專利名稱：中華蜜蜂mrjp1表達(dá)產(chǎn)物酶解制備抗高血壓多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中華蜜蜂MRJP1表達(dá)產(chǎn)物酶解制備抗高血壓多肽的方法。
背景技術(shù)：
血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽最早是Ferreira(1965)從美洲茅頭腹蛇 (Bothrops jararaca)蛇毒中發(fā)現(xiàn)的，Oshima等又從明膠的細(xì)菌膠原酶消化液中尋 找到ACE抑制肽，而Cushman等則基于ACE鍵合部位假說(shuō)模型開發(fā)出第一代 ACEI抗高血壓藥Captopril，在臨床治療高血壓中獲得巨大成功。隨后又開發(fā)出 第二、三代化學(xué)合成的ACE抑制劑，如Lisinopril、 Enalapril、 Forsinopril等， 這些降壓藥多數(shù)是短鏈肽的類似物。合成ACE抑制肽具有藥效快而強(qiáng)的特點(diǎn)， 但易損害腎功能，有一定副作用。因此，從天然食物蛋白中分離制備降血壓多 肽的研究得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視，采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)包含降血壓多肽 片段的蛋白，再經(jīng)酶解制備降血壓多肽是一條十分誘人的途徑。
蜂王漿具有多種醫(yī)療保健和生物學(xué)功能。Takeshi (2001)研究報(bào)道王漿中的 蛋白成分有強(qiáng)的抗氧化能力和清除活性氧的能力;Iwao(2003)報(bào)道王漿主蛋白之 一——MRJP3在體內(nèi)和體外具有潛在的調(diào)節(jié)免疫功能；Kamakura(2001)報(bào)道鮮 王漿對(duì)小鼠有抗疲勞作用。Toshiro (2002)報(bào)道王漿蛋白胃腸酶酶解產(chǎn)物生物活 性多肽及其在SHR中的抗高血壓作用。Katsu (2004)報(bào)道經(jīng)蛋白酶處理的王漿 (ProRJ)和從中獲得的多肽具有抑制血管緊張肽I-轉(zhuǎn)化酶活性，給自發(fā)性高血 壓大鼠(SHR) 口服ProRJ或多肽有抗高血壓作用。蜜蜂MRJPs的基因克隆及 其潛在功能研究越來(lái)越得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，已從西方蜜蜂中克隆出MRJP1、 MRJP2、 MRJP3s、 MRJP4、 MRJP5s、 MRJP6、 MRJP7、 MRJP8等多個(gè)基因的 cDNAs。
隨著西方蜜蜂MRJPs研究的深入，蜂王漿主蛋白(MRJPs)的醫(yī)療保健功能被 越來(lái)越多的試驗(yàn)結(jié)果所證實(shí)，最新研究認(rèn)為王漿主蛋白因具有多種生物醫(yī)藥保 健功能而重新命名為王漿活性蛋白(Apalbumins)，且對(duì)西方蜜蜂王漿活性蛋白 l(Apalbuminl，原為MRJP1)的全長(zhǎng)cDNA序列、4個(gè)亞克隆片段在大腸桿菌進(jìn) 行了表達(dá)，這5個(gè)表達(dá)產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)功能研究結(jié)果表明，全長(zhǎng)基因的表達(dá)產(chǎn) 物和四個(gè)亞克隆表達(dá)產(chǎn)物與空白細(xì)胞對(duì)照組相比均具有顯著的免疫調(diào)節(jié)效果， 證實(shí)了王漿活性蛋白l具有免疫調(diào)節(jié)功能，且發(fā)現(xiàn)5，-端的第一個(gè)亞克隆表達(dá)產(chǎn) 物的免疫調(diào)節(jié)功能比全長(zhǎng)基因的表達(dá)產(chǎn)物更強(qiáng)，這是一個(gè)十分令人振奮的研究結(jié)果，為王漿活性蛋白基因表達(dá)的生物醫(yī)藥開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化研究開拓新的研究領(lǐng) 域和方向。雖然東方、西方蜜蜂MRJPs家族的相當(dāng)多基因已被克隆，部分基因在大腸 桿菌中被表達(dá)，但對(duì)MRJPs各成員的確切的生物學(xué)功能尚未詮釋。MRJP1、 2、 3、 5是MRJPs基因家族的主要成員，己有研究表明MRJP1可能具有免疫調(diào)節(jié)、 促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)和抗菌功能，王漿蛋白的酶解產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生豐富的抗高血壓多肽。利用先進(jìn)的現(xiàn)代生物技術(shù)改造傳統(tǒng)的食品工業(yè)和制造業(yè)已成為新的發(fā)展趨 勢(shì)。從新的生物資源中發(fā)現(xiàn)、開發(fā)對(duì)人類健康和疾病防治有重要作用的新基因， 采用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，把這些重要基因克隆、轉(zhuǎn)移到其他經(jīng)濟(jì)生物中進(jìn)行表 達(dá)，從而達(dá)到利用這些新的基因資源為人類造福的目的。蜂王漿具有重要的醫(yī) 療保健功能，其王漿蛋白被證明具有酶解產(chǎn)生多種降血壓功能肽的作用，通過(guò) 構(gòu)建能酶解產(chǎn)生抗高血壓多肽的高效表達(dá)基因，進(jìn)而通過(guò)實(shí)現(xiàn)利用基因工程和 發(fā)酵工程制備降血壓功能肽，為高血壓疾病的預(yù)防和治療提供新的優(yōu)質(zhì)的醫(yī)藥 資源和保健食品源；另一方面也可以把這些功能基因轉(zhuǎn)移到食品工業(yè)微生物內(nèi)， 獲得具有降血壓功能的啤酒酵母或乳酸菌，在高科技食品工業(yè)上具有廣闊的應(yīng) 用前景，將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。但至今還未見利用基因工程方法 制備重組王漿蛋白酶解產(chǎn)生抗高血壓的相關(guān)報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種中華蜜蜂MRJP1表達(dá)產(chǎn)物酶解制備抗高血壓多肽 的方法。本發(fā)明的中華蜜蜂MRJP1表達(dá)產(chǎn)物酶解制備抗高血壓多肽的方法，步驟如下1) MRJP1基因的克隆a) 以中華蜜蜂8日齡工蜂頭部MRJP1 cDNA為模板，采用Primer Primier 5.0 軟件，設(shè)計(jì)上游弓1物F-Prime序列為5，-CCATGGACATGACAAGGTGGTTGTT-3 ，， 下游引物R-Prime序列為3，國(guó)TAAAGTTATGTAGACATTCGCCGGCG-5，，分別在 上游引物F-Prime序列與下游引物R-Prime序列中引入酶切位點(diǎn)7Vco I和A^I;b) PCR反應(yīng)體系共50fi1，組成如下5^1 10xPCRBuffer、 6^1 25mM MgCl2、 1 pi 10mM dNTP Mix、 2^1 10肖F腸Prime、 2^1 1 0|jM R-Prime、 5pl中華蜜蜂MRJP1 cDNA模板、0.75^il 5U4d Taq DNAPolymerase,力B ddH20至終體積為50^1;PCR反應(yīng)條件如下PCR反應(yīng)體系先在94*€預(yù)熱3min，然后94'C變性lmin、 54.6。C退火lmin、 72。C延伸lmin、 35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min， PCR產(chǎn)物電泳分析后經(jīng)UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收，克隆至TaKaRa公司的 pMD18-T載體，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，并測(cè)定其序列；
2) 重組Bacmid病毒的構(gòu)建
a) 將鑒定正確的pMD18-T-MRJPl質(zhì)粒經(jīng)Wco I和iV^ I酶切后與經(jīng)相同限 制性內(nèi)切酶酶切的pFastBacHTb表達(dá)載體在16°C的條件下連接過(guò)夜，將連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化入TG1感受態(tài)細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb-MRJPl ，經(jīng)PCR和雙酶 切鑒定正確后轉(zhuǎn)化入DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞；
b) 將上述DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞涂布于含lOOpg/ml X-gal、 40ng/ml IPTG、 50pg/ml卡那霉素、lOpg/ml四環(huán)素及7pg/ml慶大霉素的LB平板，挑取白色菌 落，以M13通用引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得含有中華蜜蜂MRJP1重組Bacmid
病毒；
c) PCR檢測(cè)反應(yīng)條件如下先94。C預(yù)熱3min，然后94。C變性lmin、 55°C 退火lmin、 72'C延伸4min、 35個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸7min;
3) 家蠶細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
a) 家蠶細(xì)胞BmN用含10%胎牛血清的HyQ SFX-INSECT昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基 在27t:條件下恒溫培養(yǎng)；然后接種于50ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至2xl0"瓶，離心去 除血清，備用；
b) 將194^1無(wú)血清培養(yǎng)基與6nl FUGENE 6轉(zhuǎn)染劑混勻，室溫靜置5min， 再加入4嗎重組BacmidDNA，混勻，室溫靜置45min;將該混合液逐滴加入細(xì) 胞培養(yǎng)瓶中，邊加邊搖，27。C溫育7h后，棄共轉(zhuǎn)染液，加入6ml含血清的完全 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，取上清液，10000rpm，離心2min，上清液于4。C避光 保存?zhèn)溆?；將所獲病毒上清液繼續(xù)感染細(xì)胞，擴(kuò)繁病毒，收集第三輪感染的病 毒上清液，用于注射家蠶幼蟲；
4) 中華蜜蜂MRJP1在家蠶幼蟲中的表達(dá)及純化
將重組病毒及對(duì)照物ddH20通過(guò)皮下注射導(dǎo)入家蠶五齡第一天幼蟲，5|xl/ 頭，感染96h后收集其血淋巴，經(jīng)超聲波破碎，8000rpm， 5min， 4'C離心后， 取上清液，用Ni-NTA親和柱純化，獲得中華蜜蜂MRJP1真核表達(dá)產(chǎn)物。
5) 中華蜜蜂MRJP1真核表達(dá)產(chǎn)物酶解制備抗高血壓多肽 將純化后中華蜜蜂MRJP1真核表達(dá)產(chǎn)物與胰蛋白酶于37 'C共同孵育6h，
100。C煮沸5min，使胰蛋白酶失活，經(jīng)超濾膜離心過(guò)濾，得到分子量在10kDa 以下的小肽混合物，用CaCb去除磷酸鹽，得到抗高血壓多肽混合物。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有的有益的效果是a) 采用中華蜜蜂MRJP1真核表達(dá)產(chǎn)物酶解制備的多肽具有抗高血壓功能。
b) 中華蜜蜂MRJP1在家蠶或酵母內(nèi)表達(dá)，直接食用全蠶粉或酵母，在起 到降血壓作用的同時(shí)，還具有服用方便和保健功能。


圖i是中華蜜蜂MRJP1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；箭頭 所指為目的片段；
圖2是重組Bacmid和未重組Bacmid的PCR檢測(cè)結(jié)果，M為DNA分子 量標(biāo)準(zhǔn)，1表示重組Bacmid的PCR產(chǎn)物；2表示未重組Bacmid的PCR產(chǎn)物；
圖3表示受重組病毒Bacmid-MRJP1轉(zhuǎn)染后家蠶細(xì)胞BmN的表型變化，其 中圖A為轉(zhuǎn)染Bacmid-MRJPl 120h后家蠶細(xì)胞，直徑增大，裂解并聚集成團(tuán)； 圖B為對(duì)照的正常家蠶細(xì)胞；
圖4是中華蜜蜂MRJP1表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果和利用His單抗進(jìn) 行的Western blotting印跡分析，圖中M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)66.4kDa代表牛 血清蛋白，44.3kDa代表卵清蛋白，29.0kDa代表碳酸苷酶，20.1kDa代表胰蛋 白酶抑制劑，14.3 kDa代表溶菌酶；泳道1為感染家蠶血淋巴上清液；泳道2 為對(duì)照；泳道3為王槳水溶物；泳道4為純化的中華蜜蜂MRJP1，泳道5為感 染家蠶血淋巴上清液純化產(chǎn)物的Western blotting分析；
圖5是中華蜜蜂MRJP1表達(dá)產(chǎn)物酶切后獲得的抗高血壓多肽質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。 實(shí)施例1
促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的中華蜜蜂MRJP1真核表達(dá)產(chǎn)物的制備方法，其特征是步驟 如下
1) MRJP1基因的克隆
a) 以中華蜜蜂8日齡工蜂頭部MRJP1 cDNA為模板，采用PrimerPrimier5.0 軟件， 設(shè)計(jì)上游引 物 F-Prime 序列 為 5，-CCATGGACATGACAAGGTGGTTGTT國(guó)3 ，， 下游引物R-Prime序列為 3,-TAAAGTTATGTAGACATTCGCCGGCG-5，，分別在上游引物F-Prime序列與 下游引物R-Prime序列中引入酶切位點(diǎn)Wcol和I，(見下劃線部分)；
b) PCR反應(yīng)體系共50^1，組成如下5^1 10x PCRBuffer、 6(il 25mMMgCl2、 1^1 10mM dNTP Mix、2pl 10pMF-Prime、2pl 10jiMR-Prime、5pl中華蜜蜂MRJP1cDNA模板、0.75[il 5U/(il Taq DNA Polymerase,力Q ddH20至終體積為50|il;PCR反應(yīng)條件如下PCR反應(yīng)體系先在94。C預(yù)熱3min，然后94。C變性lmin、 54.6t退火lmin、 72'C延伸lmin、 35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min， PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得大小為1300bp左右的特異性擴(kuò)增片段，見圖1， 與預(yù)期的目的片段大小相符。將目的片段割膠，經(jīng)UNIQ-10柱式DNA膠回收 試劑盒回收，割膠回收方法詳見上海生工說(shuō)明書。然后將回收獲得的目的基因 克隆至TaKaRa公司的pMD18-T載體，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，并送上海生工 測(cè)序。2) 重組Bacmid病毒的構(gòu)建a) 將鑒定正確的pMD18-T-MRJPl質(zhì)粒經(jīng)Wco I和M / I酶切后與經(jīng)相同限 制性內(nèi)切酶酶切的pFastBacHTb表達(dá)載體在16°C的條件下連接過(guò)夜，將連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化入TG1感受態(tài)細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb-MRJPl，經(jīng)PCR和雙酶 切鑒定正確后轉(zhuǎn)化入DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞；b) 將上述DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞涂布于含100jig/ml X-gal、 40pg/ml IPTG、 50嗎/ml卡那霉素、10ng/ml四環(huán)素及7pg/ml慶大霉素的LB平板培養(yǎng)48h后， 挑取白色菌落，以M13通用引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR檢測(cè)反應(yīng)條件如下先 94。C預(yù)熱3min，然后94。C變性lmin、 55。C退火lmin、 72。C延伸4min、 35個(gè)循 環(huán)，最后72。C延伸7min;獲得含有中華蜜蜂MRJP1重組Bacmid病毒。經(jīng)PCR 檢測(cè)，未發(fā)生重組的Bacmid經(jīng)PCR擴(kuò)增得到273bp大小的特異性片段；重組 后的Bacmid， PCR擴(kuò)增得到轉(zhuǎn)座子內(nèi)側(cè)片段2430bp加上克隆片段大小之和， 即2430bp+1302bp=3732bp，見圖2。 PCR結(jié)果與預(yù)期的片段大小一致，說(shuō)明 中華蜜蜂MRJP1基因已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)座到Bacmid中，重組病毒命名為 Bacmid-MRJP1。3) 家蠶細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染a) 家蠶細(xì)胞BmN用含10%胎牛血清的HyQ SFX-INSECT昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基 在27X:條件下恒溫培養(yǎng)；然后接種于50ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至2xl0V瓶，離心去 除血清，備用；b) 將194^1無(wú)血清培養(yǎng)基與6pl FUGENE 6轉(zhuǎn)染劑混勻，室溫靜置5min， 再加入4嗎重組BacmidDNA，混勻，室溫靜置45min;在轉(zhuǎn)染劑FuGENE 6的 介導(dǎo)下，將Bacmid-MRJP1轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞BmN，擴(kuò)增得到大量重組病毒。將該 混合液逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，邊加邊搖，27'C溫育7h后，棄共轉(zhuǎn)染液，加入 6ml含血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，細(xì)胞直徑增大，生長(zhǎng)停止，裂解并聚集成團(tuán)(見圖3)，取上清液，10000rpm，離心2min，上清液于4'C避光保存?zhèn)?用；將所獲病毒上清液繼續(xù)感染細(xì)胞，擴(kuò)繁病毒，收集第三輪感染的病毒上清 液，用于注射家蠶幼蟲。
4)中華蜜蜂MRJP1在家蠶幼蟲中的表達(dá)及純化
將重組病毒及對(duì)照物ddH20通過(guò)皮下注射導(dǎo)入家蠶五齡第一天幼蟲，5pl/ 頭，感染120h后，家蠶體色變黑，食欲下降，生長(zhǎng)延滯，在感染96h時(shí)，收集 其血淋巴，經(jīng)超聲波破碎，8000rpm， 5min， 4"C離心后，取上清液和沉淀物， 用M-NTA親和柱純化，獲得中華蜜蜂MRJP1真核表達(dá)產(chǎn)物。將感染家蠶血淋 巴上清液和沉淀的純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物主要在上 清液中，即主要以溶解狀態(tài)存在。圖4為感染家蠶血淋巴上清液、對(duì)照家蠶血 淋巴上清液(皮下注射ddH20)、 RJ水溶物、純化的rJccMRJPl的SDS-PAGE 分析和Western-blotting檢測(cè)結(jié)果。圖中可見一條約60kDa的明顯條帶，證明表 達(dá)、純化成功。
5)中華蜜蜂MRJP1真核表達(dá)產(chǎn)物酶解制備抗高血壓多肽 將10 mg純化后的中華蜜蜂MRJP1真核表達(dá)產(chǎn)物與100pg胰蛋白酶于37 。C共同孵育6h， 100 。C煮沸5min使胰蛋白酶失活(Kamakum"a/.，2001)，經(jīng) UltracelYM-10超濾膜(Millipore)離心過(guò)濾(13000 rpm， 30min， 4 °C)得到分 子量在10 kDa以下的小肽混合物，用CaCl2去除磷酸鹽后，即得到抗高血壓多 肽混合物。
將獲得的多肽混合物送中科院上海有機(jī)化學(xué)研究所分析測(cè)試中心進(jìn)行 LC-MS液質(zhì)聯(lián)用分析。采用Agilent LC/MSD SL液質(zhì)聯(lián)用儀。樣品經(jīng)DIKMA c-18 (4.6 x 250 mm， 5 jim)色譜柱分離，柱溫35 °C ，流速0.3 ml/min，進(jìn)樣量8 pl。流動(dòng)相為A相0.1%甲酸溶液，B相乙腈，梯度洗脫，色譜條件為0-60 min: B由15% 40%; 60-70 min: B由40% 80%。 DAD檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。 質(zhì)譜采用電噴霧離子化(ESI)方式，正離子檢測(cè)模式。重復(fù)實(shí)驗(yàn)一次，同時(shí)以 未酶解的重組蛋白中華蜜蜂MRJP1真核表達(dá)產(chǎn)物作對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶解液中存 在一個(gè)Matsui等人(Matsui ef a/., 2002)在西方蜜蜂全王漿水解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的降血 壓二肽Ile-Phe (IF, MW = 278 kDa，圖5)。 IF會(huì)阻礙血管緊縮素I-轉(zhuǎn)化酶(ACE) 的活性，進(jìn)而起到降血壓作用。這證明中華蜜蜂MRJP1的胰蛋白酶水解物含有 降血壓成分，通過(guò)其在酵母或家蠶中的表達(dá)，可為人類所食用(酵母或全蠶粉)， 經(jīng)消化液酶解后即可產(chǎn)生抗高血壓多肽，被人體吸收后達(dá)到治療目的，造福人 類健康。
權(quán)利要求
1.中華蜜蜂MRJP1表達(dá)產(chǎn)物酶解制備抗高血壓多肽的方法，其特征步驟如下1)MRJP1基因的克隆a)以中華蜜蜂8日齡工蜂頭部MRJP1 cDNA為模板，采用Primer Primier 5.0軟件，設(shè)計(jì)上游引物F-Prime序列為5’CCATGGACATGACAAGGTGGTTGTT-3’，下游引物R-Prime序列為3’-TAAAGTTATGTAGACATTCGCCGGCG-5’，分別在上游引物F-Prime序列與下游引物R-Prime序列中引入酶切位點(diǎn)Nco I和Not I；b)PCR反應(yīng)體系共50μl，組成如下5μl 10×PCR Buffer、6μl 25mM MgCl2、1μl 10mM dNTP Mix、2μl 10μM F-Prime、2μl 10μM R-Prime、5μl中華蜜蜂MRJP1cDNA模板、0.75μl 5U/μl Taq DNA Polymerase，加ddH2O至終體積為50μl；PCR反應(yīng)條件如下PCR反應(yīng)體系先在94℃預(yù)熱3min，然后94℃變性1min、54.6℃退火1min、72℃延伸1min、35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物電泳分析后經(jīng)UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收，克隆至TaKaRa公司的pMD18-T載體，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，并測(cè)定其序列；2)重組Bacmid病毒的構(gòu)建a)將鑒定正確的pMD18-T-MRJP1質(zhì)粒經(jīng)Nco I和Not I酶切后與經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶酶切的pFastBacHTb表達(dá)載體在16℃的條件下連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入TG1感受態(tài)細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb-MRJP1，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)化入DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞；b)將上述DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞涂布于含100μg/ml X-gal、40μg/ml IPTG、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四環(huán)素及7μg/ml慶大霉素的LB平板，挑取白色菌落，以M13通用引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得含有中華蜜蜂MRJP1重組Bacmid病毒；c)PCR檢測(cè)反應(yīng)條件如下先94℃預(yù)熱3min，然后94℃變性1min、55℃退火1min、72℃延伸4min、35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min；3)家蠶細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染a)家蠶細(xì)胞BmN用含10％胎牛血清的HyQ SFX-INSECT昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基在27℃條件下恒溫培養(yǎng)；然后接種于50ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至2×106/瓶，離心去除血清，備用；b)將194μl無(wú)血清培養(yǎng)基與6μl FUGENE 6轉(zhuǎn)染劑混勻，室溫靜置5min，再加入4μg重組Bacmid DNA，混勻，室溫靜置45min；將該混合液逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，邊加邊搖，27℃溫育7h后，棄共轉(zhuǎn)染液，加入6ml含血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，取上清液，10000rpm，離心2min，上清液于4℃避光保存?zhèn)溆茫粚⑺@病毒上清液繼續(xù)感染細(xì)胞，擴(kuò)繁病毒，收集第三輪感染的病毒上清液，用于注射家蠶幼蟲；4)中華蜜蜂MRJP1在家蠶幼蟲中的表達(dá)及純化將重組病毒及對(duì)照物ddH2O通過(guò)皮下注射導(dǎo)入家蠶五齡第一天幼蟲，5μl/頭，感染96h后收集其血淋巴，經(jīng)超聲波破碎，8000rpm，5min，4℃離心后，取上清液，用Ni-NTA親和柱純化，獲得中華蜜蜂MRJP1真核表達(dá)產(chǎn)物。5)中華蜜蜂MRJP1真核表達(dá)產(chǎn)物酶解制備抗高血壓多肽將純化后中華蜜蜂MRJP1真核表達(dá)產(chǎn)物與胰蛋白酶于37℃共同孵育6h，100℃煮沸5min，使胰蛋白酶失活，經(jīng)超濾膜離心過(guò)濾，得到分子量在10kDa以下的小肽混合物，用CaCl2去除磷酸鹽，得到抗高血壓多肽混合物。
全文摘要
本發(fā)明公開的中華蜜蜂MRJP1表達(dá)產(chǎn)物酶解制備抗高血壓多肽的方法，利用Bac-to-Bac/BmNPV桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建得到重組Bacmid-MRJP1并轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，獲得重組病毒后注射家蠶幼蟲，感染96h后收集血淋巴，經(jīng)親和柱純化后獲得了高純度重組MRJP1，將純化后中華蜜蜂MRJP1真核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)胰蛋白酶酶切，超濾膜離心過(guò)濾，用CaCl₂去除磷酸鹽，得到抗高血壓多肽混合物。本發(fā)明方法制得的多肽具有降血壓功能。
文檔編號(hào)C12N15/866GK101289663SQ200810061679
公開日2008年10月22日 申請(qǐng)日期2008年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者繆云根, 蘇松坤, 陳盛祿, 挺 陶 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)