結合，并將編碼不同噬菌體蛋白的基因轉入到宿主中，而后噬菌體利用宿主細菌的蛋白質合成系統、氨基酸合成系統等以及由宿主產生的能量，在宿主體內復制增殖，從而不斷表達噬菌體裂解酶以達到完全裂解宿主菌的目的(Maloy等編，微生物遺傳學，(Microbialgenetics),JonesandBartlett出版社，1994)。通過序列比較發(fā)現，所有噬菌體裂解酶在結構上具有相似性，即含有比較保守的N端催化區(qū)和差異較大的C端特異性結合區(qū)2個結構域。裂解酶的高親和性與種屬特異的細胞壁糖基有關，而后者常常是細菌存活的必要成分。因此，細菌難以產生對裂解酶的抗性。通過用細菌專性噬菌體感染細菌產生的噬菌體相關裂解酶的應用，對于疾病的治療有諸多好處靶向特定的細菌；具有選擇作用，不干擾正常菌群的功能；作用快速，且不依賴于細菌生長；主要攻擊不受質粒變異影響的細胞壁結構。此外，將裂解酶導向粘膜內襯，可殺死定居粘膜內襯的細菌。國內外報道了不少利用噬菌體裂解酶作為新型抗菌藥物的試驗和成果。2001年洛克菲勒大學的Nelson等人發(fā)現能專一裂解鏈球菌的裂解酶PlyC，其后發(fā)現該酶以多聚體形式存在。這種噬菌體裂解酶對鏈球菌有很強的殺滅作用，體外試驗表明，10ng的噬菌體裂解酶在5s內，可使1X1(^個鏈球菌死亡，相當于幾個裂解酶分子就可使一個細菌死亡。因此，這種噬菌體裂解酶對鏈球菌的殺滅作用是驚人的。另外，PlyC對A、C、E族鏈球菌有很強的殺滅作用，但對B、D、F、G、L、N族鏈球菌及大腸桿菌等其它細菌沒有作用，說明裂解酶的抗菌作用具有特異性。小鼠咽喉炎動物模型實驗表明，口服5ng的噬菌體裂解酶，2h后完全檢測不到鏈球菌的存在。因此，鏈球菌特異性噬菌體裂解酶PlyC可以開發(fā)成為一種診斷、預防、治療鏈球菌感染的藥物。但是用常規(guī)方法制備PlyC不僅價格高、工序繁雜，而且還存在安全方面的問題，不適宜大規(guī)模生產。因此作為該酶開發(fā)利用的前提，首先應解決高效制備PlyC的方法。利用重組基因工程技術在大腸桿菌中表達外源目的蛋白是目前大量、經濟獲得目的功能蛋白的主要方法。目前也還未見在大腸桿菌中對鏈球菌噬菌體裂解酶PlyC進行高效表達的報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種鏈球菌特異性噬菌體裂解酶的生產方法。本發(fā)明所表達的一種重組鏈球菌特異性噬菌體裂解酶，由重鏈(約50kDa/條)PlyCA、輕鏈(約8kDa/條)PlyCB以1:8的比例構成，其基因名稱為尸/少C,表達重鏈和輕鏈的基因分別為戶&C4和戶/;;CS。該鏈球菌特異性噬菌體裂解酶的生產方法包括如下步驟1)擴增如下核苷酸序列所述的鏈球菌特異性噬菌體裂解酶PlyC的基因尸fyC4和尸/j;C萬序列表中PlyCA和PlyCB的DNA序列，其分別編碼了PlyCA和PlyCB的氨基酸序列。2)構建尸&C4和尸/;;C萬的重組表達載體；3)將重組表達載體分別轉入宿主細胞，獲得表達鏈球菌噬菌體裂解酶PlyC重鏈PlyCA和輕鏈PlyCB的工程菌；4)發(fā)酵培養(yǎng)表達鏈球菌噬菌體裂解酶PlyC的重鏈PlyCA和輕鏈PlyCB的工程菌，誘導表達獲得重組基因表達產物；5)將上述重組基因表達產物，經純化分離、復性，得到鏈球菌特異性噬菌體裂解酶PlyC。所述原核細胞表達載體為pET-32a(+)，0端有6*^8;具有T71ac啟動子，可采用Ni-chelatingsepharose親和層析純化。該載體也可選擇其它適于在大腸桿菌中表達外源基因的載體，如pET系列、pGEX系列、pMAL系列、pBAD系列等。所述鏈球菌噬菌體裂解酶PlyC的基因戶/;;C4和iVyG5分別插入到pET-32a(+)的iVtfeI禾卩WoI酶切位點間。所述工程菌為大腸桿菌BL21(DE3)。上述方法中，所述表達為誘導表達，所用的誘導劑為IPTG，誘導濃度0.1-1.2mmol/L，PlyCA工程菌優(yōu)選為0.5mmol/L，PlyCB工程菌優(yōu)選為0.3mmol/L。所述工程菌的培養(yǎng)溫度為37°C，誘導表達的溫度為20-37°C。本發(fā)明在大腸桿菌BL21(DE3)中可高效表達，裂解酶重鏈PlyCA與輕鏈PlyCB的表達量均可達到菌體總蛋白的30%以上，表達產物經鎳柱親和層析純化、復性后獲得重組PlyC。活性測定表明，本發(fā)明生產的鏈球菌特異性噬菌體裂解酶PlyC對致病性的A族和C族鏈球菌有很強的裂解能力，并具有很高的特異性，可用于診斷、預防敗血癥、關節(jié)炎、腦膜炎、心內膜炎、腦炎、支氣管肺炎等各種與鏈球菌相關的臨床疾病。本發(fā)明方法可獲得大量對致病性鏈球菌殺滅效果顯著的、具有明確酶活性與理化特性的產品，產品生產成本低、產物活性強，可為得到一種新型、高效、價格較為低廉的鏈球菌感染疾病治療藥物打下物質和理論基礎。圖1為本發(fā)明的PlyC在大腸桿菌中高效表達圖譜，各泳道指示含義如下泳道1:誘導表達BL21(DE3)/pET-32a(+)-尸fyC萬泳道2:分子量Marker泳道3:未誘導BL21(DE3)/pET-32a(+)-尸/yC4泳道4:誘導表達BL21(DE3)/pET-32a(+)-尸/yC4泳道5:高密度發(fā)酵培養(yǎng)BL21(DE3)/pET-32a圖2為本發(fā)明的重組PlyC高效裂解鏈球菌圖譜；圖3為本發(fā)明的重組PlyC特異裂解鏈球菌圖譜。具體實施方式下述實例用以進一步說明本發(fā)明，可供參考，但并不由此限制本發(fā)明范圍。實施例中的方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例l:1)擴增序列表中PlyCA和PlyCB的DNA序列所述的鏈球菌噬菌體裂解酶PlyC的基因戶fyC4和i^C^:2)構建P/;;C4和戶/;;C萬的重組表達載體；3)將重組表達載體分別轉入宿主細胞，獲得表達鏈球菌噬菌體裂解酶PlyC重鏈PlyCA和輕鏈PlyCB的工程菌；4)發(fā)酵培養(yǎng)表達鏈球菌噬菌體裂解酶PlyC的重鏈PlyCA和輕鏈PlyCB的工程菌，獲得重組基因表達產物；5)純化分離、復性，誘導表達得到鏈球菌噬菌體裂解酶PlyC。實施例2:PlyC序列克隆、載體連接及質粒命名按照PlyCA和PlyCB的序列設計引物,其特征為上下游引物分別有A^I禾口^0i酶切位點，按下列順序和條件及比例依次加入各反應物并進行擴增反應體積為25pL，其中含模板DNA0.5pL、10xbuffer2.5pL、2,5mmol/LMgCl22^L、2,5mmol/LdNTP2fiL、50|xmol/LPll(iL、50(xmol/LP2lfiL、ddH2014.5^iL、Taq酶(5U/^L)1.5|aL。PCR參數:95。C預變性5min;94°C30s，55°C30s，72°C60s，共35個循環(huán)；最后72'C延伸10min。在擴增同時設不加模板只加ddH20的空白對照。反應結束后，取5pL擴增產物用1.2。/。的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR產物的酶切、純化和克隆在LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素10(^g/mL)中37'C過夜振蕩培養(yǎng)攜帶pET-32a(+)質粒的宿主細菌，提取質粒，再將載體pET-32a(+)和PCR產物用AWel和^oI進行雙酶切，酶切后通過低熔點瓊脂糖凝膠電泳和DNA純化試劑盒回收目的基因和載體pET-32a(+)。在T4DNA連接酶的作用下，將雙酶切過的目的基因和載體于4'C連接16h后，轉化BL21(DE3)感受態(tài)細胞。將轉化的BL21(DE3)鋪于含氨芐青霉素(100|ig/mL)的LB平板，37'C培養(yǎng)過夜。陽性克隆的鑒定、目的基因的測序及分析挑取平板上的白色菌落，接種于含氨芐青霉素(100pg/mL)的LB培養(yǎng)液中，37"C振蕩培養(yǎng)過夜后，提取質粒，用MfeI和^TzoI進行雙酶切鑒定，同時用I單酶切的pET-32a(+)空質粒和重組質粒作為對照。對雙酶切鑒定正確的重組質粒測序，結果表明該基因與原基因(見序列表)序列一致，該基因編碼序列表中PlyCA和PlyCB的氨基酸殘基序列(鏈球菌特異性噬菌體裂解酶PlyC的氨基酸序列)。將鑒定正確的重組質粒命名為pET-32a(+)-尸fyC4和pET-32a(+)-尸&CS。載體pET-32a(+)質粒圖譜的相關信息如下圖譜庫ID:G0311質粒名稱pET-32a(+)載體類型Bacterial載體抗性Ampicillin培養(yǎng)條件Growinstandardco//，37°C特征序列區(qū)為:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>pGEX3_primer3269-3247ROP—3062-3253tet(852-576)2587-2312pBRrevBamjprimer887-868lacl1162-2253lacO762-735T7_promoter780-762tet(564-300)1079-816EK230-219OrfD1294-2253T7—terminator129-1T7Terminal_primer69-87Orfl5302-4442T7translenRBS717-701Or5——327-1421實施例3:PlyC蛋白的PlyCA和PlyCB在工程菌中的高效表達及產物的純化與復性重組菌BL21(DE3)/pET-32a(+)-P/yC4和BL21(DE3)/pET-32a(+)-尸fyC5接種到含氨芐青霉素(lOOpg/mL)的LB培養(yǎng)液中，37°C，250r/min振蕩過夜培養(yǎng)后，按1:50比例轉接至100mLLB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至600nm下A600值達1.01.5時加入IPTG至終濃度為1mmo1/L,誘導表達4h，SDS-PAGE檢測表達情況。根據電泳結果，分別選用一個單克隆菌株為實驗菌株。該菌株接種振蕩培養(yǎng)至A畫值0.81.2時作為種子液，以5°/。(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵。采用自控5L發(fā)酵罐進行分批補料高密度發(fā)酵試驗，初始工作體積為3.0L。設置指標為發(fā)酵溫度37"C，初始攪拌速度400r/min,初始通氣量1.5L/min，不斷提高攪拌轉速與通氣量最大分別至650r/min和3.5L/min以維持溶解氧始終在30%以上，pH值誘導前為7.2，誘導后為7.4。培養(yǎng)分分批培養(yǎng)和分批補料兩個階段，每隔lh取樣測定A60。、細胞干重和葡萄糖濃度等參數。當檢測到培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡時開始流加補料，補料總量為發(fā)酵液總體積的20%。誘導后培養(yǎng)57h，放罐，離心菌液，超聲破碎菌體，離心收集上清與沉淀，分別加上樣緩沖液煮沸5min，用SDS-PAGE檢測表達情況。結果發(fā)現產物大多以包涵體形式存在。PlyC在大腸桿菌中高效表達圖譜如圖1所示。用包涵體洗滌緩沖液(50mmo1/LTris-HCl，pH8.0，0.5mo1/LNaCl，10mmo1/LEDTA，1%TritonX-100，lmmol/L巰基乙醇)和Tris-HCl緩沖液各洗滌包涵體1次，收集包涵體，加入pH8.0的8mo1/L尿素溶液使其溶解，根據pET-32a(+)質粒在其T71ac啟動子下游含連續(xù)6個組氨酸密碼子特性，用Ni-chdatingsepharose親和層析柱純化目的蛋白，淋洗至基線后進行線性洗脫，咪唑濃度范圍為0600mmo1/L。透析去除咪唑和NaCl。將純化后的PlyCA和PlyCB在低于50ug/mL濃度下以1:8的比例加入復性緩沖液(10mmo1/LPBS，0.9mmo1/L谷胱甘肽氧化型，0.8mmol/L谷胱甘肽還原型，2mmol/L尿素，pH8.0)，攪拌，使其恢復天然構象，超濾濃縮脫鹽。實施例4:重組PlyC高效與特異裂解鏈球菌將一株A族鏈球菌培養(yǎng)至A6Q()=0.4，用PBS洗滌重懸成A6ofl.2的菌液，取lmL，分別加入0嗎、2.5,5.0嗎、10.0)ig高效表達后用鎳柱親和層析方法純化并已經復性處理的重組PlyC，混合，用分光光度計動態(tài)測定菌液A,值，A,值的下降反映細菌被裂解。結果如圖2所示，結果表明PlyC對該株A族鏈球菌的裂解作用與PlyC的量成正相關，10pg的PlyC能高效裂解鏈球菌。用和鏈球菌相似的菌株作為對照，檢測本發(fā)明表達的PlyC對鏈球菌裂解作用的特異性，將50pg本發(fā)明表達的PlyC分別與5X106cfii的一株A族鏈球菌(化膿鏈球菌,S.;^oge"")和一株C族鏈球菌(咽峽炎鏈球菌,S.a"g/mww)單獨混合，將50嗎本發(fā)明表達的PlyC分別與各5X106cfU的嗜熱鏈球菌、枯草桿菌、大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌DH5cc、普通變形桿菌、金黃色葡萄球菌等6株菌株單獨混合，用分光光度計動態(tài)觀測菌液A,的值，總時間10min，每隔lmin讀取數據，5min后基本裂解完全，計算裂解率，(1一A"Aq)X(A。為初始A6。o值，a為5min讀取的八6。。值)，結果如圖3所示，表明本發(fā)明表達的PlyC對枯草桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌等各菌株無任何裂解活性，對金黃色葡萄球菌有輕微作用，而對A族、C族鏈球菌有較高的殺死率，對同屬的嗜熱鏈球菌有一定裂解作用。說明本發(fā)明表達的PlyC對致病性鏈球菌的裂解作用有很強的特異性；圖3中1為金黃色葡萄球菌，2、3、4、5為大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌DH5a、普通變形桿菌、枯草桿菌，6為嗜熱鏈球菌，7、8為化膿鏈球菌和咽峽炎鏈球菌。序列表〈110〉浙江樹人大學〈120〉一種鏈球菌特異性噬菌體裂解酶的生產方法〈160〉4〈170>Patentlnversion3.1〈210>1〈211〉1422〈212〉DNA〈213>Streptococcus〈400〉1acaacaatacga^aa^tatttagcac^cc60acatttgggttatcacctcaacaggttgctgattggtttatgggtcaagctggtgctagg120cctgttattaactcgtatggggta犯tgctagta^ttt3gtatcaacgtacatacctaaa180atgcaggaatacggtgtatcatatacactattctta已tgtatactgtctttgagggaggc240ggcgcaggtatcattacatgtacgatacggggtctaatggattagagtgt300ttggaacacgatttacaatacatacatggcgtctggga犯cttattttccaccagcttta360tctgcgccagaatgttacccgata3cgc3ggtgctttagatagattttat420caatcgctaccaggccg犯c已tggggtgatgtt已tgatacctagtacaatggctggtaat480gcttgggtatgggcttat33ctattgtgttascaacca^8ggggctgccccattagtttac540tttggcaatccatacgatagagcttgcttgc^tgggagctgacccgttt600acaggtggttcaattacaggaatcctagtgttggcactgggaatgctacc660gtttctgctagctcgg卿cta^C3g3g3gaagttaaag8aagccctaacagatttattc720aacaacaacctagaacatct8tC3ggtgaattctacggtaaccaagtgttgaatgctatg7803aatacggcactatcctgaaatgtgatttaac3gstgacggacttaatgccattcttcsa840ttaatagctgatgttaacttcctaacccag3caaaccg3ccgttcaatca900ccaggtcaaa3Cg3ttt3gggtcggggtctgat卿gttgcagcaaacttagccaatgca960caggcgcaagtcggta^gtatattggtgacggtcaatgtt3tgCttgggttggttggtgg1020tcagctagggtatgtggttattctatttcagtgacccaatgctaccgtta1080attggtgatggtatgaacgctcattctatccatcttggttgggattggtc肌tcgcaaat1140actggtattgttaactacccsgttggtactgttggacgca8gg^gstttgagagtcggc1200gcgatatggtgcgctacagcattctctggcgctccgttttat3C8gga^atacggccat1260<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>GluThrTyrPheProProAlaLeuSerAlaProGluCysTyrProAla115AspAsnAlaGlyThrGlu130GlyArgThrTrpGly145AlaTrpValTrpLeu120LeuAspArgPheAla135ValMetlieProCys125GinSerLeuProProLeuValTyr180GlyAla165PheAsp150TyrAsnTyrCysTyr140ThrMetAlaSer155AsnAsnGinGlyAlaAspProLeuAlaMet195GlyLysAsnProSerVal210SerGluAlaAsnArgGlu225230AsnAsnAsnLeuGluHisGlyAsnProAspVal170AspSerGinlieGly215LysPhe200ThrTyr185ThrGlyGlySerGlyAsn160AlaAla175SerLeuAsp190ThrGlyAspGlu245LysTyrGlyThrGlyAsnAlalysLeuSerGlylie205ValSerAlaSerLeuCysLysAla235PheLeuAsnAlaMet260AsnAlalieLeuAspGlyLeu275ThrAsnProAsnProAsp290AspLeuGlySerGlySer305310GinAlaGinValGlyLysGlu250lieLeuLysCys265LeulieAlaAspThr220LeuThrAspTyrGlyAsnGlyAspGin280ProThrValGinLeuPhe240GinVal255LeuThrAsp270AsnLeuGinL>ys295AspArgValAlaVal285ProGlyGinAsnSer300AsnLeuAlaValGlyThrGlyTrpAsp355Gly325SerAlaArgValTrp340ProMetLeuProTyrlieGlyArgAsp330GlyAla315GlyGinCysTyrLeu360Cys345lieGlyAspGlyTyrSerlieAspGlyMet365AsnAla320AlaTrp335TyrSerSer350AsnAlaHisSerlie370AsnTyr385AlalieGinTyrThrValHisProTrpGlyLeu435LeuLeuGlyTrpAsp375ValGlyThrVal390CysAlaThrAla405HisThrGlylie420GluGinAsnlieAsnThrPheLeu455HisHisHisHis470TyrAsp450LysLeuGlu465〈210〉4〈211〉80〈212〉PRT〈213〉Streptococcus〈400>4MetSerLyslie1PheLeuPhelieAsnGly35PheGinGin50AlalieArg65His20VallieLysAsnValAsn5ThrAspGlyGlulieGlylieProSer55AlaMetLysTrpSerlieAlaAsnThr380GlyArgLysGluAspLeu395PheSerGlyAlaProPhe410lieGluSerTrpSerAsp425LeuGlySerProVallie440445SerThrLeuThrGlyLeu460HisHisValGluAsnValSerGly10LysGluSerTyrGlyTyr25lieLysAsplieGluThr4045lieAsnlieSerLysSer60LysLeuGluHisHisHisGlylieValArgValGly400TyrThrGly415ThrThrVal430ArgSerThrlieThrPheValGinGly15ArgAlaPhe30ValGinGlyAspValGluHisHisHis707580權利要求1.一種鏈球菌特異性噬菌體裂解酶的生產方法，其特征在于包括如下步驟1)擴增如下核苷酸序列所述的鏈球菌特異性噬菌體裂解酶PlyC的基因PlyCA和PlyCB，序列表中PlyCA和PlyCB的DNA序列，其分別編碼了PlyCA和PlyCB的氨基酸序列。2)構建PlyCA和PlyCB的重組表達載體；3)將重組表達載體分別轉入宿主細胞，獲得表達鏈球菌噬菌體裂解酶PlyC重鏈PlyCA和輕鏈PlyCB的工程菌；4)發(fā)酵培養(yǎng)表達鏈球菌噬菌體裂解酶PlyC的重鏈PlyCA和輕鏈PlyCB的工程菌，誘導表達獲得重組基因表達產物；5)將上述重組基因表達產物，經純化分離、復性，得到鏈球菌特異性噬菌體裂解酶PlyC。2.根據權利要求1所述的一種鏈球菌特異性噬菌體裂解酶的生產方法，其特征在于所述的表達載體為pET-32a(+)。3.根據權利要求1或2所述的一種鏈球菌特異性噬菌體裂解酶的生產方法，其特征在于所述鏈球菌噬菌體裂解酶PlyC的基因尸/;;C4和尸&C^分別插入到pET-32a(+)的7VcfeI禾n屈oI酶切位點間。4.根據權利要求1所述的一種鏈球菌特異性噬菌體裂解酶的生產方法，其特征在于所述工程菌為大腸桿菌BL21(DE3)。5.根據權利要求5所述的一種鏈球菌特異性噬菌體裂解酶的生產方法，其特征在于工程菌的培養(yǎng)溫度為37°C。6.根據權利要求1所述的一種鏈球菌特異性噬菌體裂解酶的生產方法，其特征在于所述誘導表達所用的誘導劑為IPTG，誘導濃度0.1~1.2mmol/L。7.根據權利要求1所述的一種鏈球菌特異性噬菌體裂解酶的生產方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)重鏈PlyCA和輕鏈PlyCB的工程菌，IPTG誘導濃度分別優(yōu)選為0.5mmol/L和0.3mmol/L。8.根據權利要求7所述的一種鏈球菌特異性噬菌體裂解酶的生產方法，其特征在于誘導表達的溫度為20~37°C。9.權利要求1所述的一種鏈球菌特異性噬菌體裂解酶的生產方法，其特征在于分離純化步驟包括Ni-chelatingsepharose親和層析和超濾。全文摘要本發(fā)明涉及一種鏈球菌特異性噬菌體裂解酶的生產方法。該裂解酶由重鏈(約50kDa/條)PlyCA、輕鏈(約8kDa/條)PlyCB以1∶8的比例構成，其基因名稱為PlyC，具有下述核苷酸序列序列表中PlyCA(序列1)和PlyCB(序列3)的DNA序列，兩者分別編碼了序列表中PlyCA的氨基酸序列(序列2)和PlyCB的氨基酸序列(序列4)。本發(fā)明采用大腸桿菌表達體系，分別構建含裂解酶重鏈和輕鏈基因PlyCA和PlyCB的重組質粒，轉化至BL21(DE3)細胞，發(fā)酵培養(yǎng)工程菌，使PlyCA和PlyCB得到高效表達。表達產物經純化、復性，獲得了鏈球菌噬菌體裂解酶PlyC。本發(fā)明的生產方法與常規(guī)方法相比，具有生產成本低廉、產物復性率高、產物活性強、生產方法安全、可滿足大規(guī)模生產的優(yōu)點。文檔編號C12N15/60GK101275146SQ20081006158公開日2008年10月1日申請日期2008年5月7日優(yōu)先權日2008年5月7日發(fā)明者張建芬,張德勇,朱成鋼,薇柯,胡文浪,胤陸,虹陳,陳蔚青申請人:浙江樹人大學