專利名稱：人二相代謝酶的三個(gè)功能性突變體及構(gòu)建和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是涉及用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)得到人二相代謝酶UGT2B7的三個(gè)功能性突變體基因，含有該突變基因的重組粘粒，用該載體轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞得到突變體重組酶。
背景技術(shù)：
尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶UGTs是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的糖蛋白，能催化一 系列內(nèi)源性和外源性親脂糖苷配基底物(如膽紅素，甾體激素，藥物，殺蟲劑等)， 使之葡萄糖醛酸化。根據(jù)氨基酸序列的同源性，可以將尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn) 移酶UGTs分為兩大家族UGT1A和UGT2B。 UGT2B7屬于UGT2B亞族，其基 因含有6個(gè)外顯子，總長(zhǎng)16kb，其中第1個(gè)外顯子和第2個(gè)外顯子編碼底物結(jié)合 區(qū)域(SBD)。從第3個(gè)外顯子到第6個(gè)外顯子編碼UDP葡醛酸結(jié)合位點(diǎn)。UGT2B7 不僅催化內(nèi)源物如留體激素類(雄留酮和雌三醇)，膽酸和維生素A，同樣也催 化臨床上廣泛運(yùn)用的非甾體激素抗炎藥(如萘普生，酮洛芬，布洛芬)，以及丙 戊酸鈉，普萘洛爾和AZT，同時(shí)也是唯一催化嗎啡類的二相代謝酶。與其他基因類似，UGT2B7基因也存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)。特別是 802OT,在外顯子2處發(fā)生錯(cuò)義，結(jié)果在268位的氨基酸由組氨酸(H)變?yōu)槔?氨酸(Y)，這個(gè)位點(diǎn)在SBD區(qū)。這個(gè)序列的突變?cè)赨GT2B7的多態(tài)性研究中有重 要意義[1'2'3]。據(jù)報(bào)道[4]， t/Gr2B73(H268Y，802OT)T/T基因型在中國(guó)人群中的分 布頻率為9.2%，比Caucasian (25.3%)分布低得多(; =0.00018)，但是與日本人 群的分布無顯著性差異(; =0.17)。與健康對(duì)照組相比，T/T基因型在癌癥患者中 的比率更高(25% :9%， p=0.03)。與同樣暴露在苯肼下的健康人相比，膀胱癌患 者的T/T基因型比率更高。Coffman等[5]研究發(fā)現(xiàn)UGT2B7*2代謝Normorphine (去甲嗎啡)禾Q Naltriben (S2受體拮抗劑)，而UGT2B7"不代謝。UGT2B7*2 對(duì)Buprenorphine(丁丙諾啡)的代謝是UGT2B7*1的10倍。Sawye^等研究發(fā)現(xiàn) UGT2B7*2比UGT2B7*1顯示了更高的嗎啡-6-0-葡醛酸/嗎啡比率。最近，又有報(bào)道211G〉T (位于外顯子l區(qū))，編碼的蛋白由丙氨酸(A)突變?yōu)?絲氨酸(S)，此突變點(diǎn)位于SBD區(qū)域，這個(gè)突變體可能會(huì)影響底物結(jié)合的特異性。Katsuhiko等問報(bào)道UGT2B7承71S(71A〉S，211G>T)在日本人群中的分布頻率為 18.40%。研究者也發(fā)現(xiàn)了位于外顯子5區(qū)的突變點(diǎn)1192G〉A(chǔ)，野生型編碼的蛋白D398 是位于UDP葡醛酸結(jié)合的后半位置，這個(gè)酸性氨基酸殘基在哺乳動(dòng)物中是高度保 守的，從酸性氨基酸天冬氨酸(D)突變?yōu)橹行园被崽彀滨０?N)可能會(huì)影響UDP-葡萄糖醛酸化的結(jié)合[3]。上述研究表明，UGT2B7基因多態(tài)性的存在可能潛在地使藥物相互作用的情況 更加復(fù)雜化，因?yàn)榘械任换蛲蛔兊牟∪丝赡鼙憩F(xiàn)為葡萄糖醛酸化活性的增 強(qiáng)或減弱，對(duì)于不同個(gè)體用藥時(shí)會(huì)表現(xiàn)出不同的藥效/藥動(dòng)(PK/PD)行為f^。因此，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)體外構(gòu)建和表達(dá)功能性突變體重組酶，并以此為 工具有助于研究UGT2B7等位基因多態(tài)性所產(chǎn)生的藥物代謝情況的差異，有助于預(yù)測(cè)個(gè)體化用藥可能產(chǎn)生的副作用，并對(duì)實(shí)行個(gè)體化合理用藥有特別重要的指導(dǎo)意 義，除此之外，也能在分子水平上更好地研究酶與底物藥物的構(gòu)效關(guān)系。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)和桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 獲得的人二相代謝酶(UGT2B7)的三個(gè)功能性突變體重組酶UGT2B7*71S (A71S,211G>T)， UGT2B7*2(H268Y， 802 OT)和UGT2B7*5(D398N，1192G>A)。 SEQIDNO:l為UGT2B7*71S (A71S，211G>T)的核苷酸序列和氨基酸序列；SEQ ID NO:2為UGT2B7*2(H268Y, 802 OT)的核苷酸序列和氨基酸序列；SEQ ID NO:3為UGT2B7f5(D398N，1192G〉A(chǔ))的核苷酸序列和氨基酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供人二相代謝酶(UGT2B7)的三個(gè)功能性突變體 重組酶基因的構(gòu)建方法，是利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)獲得，即在PCR所用引物中 導(dǎo)入突變位點(diǎn)，以帶冇人UGT2B7的野生型基因的質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)、磷 酸化、自身連接和轉(zhuǎn)化，分別合成帶有UGT2B7的三個(gè)功能性突變體重組酶基因 的質(zhì)粒。具體步驟為1.野生型基因的獲得按照GENEBANK中的人UGT2B7基因合成引物，上下游引物分別引入 和^oI位點(diǎn)和保護(hù)堿基。以人肝組織為模板，通過TRIZOL試劑提取總RNA， 通過RT-PCR,并在終止密碼子前添加6-His標(biāo)簽，得到PCR產(chǎn)物后，與pGEM 載體相連接獲得pGEM-UGT2B7重組質(zhì)粒，并用pGEM通用引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行 測(cè)序，經(jīng)過DNASTAR軟件與genebank中NM 001074序列進(jìn)行比對(duì)，證明已獲得序列完全正確的UGT2B7的基因克隆。SEQ IDNO:4為UGT2B7的核苷酸序列 和氨基酸序列。2. 野生型質(zhì)粒模板的提取將已測(cè)序驗(yàn)證正確的pGEM-UGT2B7重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中得重組菌落，將重組菌落在瓊脂培養(yǎng)板上進(jìn)行劃板， 然后挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落，接種至2 ml 5 ml LB培養(yǎng)液中(含100pg/ml 氨芐青霉素)，37 °C強(qiáng)烈振搖過夜。取1.5 ml培養(yǎng)物倒入1.5 ml離心管中，12 OOOg 離心15s，棄上清回收菌體；加入100pl溶液I，用槍頭或振蕩器充分懸浮細(xì)胞；加 入100pl溶液II，立即輕輕上下顛倒5次~6次，使細(xì)菌裂解，室溫放置lmin; 加入430 pl溶液III，立即上下顛倒5次 10次，使之充分中和，室溫放置2min;12 000 rpm高速離心2 min 5 min，吸取上清至套放于2 ml收集管的UNIQ-10柱中， 8 000 rpm室溫離心1 min，丟棄收集管中廢液；將UNIQ-10柱放回2 ml收集管中， 吸取500 pl洗滌溶液到UNIQ-10柱，10 000rpm室溫離心30s，重復(fù)一次；棄收 集管中的廢液，將UNIQ-10柱放回2 ml收集管中，10 000rpm室溫離心15 s;棄 收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入一干凈的1.5 ml離心管中，加50pl溶解液 至膜中央，室溫放置2 min; 10 000 rpm室溫離心1 min。3. 引物的合成針對(duì)人藥物二相代謝酶UGT2B7的基因合成了3對(duì)引物，每 對(duì)引物含有突變位點(diǎn)，合成后溶于滅菌水中，-20°0保存?zhèn)溆谩?. 利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，引入突變位點(diǎn)，然后經(jīng)過磷酸化、自身連接和 轉(zhuǎn)化等步驟后分別獲得人藥物二相代謝酶UGT2B7的突變基因(7(777^7*7^， t/( "57"和f/GT2B7"。5. 將人藥物二相代謝酶UGT2B7的突變基因t/GrZ57*7/S， C/Gr2S7*2和 t/G77B7*5與pFastBac載體相連接后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中發(fā) 生轉(zhuǎn)座作用，獲得重組粘粒Bacmid-t/GT2S7t7M ， Bacmid-t/G77575^和 Bacmid誦t/GT257"。6. 將重組粘粒Bacmid匿:/Gr2S7氺77S， Bacmid-t/Gr2B7"和Bacmid-t/Gr257" 分別感染昆蟲細(xì)胞，從而獲得各自的第一代病毒液，然后擴(kuò)增病毒液使其病毒滴 度至107 108pfu/ml，從而表達(dá)重組酶，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，在72小時(shí)后收集細(xì)胞，超 聲破碎獲得三個(gè)功能性突變體重組酶UGT2B7*71S， UGT2B7*2和UGT2B7*5。提供攜帶分別編碼本發(fā)明的三個(gè)功能性突變體重組酶基因序列的重組粘粒， 包括Bacmid-f/GT2B7承7M， Bacmid-t/G72S7"和Bacmid-t/Gr2B7"。本發(fā)明的宿主可以是被重組粘粒轉(zhuǎn)染，含有本發(fā)明功能性突變體基因的昆蟲7細(xì)胞其中優(yōu)選的是Sf9或SGl細(xì)胞。
許多克隆載體可以購(gòu)買商品化的如大腸桿菌克隆載體pGEM-T， pUC18， pUC19等。這些質(zhì)粒大小適合，帶有多克隆位點(diǎn)，通用引物和抗性標(biāo)記，用于方 便重組質(zhì)粒的篩選和測(cè)序。桿狀病毒穿梭載體pFastBac可在大腸桿菌中增殖。
表達(dá)重組酶的宿主可以是大腸桿菌、酵母、桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞和哺乳 動(dòng)物細(xì)胞。桿狀病毒表達(dá)介導(dǎo)的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)是一種超量重組蛋白的真核細(xì)胞表 達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)在原啟動(dòng)子的作用下可以高效表達(dá)外源蛋白并提供一個(gè)真核表達(dá) 環(huán)境，有利于外源重組蛋白的正確折疊，二硫鍵的形成，寡聚化及其它翻譯后加 工修飾，從而獲得具有生物活性的真核蛋白，使表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近天 然蛋白。
轉(zhuǎn)染所需核苷酸至宿主昆蟲細(xì)胞中可用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。成功轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞， 既含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，可以通過提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，或 者，細(xì)胞破碎液中蛋白可用抗His的抗體檢測(cè)。
可以通過培養(yǎng)桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞，轉(zhuǎn)染本發(fā)明構(gòu)建的重組粘粒，生產(chǎn) 本發(fā)明的突變體重組酶。具體的培養(yǎng)方法，可以先用小號(hào)細(xì)胞瓶進(jìn)行小量擴(kuò)增細(xì) 胞，然后轉(zhuǎn)入大號(hào)細(xì)胞瓶貼壁表達(dá)或者轉(zhuǎn)入搖瓶進(jìn)行大量懸浮表達(dá)。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供的人UGT2B7的三個(gè)功能性突變體重組酶在篩選
藥物中應(yīng)用。本發(fā)明提供的三個(gè)功能性突變體重組酶可預(yù)測(cè)個(gè)體化用藥可能產(chǎn)生 的藥物副作用，從而指導(dǎo)合理用藥。
本發(fā)明的目再一個(gè)的是提供的人UGT2B7的三個(gè)功能性突變體重組酶在分子 水平研究酶與底物藥物的構(gòu)效關(guān)系中應(yīng)用。
本發(fā)明提供的功能性突變體重組酶在昆蟲細(xì)胞中高水平表達(dá)，周期較短。桿 狀病毒有嚴(yán)格的宿主范圍，無人體病原性，操作安全。因?yàn)闂U狀病毒穿梭載體可 在大腸桿菌增殖，篩選重組陽性桿狀病毒穿梭載體可原核大腸桿菌中進(jìn)行，避 免了復(fù)雜、費(fèi)時(shí)的空斑篩選。在pFastBac轉(zhuǎn)入Bacmid時(shí)，采用mini-Tn7到att-Tn7 點(diǎn)特異轉(zhuǎn)位，大大提高重組效率，節(jié)省時(shí)間，簡(jiǎn)化操作。
因此本發(fā)明用于體外表達(dá)人UGT2B7野生型和功能性突變體重組酶的方法簡(jiǎn) 單、有效，并且容易放大進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明并不局限于本 文所說明和公開的功能性突變體的構(gòu)建和表達(dá)，而且包括可以從權(quán)利要求書范圍 中得出的更多的突變體。


圖1為人UGT2B7的PCR電泳結(jié)果，pGEM-T-UGT2B7質(zhì)粒和酶切電泳結(jié)果， pFastBac-UGT2B7質(zhì)粒和酶切電泳結(jié)果圖。 圖2為PCR定點(diǎn)突變?cè)韴D。
圖3為pGEM隱C/GT2B7517 ， pGEM-t/GT257*7M， pGEM-t/C r287*3和 pGEM-f/GT257*5的質(zhì)粒和酶切結(jié)果圖。
圖4為pGEM-C/GT2B7*77& pGEM-t/GrZB7*3和pGEM-C/GT2S7*5的測(cè)序
結(jié)果圖。
圖5為pFastBac-t/GT267*7， pFastBac-t/GT2S7*7/5", pFastBac陽t/GT2B7"和 pFastBac-t/Gr2S7"質(zhì)粒和酶切結(jié)果圖。
圖6為5acmz'U/GT2g7，丑acvmW-pFastBac和BacmzV/的PCR結(jié)果電泳圖。
圖7為B"cwW- C/Gr2S7〃， t/Gr2g7*7/5"， SacwW- C/GT2S7"和
Sacm" C/GT2S7"的PCR結(jié)果電泳圖。
圖8為mRNA分子水平驗(yàn)證UGT2B7*1， UGT2B7*71S, UGT2B7*2和 UGT2B7*5的結(jié)果圖。
圖9為western blot印跡法驗(yàn)證UGT2B7*1， UGT2B7*71S， UGT2B7*2和 UGT2B7*5蛋白表達(dá)的結(jié)果圖。
圖10為UGT2B7*1， UGT2B7*71S, UGT2B7*2和UGT2B7*5重組酶作用于 7-HFC的代謝酶動(dòng)力學(xué)圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。通過下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的 技術(shù)特征做詳細(xì)的描述，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1生產(chǎn)突變體重組酶的質(zhì)粒pGEM-f/GT2B7*7/5: pGEM-f/GT2B7*3 和pGEM-t/C r2B7"的構(gòu)建
一材料和方法
(一)實(shí)驗(yàn)材料
大腸桿菌菌株E.coli DH5 a ，本實(shí)驗(yàn)保存。PCR引物，上海生工。克隆質(zhì)粒 pGEM-T為Promega產(chǎn)品。
Takara MutanBEST試劑盒購(gòu)自Takara公司，限制性內(nèi)切酶、PCR產(chǎn)物回收 試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服 務(wù)有限公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司代為合成，測(cè)序服務(wù)由 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。(二)實(shí)驗(yàn)方法
1.人UGT2B7cDNA的克隆構(gòu)建
提取人肝組織的mRNA，取lmg左右加TRIzol試劑lml，勻漿30s。 4°C "12000g)離心10min，取上清。加入0.2ml氯仿，蓋緊離心管蓋，手搖劇烈振 蕩15秒，然后冰浴放置15分鐘，于4。C離心(《12000g) 15分鐘，RNA存在于 上層水相中。轉(zhuǎn)移水相至另一個(gè)干凈離心管中，加異丙醇0.5ml，混勻，室溫放置 IO分鐘以沉淀RNA，然后于4。C離心(《12000g) 10分鐘。移去上清液，加75% 乙醇lml洗滌沉淀，經(jīng)旋渦振蕩，于4。C離心(S7500g) 5分鐘，回收RNA沉淀。 移去上清液，將離心管置空氣中干燥，揮去乙醇，沉淀用50^1無核糖核酸酶 (RNase)的水(焦碳酸二乙酯處理)溶解，65'C放置15分鐘使變性，立即置冰 上備用或凍于-70。C冰箱中保存。肝組織總RNA2ul，水4ul，隨機(jī)引物4tU， 總體積20ul振蕩混勻。
按照GENEBANK中的人UGT2B7合成引物，上下游引物分別引入和 iol位點(diǎn)和保護(hù)堿基。
SEQ ID N0.5: gtc gac att gca cca ggatgt ctg tg (擴(kuò)增UGT2B7基因所用的上游引物) SEQ ID N0.6: etc gag ggt tttc cag ctt caa ate tca(擴(kuò)增UGT2B7基因所用的下游引物) 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)條件為lOOpl反應(yīng)體系中，加入1.5^1肝組織cDNA， 20nmol/L的上下游引物各1.5)^1， 10mmol/L的dNTPlpl， 10x反應(yīng)緩沖液lO[il， Taq DNA聚合酶0.5(il，剩余用ddH20補(bǔ)足。用EPPENDORF公司的(型號(hào)為Matstercycler Gradient)PCR儀，PCR條件為9《C預(yù)變性5分鐘；94"C變性40秒；54°。退火45 秒；72"C延伸2分鐘，共33個(gè)循環(huán)以后，再72'C延伸10分鐘。通過0.8%凝膠 電泳分析得到預(yù)期為1.6kb的條帶。PCR產(chǎn)物電泳純化用DNA片段回收試劑盒回 收純化目的條帶。取純化的UGT2B7 cDNA3pl，加入1^1 pGEM-T載體，5^1 2x 反應(yīng)緩沖液，lplT4DNA連接酶，16'C反應(yīng)過夜，轉(zhuǎn)化新鮮制作的DH5a感受態(tài) 細(xì)胞。轉(zhuǎn)化菌鋪于x-gal、 IPTG和氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37'C培養(yǎng)過夜。 挑取白色菌落，接種至5mL含50pg/ml LB液體培養(yǎng)基中，37t培養(yǎng)過夜，用小 量質(zhì)粒提取試劑盒，用和J^ol雙酶切后進(jìn)行電泳鑒定，參見圖1，其中A 圖泳道l.DNA標(biāo)記，泳道2.以從肝組織獲得的cDNA為模板的PCR產(chǎn)物；B 圖泳道l.DNA標(biāo)記，泳道2.重組的pGEM-UGT2B7質(zhì)粒，泳道3:重組的 pGEM-UGT2B7質(zhì)粒經(jīng)I雙酶切。用pGEM-T通用引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行 測(cè)序，走了一次walking后完成UGT2B7 cDNA全長(zhǎng)測(cè)序，經(jīng)過DNASTAR軟件與genebank中NM 001074序列進(jìn)行比對(duì)后，證明已獲得序列完全正確的UGT2B7 cDNA的克隆。
2. pGEM-f/Gr287*7/& pGEM-[/Gr287^和pGEM-t/G7257*5的構(gòu)建以pGEM-t/Gr2S7*7為模板，經(jīng)過定點(diǎn)突變獲得pGEM-f/GT^S * ^,pGEM-f/G77B7*2和pGEM-C/GT2B7*5。1)定點(diǎn)突變采用PCR技術(shù)，為獲得UGT2B7"的突變型基因，設(shè)計(jì)合成突變導(dǎo)入引物和對(duì)應(yīng)的引物，如下表所示(突變位點(diǎn)用斜體表示，對(duì)應(yīng)的引物的5'堿基的互補(bǔ)堿基必須和突變導(dǎo)入引物的5'堿基相接)突變位點(diǎn)引物UGT2B7*71 S(A71 S,211 G>T)SEQ ID NO.7 : aac tea tec (^ct ctt aaa att SEQ ID NO.8:gtt ggg ate aaa aag aat gga agUGT2B7*2(H268Y,802C>T)SEQ ID NO.9:cag ttt ccf" fb>t cca etc tta cc SEQ ID NO,10: aaa att cca gga gtt tgg aat aag cca tac gUGT2B7*5(D398N, 1192G>A)SEQ ID NO. 11: cca ttg ttt gec向at caa cct gat aac att gc SEQ ID N0.12: aat ccc cac cat agg gat ccc atg gta gat tgc2) PCR反應(yīng)體系(50 pi總體積)10 XPyrobest BufferdNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 4 piPrimer 1(20 |amol/L;)Primer 2(20 (amol/L)1 piTemplate0.01 ~ 1 ngPyrobest DNA Polymerase(5 U/nl) 0.25 piddH20up to 50按下列反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94 。C30 s55 60 °C30 s72 0C5 min卜3步循環(huán)30次，Hold on 8 °C3) 對(duì)PCR反應(yīng)液進(jìn)行1% Agarose凝膠電泳，切膠回收目的DNA片段；4) PCR產(chǎn)物的末端平滑化在Eppendorf管中配制以下反應(yīng)液目的DNA片段 約1 pmol10 X Blunting Kination Buffer 2 |ilBlunting Kination Enzyme Mix 1 (nlddH20 up to 20 pi37。C反應(yīng)10min，反應(yīng)液用雙蒸水定量至100 pl，加入100 pi (等量)的苯 酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，充分混勻。離心，取上層(水相)移至另一微量離 心管中。加入IOO ^ (等量)的氯仿/異戊醇(24:1)，充分混勻。離心，取上層 (水相)移至另一微量離心管中。加入10 pi (1/10)的3 mol/L CH3COONa (pH5.2)。 加入250 ^ (2.5倍量)的冷無水乙醇，-20 °C放置30 min ~ 60 min。離心回收沉淀， 用70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。用20pl的TE緩沖液溶解沉淀；5) 自身連接反應(yīng)取約0.25 pmol (5 pi)上述溶液于新的Eppendorf管中，加 入5 |il的Ligation Solution I (試劑盒自帶)，均勻混合。16 °C反應(yīng)1 h，也可延 長(zhǎng)時(shí)間至過夜以增加連接效率。參見圖2。6) 將突變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliDH5a中，小量提取質(zhì)粒，抽提所得的質(zhì)粒進(jìn)行電泳，觀察質(zhì)粒條帶位置，然后將可能正確的質(zhì)粒進(jìn)行SalI/XhoI雙酶切(已 插入的UGT2B7*1基因兩端帶有這兩個(gè)由PCR引物引入的酶切位點(diǎn))。酶切后進(jìn) 行核酸凝膠電泳，觀察是否產(chǎn)生1600 bp的基因片段和3000 bp的pGEM載體片段， 見圖3，初步確定幾個(gè)可能的陽性重組子克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序引物采用pGEM 載體的T7/SP6啟動(dòng)子引物。保存測(cè)序正確的質(zhì)粒，分別命名為 pGEM-t/GTZB * ", pGEM-C/GT2B7"和pGEM-f/GTZB7*5。圖3中泳道1和 10. DNA標(biāo)記；泳道2. pGEM-C/Gr2S7〃質(zhì)粒；泳道3. pGEM-(/GT2S7〃質(zhì)粒經(jīng) Sa/I/J^zol雙酶切；泳道4. pGEM-t/GT2B7+77S質(zhì)粒；泳道5. pGEM-t/Gr2B7*7M 質(zhì)粒經(jīng)Sa/I/^oI雙酶切；泳道6. pGEM-t/GT2S7*2質(zhì)粒；泳道7. pGEM-質(zhì)粒經(jīng)Sa/I/J^ol雙酶切；泳道8. pGEM-C/GT2B7*5質(zhì)粒；泳道9. pGEM-UGr2B7*5 質(zhì)粒經(jīng)<Sa/I/A7zoI雙酶切。測(cè)序結(jié)果顯示正確，參見圖4。圖4中A: t/Gr^7+7AS(A71S,211G〉T)的測(cè) 序結(jié)果；B:[/GT2B7*2(H268Y，802OT)的測(cè)序結(jié)果；C:t/Gr2B7*5(D398N,1192G>A)的測(cè)序結(jié)果。實(shí)施例2 pFastBac-[/Gr2S7*7/& pFastBac-C/GT2S7*2和pFastBac-C/GT2S7"的構(gòu)建將測(cè)序正確的pGEM-C/( r2B7f7/;S1， pGEM-t/GTZB7W和pGEM-C/Gr2e7"用 SalI/XhoI雙酶切，同時(shí)pFastBacTMl-t/Gr287"也用SalI/XhoI雙酶切，突變型目的 基因和載體用T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化入E. coli DH 5 a感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽性 菌落提取pFastBac-C/Gr2S7承7/S， pFastBac-(/Gr2B7"和pFastBac-t/Gr2S7"重組質(zhì)粒，同時(shí)進(jìn)行酶切鑒定，參見圖5。圖5中泳道1和10: DNA標(biāo)記；泳道2:pFastBac-C/GrZB7"質(zhì)粒；泳道3: pFastBac-C/GT2S7〃質(zhì)粒經(jīng)5"a/I/^oI雙酶切；泳 道4: pFastBac-f/GT2B7承7M質(zhì)粒；泳道5: pFastBac-￡/6!17287*7/51質(zhì)粒經(jīng)51"/1/;^01 雙酶切；泳道6: pFastBac-t/GT2S7"質(zhì)粒；泳道7: pFastBac-t/Gr2S7W質(zhì)粒經(jīng) Sa/I/A7zoI雙酶切；泳道8: 3318&0^/<3!7^87*5質(zhì)粒；泳道9: pFastBac-t/GT2S7*5 質(zhì)粒經(jīng)Sa/I/^7zoI雙酶切。實(shí)施例3 5^脂^- 7( 7^57*7/& 5ac脂W-t/Gr2B7"和SacmW- 7(^7257*5的制備將酶切鑒定正確的pFastBac-t/GT2i5747M ， pFastBac-C/Gr287*2和 pFastBac-C/GT2S7"重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E. coli DH 10Bac中，pFastBac空質(zhì)粒平行 操作。通過藍(lán)白篩選,確證為白色菌落后,采用堿裂解法相應(yīng)提取轉(zhuǎn)座后的 5acwW-t/( rZB7*7^， Bac附z'J-t/GT257"和BacmW- C/GT2S7"。同法提取E. coli DH10Bac細(xì)菌中未發(fā)生轉(zhuǎn)座的Sac7mW，并用M13(+)/M13(—)為引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證,三者PCR產(chǎn)物應(yīng)分別約在3卯0， 2300， 300bp出現(xiàn)條帶，參見圖6，圖7。 圖6中泳道1.DNA標(biāo)記；泳道2.轉(zhuǎn)染后pFastBac-t/GrL^的粘粒的PCR結(jié)果 (3900 bp);泳道3.轉(zhuǎn)染pFastBac后的粘粒的PCR結(jié)果(2300bp);泳道4.未轉(zhuǎn)染 的粘粒的PCR結(jié)果(300 bp)。圖7中泳道1和6.DNA分子標(biāo)記；泳道2.轉(zhuǎn)染 pFastBac-f/Gr2B7*』后的bacmid的PCR產(chǎn)物(3900 bp);泳道3.轉(zhuǎn)染 pFastBac—[/Gr2S7*7LS后的bacmid的PCR產(chǎn)物(3900 bp);泳道4.轉(zhuǎn)染 pFastBac—f/G72B7*2后的bacmid的PCR產(chǎn)物(3卯0 bp);泳道5.轉(zhuǎn)染 pFastBac-t/Gr2B7"后的bacmid的PCR產(chǎn)物(3900 bp)。實(shí)施例4 5^7mV/-t/Gr2B7*/，Bacw/(i畫t/Gr2B7傘7/S; 5acwW- t/Gr2S7"和13Bacmid-C/GT2B7"轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞^^m^-C/G"S7"采用脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的活力S0細(xì)胞。脂質(zhì)體試 劑Cellfectin Reagent與各種重組粘粒形成復(fù)合物后在6孔板中轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染3 4 d后，細(xì)胞直徑變大變圓并出現(xiàn)細(xì)胞脫落現(xiàn)象,收集含重組病毒的培養(yǎng) 液，500 Xg離心5min ，取上清液，4 。C避光保存。實(shí)施例5在mRNA分子水平驗(yàn)證UGT2B7*1， UGT2B7*71S, UGT2B7*2和 UGT2B7*5的轉(zhuǎn)錄情況用TRIzol (Gibco)試劑分別提取重組病毒感染的Sf9細(xì)胞及正常S 細(xì)胞的 總mRNA，進(jìn)行RT-PCR。 PCR反應(yīng)后，用DNA瓊脂糖電泳分析，重組病毒感染 后的PCR產(chǎn)物在1600 bp有條帶，而正常Sf9細(xì)胞的PCR產(chǎn)物在此位置無條帶， 參見圖8，其中泳道1和7: DNA標(biāo)記；泳道2: UGT2B7*1的PCR產(chǎn)物(1600 bp); 泳道3: UGT2B7*71S的PCR產(chǎn)物(1600 bp);泳道4: UGT2B7*2的PCR產(chǎn)物(1600 bp);泳道5: UGT2B7*5的PCR產(chǎn)物(1600 bp);泳道6:空白Sf9細(xì)胞的PCR產(chǎn) 物。實(shí)施例6構(gòu)建表達(dá)的UGT2B7*1， UGT2B7*71S, UGT2B7*2和UGT2B7*5重組酶 的活性測(cè)定1. 重組酶的免疫學(xué)活性測(cè)定將超聲破碎得到的UGT2B7*1， UGT2B7*71S， UGT2B7*2禾B UGT2B7*5 (帶有 His標(biāo)簽)重組酶按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上， 加入5%脫脂奶粉置4 。C封閉過夜，再加入Mouse anti-His monoclonal antibody — 抗(1: 3 000)，室溫孵育lh。洗滌3次后，加入HRP辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗 鼠二抗(1: 2500)，室溫孵育lh，洗滌3次后，曝光顯色，參見圖9，圖中泳道 1:轉(zhuǎn)染Bacmid-t/Gr257W后的S投細(xì)胞；泳道2:轉(zhuǎn)染Bacmid-t/Gr2B7*77S后 的Sf9細(xì)胞；泳道3:轉(zhuǎn)染Bacmid-W rZ57"后的Sf9細(xì)胞；泳道4:轉(zhuǎn)染 Bacmid-C/Gr^7"后的Sf9細(xì)胞；泳道5:空白Sf9細(xì)胞。2. 重組酶的生物學(xué)活性測(cè)定UGT2B7*1， UGT2B7*71S， UGT2B7*2和UGT2B7*5重組酶的活性是通過作用于 7-HFC(4-tifluoromethylumbelliferyl glucuronide potassium salt)的代話f情況來衡量，結(jié)果見圖10，圖中八.反應(yīng)速率與底物濃度的關(guān)系("=3); B.重組UGT2B7*1, UGT2B7*71S， UGT2B7*2禾口 UGT2B7*5對(duì)7-HFC活性的Lineweaver Burk圖。7-HFC是公認(rèn)的UGT底物，所以以此為工具并用熒光光度法測(cè)定UGT2B7" 及其突變體的活性，文獻(xiàn)報(bào)道HEK293細(xì)胞系表達(dá)的UGT2B7f 1 P對(duì)7-HFC的Km值 為(0.335±0.008) mM.L"和Vmax值為(0.168±0.005) nmol.mm.mg-protein。 而本實(shí)驗(yàn)測(cè)得UGT2B7"重組酶的Km值為(0.331 ±0.018) mM.L"和Vmax值為(2.14±0.04) nmol'min"-mg" protein,可見本系統(tǒng)表達(dá)的UGT2B7^1對(duì)底物的親 和力與在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的相近，而活性更高。與UGT2B7"相比，UGT2B7傘71S對(duì)7-HFC的Km值為(0.260土0.026) mM.1/1， 約是UGT2B7承1的3/4，而Vmax值為(1.36士0.05) nmol.min十mg" protein,約是 UGT2B7承1的3/5， CLint是UGT2B7"的4/5。 UGT2B7"對(duì)7-HFC的Km值為(0.53 ± 0.06) mM.L-1，是UGT2B7承1的1.6倍，而Vmax值為(9.5 ±0.05) nmol.min".mg-1 protein，是UGT2B7^的4.4倍，CLint是UGT2B7"的2.8倍。UGT2B7承5對(duì)7-HFC的 Km值為(0.59土0.05)mM'I^是UGT2B7n的1.8倍，而Vmax值為(7.52±0.28) nmol-min+mg-1 protein,是UGT2B7H的3.5倍，CLint是UGT2B7H的2.0倍。由此可 見，三個(gè)功能性突變體與野生型相比，在對(duì)于7-HFC的代謝中都存在顯著性差異 (p<0.05)， 1^丁287*2和1^丁287*5對(duì)于7-1^(:的0^都要比野生型高，而 UGT2B7471S對(duì)于7-HFC的CLint比野生型低。在這三個(gè)功能性突變體中， UGT2B742對(duì)于7-HFC的CLint值最高，即代謝能力最強(qiáng)，UGT2B7+71S對(duì)于7-HFC 的CLint值最低，代謝能力最弱。當(dāng)人群中等位基因中存在這些突變位點(diǎn)時(shí)，會(huì)影響其底物藥物的代謝，從而 出現(xiàn)個(gè)體藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)的差異。110丁287*1的功能性突變體1;0丁237*718， UGT2B742和UGT2B7+5的構(gòu)建和活性鑒定比較為進(jìn)一步研究UGT2B7對(duì)于其它底 物藥物的差異性奠定基礎(chǔ)。無需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大 限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的實(shí)施方案應(yīng)理解為僅是舉例說明，而非以任何 方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明涉及的序列 <210> 1 <211> 1608 <212>DNA <213>人工序列 <220> <221> CDS <222> (1)…(1608)<223>人二相代謝酶UGT2B7+71S(A71S,211G〉T)的序列l(wèi)ie GinLeu SerLeu ValTip Ala lie LeuAsp Glu Ala SerSer Ala Leu Lyslie Glu Glu AsnPhe He Lys AspThr Phe Ser liePhe Gly Ssr AsnLys Lys ValHePhe Ala GluLeuPhe Asn16<440> 1atg tct魄aaa tgg act tea gta att ttg eta ata caa ctg age 45 MetSerValLys TrpThrSer VallieLeu Leu 1 510 15ttt tgc ttt age tct ggg aat tgt gga aag gtg ctg gtg tgg gca 90 PheCysPheSer SerGlyAsn CysGlyLys Val 1620 25 30gca gaa tac age cat tgg atg aat ata aag aca ate ctg gat gag 135 AlaGluTyrSer HisTrpMet AsnlieLys Thr 3135 40 45ctt att cag aga ggt cat gag gtg act gta ctg gca tct tea get 180 LeulieGinArg GlyHisGlu ValThrVal Leu 4650 55 60tec att ctt ttt gat ccc aac aac tea tec tct ctt aaa att gaa 225 SerlieLeuPhe AspProAsn AsnSerSer Ser 6165 70 75att tat ccc aca tct tta act aaa act gag ttg gag aat ttc ate 270 lieTyrProThr SerLeuThr LysThrGlu Leu 7680 85 90atg caa cag att aag aga tgg tea gac ctt cca aaa gat aca世315 MetGinGinlie LysArgTrp SerAspLeu Pro 9195 100 105tgg tta tat ttt tea caa gta cag gaa ate atg tea ata ttt ggt 360 TrpLeuTyrPhe SerGinVal GinGlulie Met 106 110 115 120gac ata act aga aag ttc tgt aaa gat gta gtt tea aat aag aaa 405 AsplieThrArg LysPheCys LysAspVal Val 121 125 130 135ttt atg aaa aaa gta caa gag tea aga ttt gac gtc att ttt gca 450 PheMetLys LysValGinGlu SerArgPhe Asp 136 140 145 150gat get att ttt ccc tgt agt gag ctg ctg get gag eta ttt aac 495 AspAlaHe PheProCysSer GuLeuLeu Ala151 155 160 165ata ccc ttt魄tac agt etc age ttc tct cct ggc tac act ttt 540lieProPhe ValTyrSerLeu SerPheSerPro GlyTyrThr Phe 166 170 175 180gaa aag cat agt gga gga ttt att ttc cct cct tec tac gta cct 585GluLysHis SerGlyGlyPhe liePheProPro SerTyrVal Pro 181 185 190 195gtt gtt atg tea gaa Ua act gat caa atg act ttc atg gag agg 630Val Val Met Ser Glu Leu Thr Asp Gin Met Thr Phe Met Glu Arg 196 200205 210gta aaa aat atg ate tat gtg ctt tac ttt gac ttt tgg ttc gaa 675ValLysAsn MetlieTyrVal LeuTyrPheAsp PheTipPhe Glu 211 215220 225ata ttt gac atg aag aag tgg gat cag ttt tat agt gaa gtt eta 720liePheAsp MetLysLysTip AspGinPheTyr SerGluVal Leu 226 230235 240gga aga ccc act aca tta tct gag aca atg ggg aaa get gac gta 765Gly Arg Pro Thr Thr Leu Ser Glu Thr Met Gly Lys Ala Asp Val 241 245 250 255tgg ctt att cga aac tec tgg aat ttt cag ttt cca cat cca etc 810TrpLeu lieArgAsnSerTrp AsnPheGinPhe ProHisPro Leu 256 260 265 270tta cca aat gtt gat世gtt gga gga etc cac tgc aaa cct gcc 855Leu Pro Asn Val Asp Phe Val Gly Gly Leu His Cys Lys Pro Ala 271 275 280 285aaa ccc ctg cct aag gaa atg gaa gac ttt gta cag age tct gga 900LysPro LeuProLysGluMet GluAspPheVal GinSerSer Gly 286 2卯295 300gaa aat ggt gtt gtg gtg ttt tct ctg ggg tea atg gtc agt aac 945GluAsn GlyValValVal PheSerLeuGlySer MetValSer Asn 301 305 310 315atg aca gaa gaa agg gcc aac gta att gca tea gcc ctg gcc cag 990MetThr GluGluArgAla AsnVallieAlaSer AlaLeuAla Gin 316 320 325 330ate cca caa aag gtt ctg tgg aga ttt gat ggg aat aaa cca gat 1035liePro GinLysValLeu TrpArgPheAspGly AsnLysPro Asp 331 335 340 345acc tta ggt etc aat act egg etc tac aag tgg ata ccc cag aat 1080Thr Leu Gly Leu Asn Thr Arg Leu Tyr Lys Trp lie Pro Gin Asn 346 350 355 360gac ctt eta ggt cat cca aag acc aga get ttt ata act cat ggt 1125AspLeu LeuGlyHisPro LysThrArgAlaPhe lieThrHis Gly 361 365 370 375gga gcc aat ggc ate tac gag gca'ate tac cat ggg ate cct atg 1170GlyAla AsnGlyTieTyr GluAlalieTyrHis GlyliePro Met 376 380 385 3%gtg ggg att cca ttg ttt gcc gat caa cct gat aac att get cac 1215ValGly lieProLeuPhe AlaAspGinProAsp AsnlieAla His 391 395 400 405atg aag gcc agg gga gca get gtt aga魄gac ttc aac aca atg 1260MetLys AlaArgGlyAla AlaValArgValAsp PheAsnThr Met 楊410415 420tcg agt aca gac ttg ctg aat gca ttg aag aga gta att aat gat 1305SerSer ThrAspLeuLeu AsnAlaLeuLysArg VallieAsn Asp 421425430 435cct tea tat aaa gag aat gtt atg aaa tta tea aga att caa cat 1350ProSer TyrLysGluAsn ValMetLysLeuSer ArglieGin His 436440445 450gat caa cca gtg aag ccc ctg gat cga gca gtc ttc tgg att gaa 1395AspGin ProValLysPro LeuAspArgAlaVal PheTrplie Glu 451 455 460 465ttt gtc atg cgc cac aaa gga get aaa cac ctt egg gtt gca gcc 1440PheVal MetArgHisLys GlyAlaLysHisLeu ArgValAla Ala 466470475 480cac gac etc acc tgg ttc cag tac cac tct ttg gat gtg att ggg 1485HisAsp LeuThrTrpPhe GinTyrHisSerLeu AspVal Tie Gly 481485 490 495ttc ctg ctg gtc tgt gtg gca act gtg ata ttt ate gtc aca aaa 1530PheLeu LeuValCysVal AlaThrValHePhe lieValThr Lys 496500 505 510tgt tgt ctg ttt tgt ttc tgg aag ttt get aga aaa gca aag aag 1580CysCys LeuPheCysPhe TrpLysPheAlaArgLysAlaLys Lys511 515 520 525gga aaa aat gat cat cat cat cat cat cat tag 1608GlyLys AsnAspHisHis HisHisHis His526530 535 539<210> 2 <211> 1608 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> CDS <222> (1)...(1608)<223>人二相代謝酶UGT2B7*2(H268Y， 802 OT)的序列 <440> 2atg tct gtg aaa tgg act tea gta att ttg eta ata caa ctg age 45MetSerValLys TrpThrSer ValHeLeuLeulie GinLeu Ser 1 510 15ttt tgc ttt age tct ggg aat tgt gga aag gtg ctg gtg tgg gca 90Phe Cys Phe Ser Ser Gly Asn Cys Gly Lys Val Leu Val Trp Ala 1620 25 30gca gaa tac age cat tgg atg aat ata aag aca ate ctg gat gag 135 AlaGluTyrSer HisTipMet Asn lie 31 35 40 45ctt att cag aga ggt cat gag gtg act gta ctg gca tct tea get 180 LeuHeGinArg GlyHisGlu Val Thr 4650 55 60tec att ctt ttt gat ccc aac aac tea tec get ctt aaa att gaa 225 SerlieLeuPhe AspProAsn Asn Ser 61 65 70 75att tat ccc aca tct tta act aaa act gag ttg gag aat ttc ate 270 lieTyrProThr SerLeuThr Lys Thr 7680 85 90atg caa cag att aag aga tgg tea gac ctt cca aaa gat aca ttt 315 Met Gin Gin lie Lys Arg Tip Ser Asp 9195 100 105tgg tta tat ttt tea caa gta cag gaa ate atg tea ata ttt ggt 360 TipLeuTyrPhe SerGinVal Gin Glu 106 110 115 120gac ata act aga aag ttc tgt aaa gat gta gtt tea aat aag aaa 405 AsplieThrArg LysPheCys Lys Asp 121 125 130 135ttt atg aaa aaa gta caa gag tea aga ttt gac gtc att ttt gca 450 PheMetLys LysValGinGlu Ser Arg 136 140 145 150gat get att ttt ccc tgt agt gag ctg ctg get gag eta ttt aac 495 AspAlalie PheProCysSer Glu Leu 151 155 160 165ata ccc ttt gtg tac agt etc age ttc tct cct ggc tac act ttt 540 lieProPhe ValTyrSerLeu Ser Phe 166 170 175 180gaa aag cat agt gga gga ttt att ttc cct cct tec tac gta cct 585 GluLysHis SerGlyGlyPhe He Phe 181 185 l卯 195gtt gtt atg tea gaa tta act gat caa atg act ttc atg gag agg 630 ValValMet SerGluLeuThr Asp Gin 196 200205 210gta aaa aat atg ate tat gtg ctt tac ttt gac ttt tgg ttc gaa 675 ValLysAsn MetlieTyrVal Leu Tyr 211 215220 225ata ttt gac atg aag aag tgg gat cag ttt tat agt gaa gtt eta 720 liePheAsp MetLysLysTrp Asp Gin 226 230235 240gga aga ccc act aca tta tct gag aca atg ggg aaa get gac gta 765 GlyArgPro ThrThrLeuSer Glu Thr 241 245 250 255LysThrlie LeuAsp GluValLeuAla SerSer AlaSerAlaLeu Lyslie GluGluLeuGlu AsnPhe lieLeuProLys AspThr PhelieMetSer liePhe GlyValValSer AsnLys LysPhe AspValliePhe AlaLeu AlaGluLeuPhe AsnSerPro GlyTyrThr PheProPro SerTyrVal ProMetThr PheMetGlu ArgPheAsp PheTrpPhe GluPheTyr SerGluVal LeuMetGly LysAlaAsp Valtgg ctt att cga aac tec tgg aat ttt cag ttt cca tat cca etc 810TipLeu HeArgAsnSerTip AsnPheGinPhe Pro丁yrPro Leu 256 260 265 270tta cca aat gtt gat ttt gtt gga gga etc cac tgc aaa cct gcc 855Leu Pro Asn Val Asp Phe Val Gly Gly Leu His Cys Lys Pro Ala 271 275 280 285aaa ccc ctg cct aag gaa atg gaa gac ttt gta cag age tct gga 900Lys Pro Leu Pro Lys Glu Met Glu Asp Phe Val Gin Ser Ser Gly 286 2卯 295 300gaa aat ggt gtt gtg gtg ttt tct ctg ggg tea atg gtc agt aac 945GluAsn GlyValValVal PheSerLeuGlySer MetValSer Asn 301 305 310 315atg aca gaa gaa agg gcc aac gta att gca tea gcc ctg gcc cag 990MetThr GluGluArgAla AsnValHeAlaSer AlaLeuAla Gin 316 320 325 330ate cca caa aag gtt ctg tgg aga ttt gat ggg aat aaa cca gat 1035liePro GinLysValLeu TipArgPheAspGly AsnLysPro Asp 331 335 340 345acc tta ggt etc aat act egg etc tac aag tgg ata ccc cag aat 1080Thr Leu Gly Leu Asn Thr Arg Leu Tyr Lys Trp lie Pro Gin Asn 346 350 355 360gac ctt eta ggt cat cca aag acc aga get ttt ata act cat ggt 1125AspLeu LeuGlyHisPro LysThrArgAlaPhe lieThrHis Gly 361 365 370 375gga gcc aat ggc ate tac gag gca ate tac cat ggg ate cct atg 1170GlyAla AsnGlyHeTyr GluAlaHeTyrHis GlyHePro Met 376 380 385 390gtg ggg att cca ttg ttt gcc gat caa cct gat aac att get cac 1215ValGly lieProLeuPhe AlaAspGinProAsp AsnlieAla His 391 395 400 405atg aag gcc agg gga gca get gtt aga gtg gac ttc aac aca atg 1260Met Lys Ala Arg Gly Ala Ala VaJ Arg Val Asp Phe Asn Thr Met 406410415 420teg agt aca gac ttg ctg aat gca ttg aag aga gta att aat gat 1305Ser Ser Thr Asp Leu Leu Asn Ala Leu Lys Arg Val lie Asn Asp 421425430 435cct tea tat aaa gag aat gtt atg aaa tta tea aga att caa cat 1350ProSer TyrLysGluAsn ValMetLysLeuSer ArglieGin His 436440445 450gat caa cca gtg aag ccc ctg gat cga gca gtc ttc tgg att gaa 1395AspGin ProValLysPro LeuAspArgAlaVal PheTrplie Glu 451455460 465ttt gtc atg cgc cac aaa gga get aaa cac ctt egg gtt gca gcc 1440Phe Val Met Arg His Lys Gly Ala Lys His Leu Arg Val Ala Ala 466470475 480cac gac etc acc tgg ttc cag tac cac tct ttg gat gtg att ggg 1485HisAsp LeuThrTrpPhe GinTyrHisSerLeu AspVallie Gly 481485 490 495ttc ctg ctg gtc tgt gtg gca act gtg ata ttt ate gtc aca aaa 1530PheLeu LeuValCysVal AlaThrValliePhe lieValThr Lys 496500 505 510tgt tgt ctg ttt tgt ttc tgg aag ttt get aga aaa gca aag aag 1580CysCys LeuPheCysPhe TrpLysPheAlaArgLysAlaLys Lys511 515 520 525gga aaa aat gat cat cat cat cat cat cat tag 1608GlyLys AsnAspHisHis HisHisHis His526530 535 539<210>3 <211> 1608 <212>DNA <213>人工序列 <220> <221> CDS <222> (1)...(1608)<223>人二相代謝酶UGT2B7+5(D398N,1192G〉A(chǔ))的序列 <440> 3atg tct gtg aaa tgg act tea gta att ttg eta ata caa ctg age 45MetSerValLys TrpThrSer VallieLeuLeulie GinLeu Ser 1 5 10 15ttt tgc ttt age tct ggg aat tgt gga aag魄ctg gtg tgg gca 90Phe Cys Phe Ser Ser Gly Asn Cys Gly Lys Val Leu Val Trp Ala 1620 25 30gca gaa tac age cat敏atg aat ata aag aca ate ctg gat gag 135AlaGluTyrSer HisTrpMet AsnlieLysThrlie LeuAsp Glu 3135 40 45ctt att cag aga ggt cat gag魄act gta ctg gca tct tea get 180LeulieGinArg GlyHisGlu ValThrValLeuAla SerSer Ala 4650 55 60tec att ctt ttt gat ccc aac aac tea tec get ctt aaa att gaa 225SerHeLeuPhe AspProAsn AsnSerSerAaLeu LysIe Gu 6165 70 75att tat ccc aca tct tta act aaa act gag ttg gag aat ttc ate 270lieTyrProThr SerLeuThr LysThrGluLeuGlu AsnPhe He 7680 85 90atg caa cag att aag aga tgg tea gac ctt cca aaa gat aca ttt 315Met Gin Gin lie Lys Arg Trp Ser Asp Leu Pro Lys Asp Thr Phe 9195 100 105tgg tta tat ttt tea caa gta cag gaa ate atg tea ata ttt ggt 360TrpLeuTyrPhe SerGinVal GinGlulieMetSer liePhe Gly 106 110 115 120gac ata act aga aag ttc tgt aaa gat gta gtt tea aat aag aaa 405AsplieThrArg LysPheCys LysAspValValSer AsnLys Lys 121 125 130 135ttt atg aaa aaa gta caa gag tea aga ttt gac gtc att ttt gca 450PheMetLys LysValGinGlu SerArgPhe AspValliePhe Ala 136 140 145 150gat get att ttt ccc tgt agt gag ctg ctg get gag eta ttt aac 495Asp Ala lie Phe Pro Cys Ser Glu Leu Leu Ala Glu Leu Phe Asn 151 155 160 165ata ccc ttt gtg tac agt etc age ttc tct cct ggc tac act ttt 540lieProPhe ValTyrSerLeu SerPheSerPro GlyTyrThr Phe 166 170 175 180gaa aag cat agt gga gga ttt att ttc cct cct tec tac gta cct 585GluLysHis SerGlyGlyPhe liePheProPro SerTyrVal Pro 181 185 190 195gtt gtt atg tea gaa tta act gat caa atg act ttc atg gag agg 630Val Val Met Ser Glu Leu Thr Asp Gin Met Thr Phe Met Glu Arg 196 200205 210gta aaa aat atg ate tat gtg ctt tac ttt gac ttt tgg ttc gaa 675ValLysAsn MetHeTyrVal LeuTyrPheAsp PheTipPhe Glu 211 215220 225ata ttt gac atg aag aag tgg gat cag ttt tat agt gaa gtt eta 720HePheAsp MetLysLysTrp AspGinPheTyr SerGluVal Leu 226 230235 240gga aga ccc act aca tta tct gag aca atg ggg aaa get gac gta 765Gly Arg Pro Thr Thr Leu Ser Glu Thr Met Gly Lys Ala Asp Val 241 245 250 255tgg ctt att cga aac tec tgg aat ttt cag ttt cca cat cca etc 810TrpLeu lieArgAsnSerTrp AsnPheGinPhe ProHisPro Leu 256 260 265 270tta cca aat gtt gat ttt gtt gga gga etc cac tgc aaa cct gcc 855Leu Pro Asn Val Asp Phe Val Gly Gly Leu His Cys Lys Pro Ala 271 275 280 285aaa ccc ctg cct aag gaa atg gaa gac ttt gta cag age tct gga 900Lys Pro Leu Pro Lys Glu Met Glu Asp Phe Val Gin Ser Ser Gly 286 2卯 295 300gaa aat ggt gtt gtg gtg ttt tot ctg ggg tea atg gtc agt aac 945GluAsn GlyValValVal PheSerLeuGlySer MetValSer Asn 301 305 310 315atg aca gaa gaa agg gcc aac gta att gca tea gcc ctg gcc cag 990MetThr GluGluArgAla AsnVallieAlaSer AlaLeuAla Gin 316 320 325 330ate cca caa aag gtt ctg tgg aga ttt gat ggg aat aaa cca gat 1035He Pro Gin Lys Val Leu Trp Arg Phe Asp Gly Asn Lys Pro Asp 331 335 340 345acc tta ggt etc aat act egg etc tac aag tgg ata ccc cag aat 1080ThrLeu GlyLeuAsnThr ArgLeuTyr Lys346 350 355 360gac ctt eta ggt cat cca aag acc aga get ttt ata act cat ggt 1125AspLeu LeuGlyHisPro LysThrArg Ala361 365 370 375gga gcc aat ggc ate tac gag gca ate tac cat ggg ate cct atg 1170 GlyAla AsnGlylieTyr GluAlalie Tyr 376 380 385 390gtg ggg att cca ttg ttt gcc aat caa cct gat aac att get cac 1215ValGly lieProLeuPhe AlaAsnGin Pro391 395 400 405atg aag gcc agg gga gca get gtt aga gtg gac ttc aac aca atg 1260 MetLys AlaArgGlyAla AlaValArg Val 406410415 420tcg agt aca gac ttg ctg aat gca ttg aag aga gta att aat gat 1305 SerSer ThrAspLeuLeu AsnAla Leu 421425430 435cct tea tat aaa gag aat gtt atg aaa tta tea aga att caa cat 1350 ProSer TyrLysGluAsn ValMet Lys 436440445 450gat caa cca gtg aag ccc ctg gat cga gca gtc ttc tgg att gaa 1395 Asp Gin Pro Val Lys Pro Leu Asp Arg 451455460 465ttt gtc atg cgc cac aaa gga get aaa cac ctt egg gtt gca gcc 1440 PheVal MetArgHisLys GlyAla Lys 466470475 480cac gac etc acc tgg ttc cag tac cac tct ttg gat gtg att ggg 1485 His Asp Leu Thr Tip Phe Gin Tyr His 481485 柳 495ttc ctg ctg gtc tgt gtg gca act gtg ata ttt ate gtc aca aaa 1530 PheLeu LeuValCysVal AlaThr Val 496500 505 510tgt tgt ctg ttt tgt ttc tgg aag ttt get aga aaa gca aag aag 1580 CysCys LeuPheCysPhe TrpLys Phe 511515 520 525 gga aaa aat gat cat cat cat cat cat cat tag 1608 GlyLys AsnAspHisHis HisHis His 526530 535 539Trp lieProGin AsnPhe lieThrHis GlyHis GlyliePro MetAsp AsnlieAla HisAsp PheAsnThr MetLysArg VallieAsn AspLeuSer ArglieGin HisAlaVal PheTrplie GluHisLeu ArgValAla AlaSerLeu AspValHe GlyliePhe lieValThr LysAlaArgLysAlaLys LysHis<210> 4 <211> 1608 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> CDS<222>(1)...(1608)<223>人二相代謝酶UGT2B7的序列 <440> 4atg tct gtg aaa tgg act tea gta att ttg eta ata caa ctg age 45 MetSerValLys TrpThrSer Val He 1 510 15ttt tgc ttt age tct ggg aat tgt gga aag gtg ctg gtg tgg gca 90 PheCysPheSer SerGlyAsn Cys Gly 16 20 25 30gca gaa tac age cat tgg atg aat ata aag aca ate ctg gat gag 135 AlaGluTyrSer HisTrpMet Asn lie 31 35 40 45ctt att cag aga ggt cat gag gtg act gta ctg gca tct tea get 180 Leu lie Gin Arg Gly His Glu Val Thr 46 50 55 60tec att ctt ttt gat ccc aac aac tea tec get ctt aaa att gaa 225 SerlieLeuPhe AspProAsn Asn Ser 61 65 70 75att tat ccc aca tct tta act aaa act gag ttg gag aat ttc ate 270 lieTyrProThr SerLeuThr Lys Thr 76 80 85 卯a(chǎn)tg caa cag att aag aga tgg tea gac ctt cca aaa gat aca ttt 315 Met Gin Gin lie Lys Arg Trp Ser Asp 91 95 謂105tgg tta tat ttt tea caa gta cag gaa ate atg tea ata ttt ggt 360 TrpLeuTyrPhe SerGinVal Gin Glu 106 110 115 120gac ata act aga aag ttc tgt aaa gat gta gtt tea aat aag aaa 405 AsplieThrArg LysPheCys Lys Asp 121 125 130 135ttt atg aaa aaa gta caa gag tea aga ttt gac gtc att ttt gca 450 PheMetLys LysValGinGlu Ser Arg 136 140 145 150gat get att ttt ccc tgt agt gag ctg ctg get gag eta ttt aac 495 AspAlalie PheProCysSer Glu Leu 151 155 160 165ata ccc ttt gtg tac agt etc age ttc tct cct ggc tac act ttt 540 HeProPhe ValTyrSerLeu Ser Phe 166 170 175 180gaa aag cat agt gga gga ttt att ttc cct cct tec tac gta cct 585 GluLysHis SerGlyGlyPhe lie Phe 181 185l卯 195gtt gtt atg tea gaa tta act gat caa atg act ttc atg gag agg 630 ValValMet SerGluLeuThr Asp Gin 196 200205 210LeuLeulie GinLeu SerLysValLeu ValTrp AlaLysThrlie LeuAsp GluValLeuAla SerSer AlaSerAlaLeu Lyslie GluGluLeuGlu AsnPhe lieLeuProLys AspThr PheTieMetSer TiePhe GlyValValSer AsnLys LysPhe AspValHePhe AlaLeu AlaGluLeuPhe AsnSerPro GlyTyrThr PheProPro SerTyrVal ProMetThr PheMetGlu Arg24gta aaa aat atg ate tat gtg ctt tac ttt gac ttt tgg ttc gaa 675ValLysAsn MetHeTyrVal LeuTyrPheAsp PheTipPhe Glu 211 215220 225ata ttt gac atg aag aag tgg gat cag ttt tat agt gaa gtt eta 720liePheAsp MetLysLysTrp AspGinPheTyr SerGluVal Leu 226 230235 240gga aga ccc act aca tta tct gag aca atg ggg aaa get gac gta 765Gly Arg Pro Thr Thr Leu Ser Glu Thr Met Gly Lys Ala Asp Val 241 245 250 255tgg ctt att cga aac tec tgg aat ttt cag ttt cca cat cca etc 810TrpLeu lieArgAsnSerTrp AsnPheGinPhe ProHisPro Leu 256 260 265 270tta cca aat gtt gat ttt gtt gga gga etc cac tgc aaa cct gcc 855Leu Pro Asn Val Asp Phe Val Gly Gly Leu His Cys Lys Pro Ala 271 275 280 285aaa ccc ctg cct aag gaa atg gaa gac ttt gta cag age tct gga 900LysPro LeuProLysGluMet GluAspPheVal GinSerSer Gly 286 290 295 300gaa aat ggt gtt gtg gtg ttt tct ctg ggg tea atg gtc agt aac 945GluAsn GlyValValVal PheSerLeuGlySer MetValSer Asn 301 305 310 315atg aca gaa gaa agg gcc aac gta att gca tea gcc ctg gcc cag 990MetThr GluGluArgAla AsnValHeAlaSer AlaLeuAla Gin 316 320 325 330ate cca caa aag gtt ctg tgg aga ttt gat ggg aat aaa cca gat 1035liePro GinLysValLeu TrpArgPheAspGly AsnLysPro Asp 331 335 340 345acc tta ggt etc aat act egg etc tac aag tgg ata ccc cag aat 1080ThrLeu GlyLeuAsnThr ArgLeuTyrLysTrp lieProGin Asn 346 350 355 360gac ctt eta ggt cat cca aag acc aga get ttt ata act cat ggt 1125AspLeu LeuGlyHisPro LysThrArgAlaPhe lieThrHis Gly 361 365 370 375gga gcc aat ggc ate tac gag gca ate tac cat ggg ate cct atg 1170GlyAla AsnGlyHeTyr GluAlaHeTyrHis GlyliePro Met 376 380 385 390gtg ggg att cca ttg ttt gcc gat caa cct gat aac att get cac 1215ValGly lieProLeuPhe AlaAspGinProAsp AsnlieAla His 391 395 400 405atg aag gcc agg gga gca get gtt aga gtg gac ttc aac aca atg 1260Met Lys Ala Arg Gly Ala Ala Val Arg Val Asp Phe Asn Thr Met 406 410415 420tcg agt aca gac ttg ctg aat gca ttg aag aga gta att aat gat 1305Ser Ser Thr Asp Leu Leu Asn Ala Leu Lys Arg Val lie Asn Asp 421 425430 435cct tea tat aaa gag aat gtt atg aaa tta tea aga att caa cat 13 5025ProSer TyrLysGluAsn ValMetLysLeuSer ArglieGin His 436 440445 450gat caa cca gtg aag ccc ctg gat cga gca gtc ttc tgg att gaa 1395Asp Gin Pro Val Lys Pro Leu Asp Arg Ala Val Phe Tip lie Glu 451 455460 465ttt gtc atg cgc cac aaa gga get aaa cac ctt egg gtt gca gec 1440Phe Val Met Arg His Lys Gly Ala Lys His Leu Arg Val Ala Ala 466 470475 480cac gac etc acc tgg ttc cag tac cac tct ttg gat gtg att ggg 1485His Asp Leu Thr Trp Phe Gin Tyr His Ser Leu Asp Val He Gly 481 485 490 495ttc ctg ctg gtc tgt gtg gca act gtg ata ttt ate gtc aca aaa 1530PheLeu LeuValCysVal AlaThrValliePhe lieValThr Lys 496 500 505 510tgt tgt ctg ttt tgt ttc tgg aag ttt get aga aaa gca aag aag 1580 CysCys LeuPheCysPhe TrpLys Phe 511515 520 525gga aaa aat gat cat cat cat cat cat cat tag 1608 GlyLys AsnAspHisHis HisHis His 526 530 535 539AlaArgLysAlaLys LysHis<210> 5 <211>26 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> CDS<223>擴(kuò)增人二相代謝酶UGT2B7野生型基因所用的上游引物序列 <440> 5gtc gac att gca cca gga tgt ctg tg<210> 6 <211> 28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <221>CDS<223>擴(kuò)增人二相代謝酶UGT2B7野生型基因所用的下游引物序列 <440> 6etc gag ggt ttt cca get tea aat etc a<210>7 <211>21 <212>DNA <213>人工序列<220> <221> CDS<223>從人二相代謝酶UGT2B7野生型基因定點(diǎn)突變?yōu)閁GT2B7*71S(A71S，211G打)所用的上游引物序列<440> 7aac tea tcc (t)ct ctt aaa att<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221> CDS<223>從人二相代謝酶UGT2B7野生型基因定點(diǎn)突變?yōu)閁GT2B7f71S(A71S，211G玎)所用的下游引物序列<440> 8gtt ggg atc aaa aag aat gga ag<210>9 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <221> CD<223>從人二相代謝酶UGT2B7野生型基因定點(diǎn)突變?yōu)?^丁237*2(1^268丫,8020丁)所用的上游引物序列<440> 9cag ttt cc(t) (c)at cca etc tta cc<210> 10 <211>31 <212>DNA <213>人工序列 <220> <221> CDS<223>從人二相代謝酶UGT2B7野生型基因定點(diǎn)突變?yōu)閁GT2B7t2(H268Y,802OT)所用的下游引物序列<440> 10aaa att cca gga gtt tgg aat aag cca tac g<210> 11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<223>從人二相代謝酶UGT2B7野生型基因定點(diǎn)突變?yōu)閁GT2B7*5(D398N，1192G〉A(chǔ))所用的上游引物序列<440> 11cca ttg ttt gcc (a)at caa cct gat aac att gc<210> 12<2U>33<212>DNA<213>人工序列<220><221> CDS<223>從人二相代謝酶UGT2B7野生型基因定點(diǎn)突變?yōu)閁GT2B745(D398N,1192G〉A(chǔ))所用的卜游引物序列<440> 12aat ccc cac cat agg gat ccc atg gta gat tgc
權(quán)利要求
1.一種人二相代謝酶的三個(gè)功能性突變體重組酶，其特征是所述三個(gè)功能性突變體重組酶分別是UGT2B7*71S、UGT2B7*2和UGT2B7*5，其中SEQ IDNO1為UGT2B7*71S的核苷酸序列和氨基酸序列，SEQ ID NO2為UGT2B7*2的核苷酸序列和氨基酸序列，SEQ ID NO3為UGT2B7*5的核苷酸序列和氨基酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人二相代謝酶的三個(gè)功能性突變體重組酶的構(gòu)建方 法，是在引物中導(dǎo)入突變位點(diǎn)，以帶有人UGT2B7的野生型基因的質(zhì)粒為模板， 經(jīng)PCR反應(yīng)、磷酸化、自身連接和轉(zhuǎn)化，分別合成帶有UGT2B7的三個(gè)功能性突 變體重組酶基因的質(zhì)粒，其特征是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1) 野生型基因的獲得按照GENEBANK中的人UGT2B7基因合成引物，上下游引物分別引入&/I 和lol位點(diǎn)和保護(hù)堿基，以人肝組織為模板，通過TRIZOL試劑提取總RNA， 通過RT-PCR，并在終止密碼子前添加6-His標(biāo)簽，得到PCR產(chǎn)物后，與pGEM 載體相連接獲得pGEM-UGT2B7重組質(zhì)粒，并用pGEM通用引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行 測(cè)序，經(jīng)過DNASTAR軟件與genebank中NM 001074序列進(jìn)行比對(duì)，證明已獲 得序列完全正確的UGT2B7的基因克隆，SEQTDNO:4為UGT2B7的核苷酸序列 和氨基酸序列；(2) 野生型質(zhì)粒模板的提取將己測(cè)序驗(yàn)證正確的pGEM-UGT2B7重組質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中得重組菌落，將重組菌落在瓊脂培養(yǎng)板上進(jìn)行劃 板，然后挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落，接種至2 ml ~ 5 ml含有l(wèi)OOpg/ml氨,青霉 素的LB培養(yǎng)液中，37 °C振搖過夜，取1.5 ml培養(yǎng)物倒入1.5 ml離心管中，12 000g 離心15秒，棄上清回收菌體，根據(jù)試劑說明書加入100pl溶液I，充分懸浮細(xì)胞， 加入100pl溶液II，上下顛倒5 6次，使細(xì)菌裂解，室溫放置l分鐘，加入430 pl溶液III，顛倒5 10次，使之充分中和，室溫放置2分鐘，12000 rpm高速離 心2 5分鐘，吸取上清至套放于2ml收集管的UNIQ-10柱中，8000 rpm室溫離 心l分鐘，棄廢液，將UNIQ-10柱放回2ml收集管中，吸取500 pl洗滌溶液到 UNIQ-10柱，10000 rpm室溫離心30秒，重復(fù)一次，棄廢液，將UMQ-10柱放 回2ml收集管中，10000 rpm室溫離心15秒，棄廢液，將UNIQ-10柱放入一干凈的1.5 ml離心管中，加50 jia溶解液至膜中央，室溫放置2分鐘，10000 rpm 室溫離心1分鐘；(3)引物的合成針對(duì)人藥物二相代謝酶UGT2B7的基因合成了3對(duì)引物， 每對(duì)引物含有突變位點(diǎn)，合成后溶于滅菌水中，-2(TC保存?zhèn)溆?，突變位點(diǎn)UGT2B7*71S(A71S,211G>T)UGT2B7*2(H268Y,802OT)UGT2B7*5(D398N，1192G>A)引物SEQ ID NO.7 : aac tea tec向ct ctt aaa attSEQ ID NO.8: gtt ggg ate aaa aag aat gga agSEQ ID NO.9: cag ttt c柳f"at cca etc tta ccSEQ ID NO. 10: aaa att cca gga gtt tgg aat aag ccatac gSEQ ID NO. 11: cca ttg ttt gec問at caa cct gat aac att gcSEQ ID NO. 12: aat ccc cac cat agg gat ccc atg gta gat tgc(4) 利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，引入突變位點(diǎn)，然后經(jīng)過磷酸化、自身連接 和轉(zhuǎn)化等步驟后分別獲得人藥物二相代謝酶UGT2B7的突變基因^( 72^7*77^， C/GT2B7"和t/G徴7"，PCR反應(yīng)體系10X Pyrobest Buffer 5 ;il、 dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 4 |il、 Primer 1(20 jimol/L) 1 (il、 Primer 2(20 |imol/L) 1 pl、 Template 0.01 1 ng、 Pyrobest DNAPolymerase(5 u/pl) 0.25 pl、 ddH20 up to 50 jjI，反應(yīng)條件 °C 30秒、55~60 °C 30秒、72 °C 5分鐘、1 3步循環(huán)30次， Hold on 8 °C;(5) 將人藥物二相代謝酶UGT2B7的突變基因^7(77757*7^， f/G7757*2 和C/Gr2B7"與pFastBac載體相連接后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞 中發(fā)生轉(zhuǎn)座作用，獲得重組粘粒Bacmid-C/Gr2B7f7W， Bacmid-C/GT2￡7*2和 Bacmid-C/GT2B7*5;(6 ) 將重組粘粒 Bacmid-C/C :T2B7傘77S ， Bacmid-t/GT2B7*2 和 Bacmid-C/G72S7"分別感染昆蟲細(xì)胞，從而獲得各自的第一代病毒液，然后擴(kuò)增 病毒液使其病毒滴度至107 108pfU/ml，從而表達(dá)重組酶，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化， 在72小時(shí)后收集細(xì)胞，超聲破碎獲得三個(gè)功能性突變體重組酶UGT2B7*71S， UGT2B7*2和UGT2B7*5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人二相代謝酶的三個(gè)功能性突變體重組酶的構(gòu)建方法，其特征是所述宿主選用大腸桿菌、酵母或桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞，優(yōu)選Sf9或Sf21細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的人二相代謝酶的三個(gè)功能性突變體重組酶在篩選藥 物中應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的人二相代謝酶的三個(gè)功能性突變體重組酶在預(yù)測(cè)個(gè) 體化用藥可能產(chǎn)生的藥物副作用、從而指導(dǎo)合理用藥中應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的人二相代謝酶的三個(gè)功能性突變體重組酶在分子水 平研究酶與底物藥物的構(gòu)效關(guān)系中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供人二相代謝酶的三個(gè)功能性突變體重組酶UGT2B7*71S，UGT2B7*2和UGT2B7*5。是在引物中導(dǎo)入突變位點(diǎn)，以帶有人UGT2B7的野生型基因的質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)、磷酸化、自身連接和轉(zhuǎn)化，分別合成帶有UGT2B7的三個(gè)功能性突變體重組酶基因的質(zhì)粒。本發(fā)明提供的功能性突變體重組酶在昆蟲細(xì)胞中高水平表達(dá)，周期較短，桿狀病毒有嚴(yán)格的宿主范圍，無人體病原性，操作安全，提高重組效率，節(jié)省時(shí)間，構(gòu)建和表達(dá)方法簡(jiǎn)單、有效，并且容易放大進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)?？稍诤Y選藥物中應(yīng)用，可預(yù)測(cè)個(gè)體化用藥可能產(chǎn)生的藥物副作用，從而指導(dǎo)合理用藥，同時(shí)可在分子水平研究酶與底物藥物的構(gòu)效關(guān)系中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/54GK101323846SQ20081006163
公開日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2008年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日
發(fā)明者蘇 曾, 袁玲敏, 靜 陳 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)